VIII. CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR:
2. Phát hiện sự đề kháng kháng sinh:
Phát hiện sự đề kháng kháng sinh ở vi sinh vật nhằm đánh giá, kiểm sốt tình hình đề kháng đối với các kháng sinh sau thời gian sử dụng, đồng thời gĩp phần trong việc sử dụng kháng sinh an toàn, hiệu quả. Để thực hiện điều này phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau, hiện nay các phương pháp thơng thường gồm cĩ các bước sau:
(1) Phân lập tác nhân gây bệnh,
(2) Thử nghiệm tính nhạy cảm của tác nhân với các kháng sinh khác nhau. Trong bước này lại cĩ thể sử dụng:
(ii) Pha lỗng trên mơi trường lỏng hay rắn,
(iii) Thử nghiệm phát hiện các enzym bất hoạt kháng sinh. Tuy nhiên, đây chỉ là phát hiện về kiểu hình của sự đề kháng (phenotypic drug resistance). Các kỹ thuật về sinh học phân tử cho phép khảo sát kiểu gien của sự đề kháng kháng sinh. Các kháng sinh và các gien chịu trách nhiệm về sự đề kháng kháng sinh cĩ thể phát hiện bởi kỹ thuật Sinh học Phân tử được trình bày trong bảng 4. Ví dụ: để phát hiện các S.aureus kháng methicillin (MRSA), nguyên nhân là các chủng này đã sản sinh các penicillin-binding protein mới được gọi là PBP 2' hay PBP 2a cĩ ái lực thấp đối với các -Lactams. Để phát hiện gien mecA (gien liên quan),
dùng các mồi RSM-2647 và RSM-2648, sản phẩm PCR phát hiện cĩ kích thước 533 bp.
Ngồi ra việc phát hiện gien đề kháng trên các vi khuẩn mọc chậm đặc biệt giúp ích cho việc chọn kháng sinh nhạy cảm để trị liệu ngay từ đầu. Ví dụ để phát hiện
M.tuberculosis hay M.leprae kháng rifampicin, giúp bác sĩ điều trị cĩ thể sử dụng
phác đồ điều trị đúng cho bệnh nhân, theo phương pháp cổ điển phải mất 4-6 tuần, trong khi phương pháp PCR chỉ mất một ngày. Sản phẩm PCR cĩ kích thước khoảng 411 bp với đoạn mồi TBrpo 1 và TBrpo 2 trên M.tuberculosis hoặc 710 bp với đoạn mồi MLrpo22 và MLrpo23trên M.leprae.
Một ví dụ khác trên virus HIV, sau thời gian trị liệu từ 3-12 tháng với AZT người ta đã thấy cĩ sự đề kháng. Hiện nay đã tìm ra 4 đột biến Asp-67 Asn; Lys-70
Arg; Thr-215 Phe/Tyr và Lys-219 Gln cĩ liên quan. Nếu cả 4 đột biến hiện diện ở chủng virus thì khả năng phát hiện đột biến tăng hơn 100 lần.
Kháng sinh Điểm tác động Vi trí của yếu
tố đề kháng
Gien đích đã biết
Aminoglycosides Quá trình dịch mã P, C, Tn ant, aph, aac
Glycopeptides Tổng hợp vách tế bào P vanA, vanB, vanC
Chloramphenicol Dịch mã (50S ribosome) P, Tn erm, erc, mrs
Tetracycline Dịch mã (ngăn aminoacyl- tRNA kết với ribosome
P, C, Tn tet
Macrolides Dịch mã (50S ribosome) P, C, Tn erm, erc, mrs
Sulfonamides Tổng hợp axit folic P, C sul I, mil II
Trimethoprim Tổng hợp axit folic P, C, Tn dlfr
Quinolones Nhân đơi (ADN gyrase) C gyrA, gyrB
Rifampicin Phiên mã (ARN
polymerase)
C rpoB
-Lactams Tổng hợp vách tế bào và phân chia
P, C, Tn mec, tem, các gien - Lactamase khác Ghi chú: viết tắt vị trí tác động C = chromosome, P = plasmid, Tn = Transposon
Bảng 4.Đích dùng để phát hiện sự đề kháng kháng sinh