Bài 2 - KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

BAỉI K THUT PCR (Polymerase Chain Reaction) Phng phỏp PCR l phng phỏp khuch i nhanh nhiu bn ca cỏc on DNA m khụng cn phi qua to dũng Phng phỏp ny c K.Mullis a nm 1985 v Saiki hon thin nm 1988 I NGUYấN TC CA PHNG PHP PCR l phn ng nhõn bn trỡnh t DNA quan tõm ng nghim Phng phỏp ny c thc hin invitro vi s hin din ca enzyme DNA-polymerase S khuch i c thc hin nh cỏc chu trỡnh nhit c lp li PCR II CC THNH PHN CN THIT THC HIN PHN NG Sợi khuôn (DNA cDNA) Các mồi (Oligonucleotide primers) DNA polymerase chịu nhiệt (Taq) dNTPs Dung dịch đệm Ion Mg++ III TIN HNH PHN NG Biến tính ADN: 94-95oC, 30-60 giây Bắt cặp mồi vào sợi khuôn: 45-60oC, 30-60 giây Phản ứng kéo dài chuỗi: 72oC, 60 giây/1kb bước hình thành chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành khoảng 25-40 chu kỳ Trong kỹ thuật PCR thông thường người ta thực bước biến tính ADN trước bước vào chu kỳ Bước thư ờng thực 94-95oC, 2-3 phút Phản ứng PCR - bước bắt cặp mồi vào sợi khuôn 3 45 - 60C 3 Phản ứng PCR - bước kéo dài chuỗi 3 72C 5 5 Phản ứng PCR - sản phẩm hình thành sau bước Biến tính Bắt cặp & kéo dài chuỗi 5 5 5 5 Sản phẩm cuối phản ứng PCR IV LI CH CA PHN NG PCR Thi gian thc hin rt nhanh Ch cn khong gi khuch i trỡnh t DNA vi phng phỏp to dũng ta mt khong tun; n gin v ớt tn kộm; tinh sch ca mu khụng cn cao; V CC NG DNG CA K THUT PCR Nhõn phõn t RNA bng k thut PCR Cn cú cỏc on mi kt hp c vi khuụn RNA, sau ú tng hp cỏc phõn t DNA nh enzyme reverse trancriptase theo k thut PCR Enzyme Tth DNA-polymerase cú th thc hin c phn ng chộp ngc v phn ng tng s lng Quỏ trỡnh ny cn cú ion mangan 2 K thut RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) K thut RAPD c thc hin theo cỏc bc sau: Tỏch chit DNA tng s, nhõn DNA bng mỏy PCR; in di trờn gel; Xỏc nh tớnh a dng di truyn bng cỏc phn mm thụng dng Cỏc s liu thu c cho thy s gn gi hoc cỏch bit di truyn ca cỏc mu nghiờn cu VI CC HN CH CA PHNG PHP PCR Kớch thc ca trỡnh t cn khuch i Tr vi trng hp rt cỏ bit, phng phỏp PCR khụng hot ng c vi nhng on DNA ln hn 3kb Vic s dng PCR i vi cỏc di di 1,5 kb cho kt qu tt 2 S ngoi nhim Cỏc sai sút gõy Taq polymerase S chộp bi Taq polymerase cho t l sai khỏ cao (10-4) [...]... ỨNG PCR    Thời gian thực hiện rất nhanh Chỉ cần khoảng 3 giờ để khuếch đại trình tự DNA trong khi với phương pháp tạo dòng ta mất khoảng 1 tuần; Đơn giản và ít tốn kém; Độ tinh sạch của mẫu không cần cao; V CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR 1 Nhân phân tử RNA bằng kỹ thuật PCR  Cần có các đoạn mồi kết hợp được với khuôn RNA, sau đó tổng hợp các phân tử DNA nhờ enzyme reverse trancriptase theo kỹ thuật. .. phân tử DNA nhờ enzyme reverse trancriptase theo kỹ thuật PCR  Enzyme Tth DNA-polymerase có thể thực hiện cả phản ứng sao chép ngược và phản ứng tăng số lượng Quá trình này cần có ion mangan 2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)  Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các bước sau: – – – Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; Điện di trên gel; Xác định tính đa dạng di truyền bằng... nghiên cứu VI CÁC HẠN CHẾ CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1 Kích thước của trình tự cần khuếch đại Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt 2 Sự ngoại nhiễm 3 Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (1 0-4 ) ... 9 4-9 5oC, 3 0-6 0 giây Bắt cặp mồi vào sợi khuôn: 4 5-6 0oC, 3 0-6 0 giây Phản ứng kéo dài chuỗi: 72oC, 60 giây/1kb bước hình thành chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành khoảng 25 -4 0 chu kỳ Trong kỹ thuật PCR. .. vào chu kỳ Bước thư ờng thực 9 4-9 5oC, 2- 3 phút Phản ứng PCR - bước bắt cặp mồi vào sợi khuôn 3 45 - 60C 3 Phản ứng PCR - bước kéo dài chuỗi 3 72C 5 5 Phản ứng PCR - sản phẩm hình thành sau bước... DNG CA K THUT PCR Nhõn phõn t RNA bng k thut PCR Cn cú cỏc on mi kt hp c vi khuụn RNA, sau ú tng hp cỏc phõn t DNA nh enzyme reverse trancriptase theo k thut PCR Enzyme Tth DNA-polymerase cú