PCR (polymerase chain reaction

 Chương II PCR (polymerase chain reaction) Taq polymerase Làm để phân lập gen Các bước PCR Nguyên tắc máy PCR phản ứng PCR I Giới thiệu Kary Mullis 1985 Nobel 1993 Giới thiệu  PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp   Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ xác cao, khơng cần diện tế bào Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại đoạn DNA nằm mồi chuyên biệt, nhờ men DNA polymerase Ngun tắc • Dựa hoạt động emzyme • Sự diện mồi chuyên biệt • Khả nối dài mồi taq polymerase • Các nu tự mơi trường Máy PCR Thực nghiệm  Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ chu kỳ gồm bước  Bước 1: Biến tính (denaturation)    Bước 2: Gắn mồi (anneealing)    94-98oC 2-5 phút 30-65oC 20s-2’ Bước 3: kéo dài (extending)   68-72oC 20s-5’ Thực nghiệm http://users.ugent.be/~avierstr/pdf/PCR.pdf III THỰC NGHIỆM http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html III THỰC NGHIỆM http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html p dụng PCR Tạo dòng DNA Tìm hiểu mức biểu gen (Reverse Transcription PCR) Chẩn đoán bệnh (của người, súc vật, cối) Phát đột biến Kiểm tra chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm nước…) Phát khác biệt gen (Đa dạng gen): TĨM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT PHẢN ỨNG PCR Thiết kế mồi Chuẩn bị mẫu DNA Pha mix với thành phần theo thứ tự sau:        H2O tiệt trùng Buffer dNTP tổng số mồi xuôi mồi ngược taq polymerase DNA mẫu Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp Kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose với có mặt thang chuẩn Phân tích kết RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kích thước gen vài sinh vật (pb)   Escherichia coli : Saccharomyces cerevisiae : Drosophila melanogaster : Caenorhabditis elegans : Homo sapiens : Arabidopsis thaliana : Oryza sativa Phaseolus vulgaris (đậu) : Triticum vulgare (lúa mì) Tulipa x 106 1,4 x 107 1,6 x 108 108 3,4 x 109 108 4,3 x 108 x 109 x 109 3,5 x 1010 Caenorhabditis elegans Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Tulipa Giới thiệu Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật phát vào năm 1990 (Welsh McClelland; William ctv.) Dùng nghiên cứu khác biệt di truyền loài khác Kỹ thuật RAPD dựa kỹ thuật PCR, cách sử dụng primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp nhân ngẫu nhiên đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự primer Primer RAPD Là đoạn ngắn oligonucleotide đơn (10mer) tổng hợp cách ngẫu nhiên  Để tìm khác biệt loài người ta thường sử dụng số lượng lớn mồi ngẫu nhiên  Trên thị trường có nhiều mồi ngẫu nhiên tổng hợp nhân tạo  Nguyên tắc    Dùng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi sợi oligonucleotide đơn gồm 10 mer có trình tự xếp ngẫu nhiên SV lồi có kiểu gen hồn tồn giống nhau, khuyếch đại đoạn DNA có kích thước giống sử dụng mồi ngẫu nhiên để chạy PCR SV khác nhiều kiểu gen _ đa dạng sinh hoc, với số mồi ngẫu nhiên đoạn DNA khuyếch đại có kích thước khác Ứng dụng Nghiên cứu đa dạng di truyền  Phát liên kết gen với tính trạng  Thiết lập đồ di truyền  Phát đột biến  Ưu điểm     Dễ thực dễ thành công không cần biết trước trình tự gene đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao Thời gian thực nhanh Khả nhân cao Chi phí thực thấp sử dụng kết hợp với kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử có độ tin cậy cao Hạn chế Kỹ thuật RAPD có độ xác khơng cao, không ổn định  Khả nhân phản ứng PCR cao khả xuất đa hình thấp độ tin cậy khơng cao  Khả nhận diện thị phân tử thấp có độ tin cậy không cao  Secuencia N° de bandas Partidor nucleotídica (5’-3’) totales OPA-13 CAGCACCCAC 19 OPB-04 GGACTGGAGT 26 OPB-07 GGTGACGCAG 21 OPB-12 CCTTGACGCA 21 OPB-17 AGGGAACGAG 20 OPF-04 GGTGATCAGG 21 OPF-06 GGGAATTCGG 12 OPF-08 GGGATATCGG 12 OPF-09 CCAAGCTTCC 19 OPF-12 ACGGTACCAG 10 OPF-18 TTCCCGGGTT 13 OPF-14 TGCTGCAGGT 19 OPI-04 CCGCCTAGTC 14 OPI-07 CAGCGACAAG 29 OPI-10 ACAACGCGAG 28 OPI-13 CTGGGGCTGA 17 OPI-14 TGACGGCGGT 22 OPI-20 AAAGTGCGGG 21 Sản phẩm điện di RAPD Hãy thiết kế mồi để khuyếch đại đoạn DNA sau, tính Tm mồi?  5’aagcgtattgatgttcagaataatgaaaccactaattcaagagtattgtgtgtatgccttgttatttc ttcatgatccaagggtttctcgcgtcaacagtatgttctgagctttttgttgttgtcatatctacttattca tgtttggaatgaaatgtcaattgtctcatcttcctaaagtgtatacaagtttttgttctacaatagaact ctacaacagctgaatataatgataaaaatagatattttcttggctctttttttcattttacttttcttgactt ctcatatggaaccacctccagcaacaaacggacctgttattgcaggttactttgctaattggtaacat tgcataacaaaggcaaaaggggagcttaactcaactaactagaatgtaataggggaatctacgat agaaaatacaatgttgttgatgtagctactcaagccaataagttgactcatattttatatgcatttgct aatgtccaaccggatggtcaagttgttcttggggtagtataaattattgcaagatatagaatataata ataataattataaatataggacgcttatgcagatattgaaaagcattttccagcaagtaaaaaaata ataataaacaaatataaaacctctccctaattcatacataatatgtagaccaagcagtcaaccgaa aagaagatggatggaatgatccaggcaagaacctttacggtaactttaagcagttctatttactcaa gcaacaacaccgtcatctcaaagtgtcgcttagcattggcggatatacatggtccactcattttggcc cggttgcgcgtgatcctcagaaacgcagattgtttgtagatagcagcatcaaacacctagccaactt gggtctggacgggctagatattgactgggagtaccccaaagatgatgaggaagcgttttattatgt gcatctgctctatgagttgcgactggcgcttgacagatatcaacaacagtgccaacaactgattcag tcgcgactattactcacagtagccgtgccttgtggccctgaccattatcgtaaattgagattgaccga aatgcaaccttacgtggacctattttacctcatggcatacgactatgctggttcatgggattctttcgc agatcatcaagcggctgtttatggtggcagattgaatacagaacaagcagtacagcactatatcgc ctgtggtatccctccatataagctagtcgtaggcatgcctttatatggtcgaggattctgcaatacgg cggggccaggtcatcctttccaaggactgcctcgcggtacctgggaagagggtcaatttaattaca agacattgccaaaaccgggcgctgtagaataccacgactttaatcgactagcctcatggtcttatga ccctcaggctcgtgaatttatcacctatgatactacgagatacattaacgt 3’ kết     Mồi xuôi: 5’ AAG CGT ATT GAT GTT CAG 3’ Mồi ngược: 5’ ACG TTA ATG TAT CTC GTA 3’ Tm (mồi xuôi) = 4x + x 11 = 50 Tm (mồi ngược) = 4x + x 12 = 48 ...Taq polymerase Làm để phân lập gen Các bước PCR Nguyên tắc máy PCR phản ứng PCR I Giới thiệu Kary Mullis 1985 Nobel 1993 Giới thiệu  PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp   Là kỹ thuật tổng... http://users.ugent.be/~avierstr/pdf /PCR. pdf III THỰC NGHIỆM http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html III THỰC NGHIỆM http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html Mồi (primers)... phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh yếu tố khác Chất khác    Đối với DNA template lớn, giàu GC sử dụng chất biến tính DMSO, formamide, glycerol, and betaine thành phần PCR Tăng lượng DMSO PCR cần