Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REALTIME PCR

Bệnh giả dại hay còn gọi là bệnh Aujeszky (Aujeszky’s disease) do virus thuộc nhóm herpes gây ra, tấn công vào hệ thần kinh trung ương và các cơ quan khác như hệ hô hấp, sinh sản của heo. Heo là ký chủ tự nhiên chủ yếu nhưng virus cũng có thể lây nhiễm cho chó, mèo và trâu bò gây ra các triệu chứng thần kinh trầm trọng và chết. Virus bệnh giả dại có thể ẩn náu lặng lẽ lâu dài bên trong tế bào thần kinh của heo và từng lúc kích hoạt gây bệnh cho heo.

1 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REAL- TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phương Thảo Mã số sinh viên: 06126139 Lớp: DH06SH 2 Mục lục Mục lục • I. Đặt vấn đề • II. Nội dung – 1. Bệnh Aujeszky – 2. Phát hiện và định lượng DNA của PrV – 2.1. Vật liệu – 2.2. Nested PCR phát hiện DNA PrV – 2.3. Real-time PCR định lượng DNA PrV – 2.4. Kết quả • III. Kết luận 3 I. Đặt vấn đề I. Đặt vấn đề • Bệnh Aujeszky ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo. • Một số trường hợp ELISA dễ bỏ sót và phân biệt sai. • Cấy chuyển và tiêm truyền (explantation and cocultivation) tốn nhiều thời gian và độ nhạy không cao. 4 I. Đặt vấn đề I. Đặt vấn đề • Nested PCR và real-time PCR đã xác định tần số thực tế và số lượng của sự lây nhiễm PrV nâng cao cả độ nhạy và độ chính xác (McFarlane và ctv, 1986; Lokensgard và ctv, 1991).  Áp dụng 2 kỹ thuật này trong việc phát hiện virus PrV tiềm ẩn trong heo ở Việt Nam. 5 II. Nội dung II. Nội dung • 1. Bệnh Aujeszky • Aujeszky là một DNA virus. • Họ Herpesviridase Suid Herpesvirus I (SHV I). • Kích thước 180 nm. Hình 2.1. Diagram showing the virion structure, its different proteins (with the new nomenclature) and the DNA of the AD virus. (nguồn:www.sanidadanimal.info/ ./images/9virus.gif ) 6 Bệnh Aujeszky Bệnh Aujeszky • 162 capsomeres, có vỏ bọc. • ở heo, loài gặm nhấm và nhiều loài động vật khác. • Không thấy bệnh lây trên người. Hình 2.2 Structure of the DNA of the Aujeszky´s virus.The genes of the proteins gE and gI are located in the Us fragment. www.sanidadanimal.info/ ./images/9virus.gif 7 Hình 2.3. Dead pigs (and a cat), a result of pseudorabies www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky Hình 2.4. Lesions on nose of piglet www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky 8 2. Phát hiện và định lượng DNA của PrV 2. Phát hiện và định lượng DNA của PrV 2.1. Vật liệu 2.1. Vật liệu • Tinh sạch DNA bộ gene PrV • Tinh sạch DNA bộ gene từ mô thần kinh 9 2.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV 2.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV • Thành phần phản ứng (25 µl): – 10 µl (500 ng) của DNA bộ gene – 2.5 µM của mỗi primer – 1.5 mM MgCl 2 – 0.05 U Taq Polymerase (Promega, USA) – 0.2 mM dNTP – 1X buffer • Khuếch đại với máy Perkin-Elmer GenAmp PCR system 9600 (Perkin-Elmer, USA) 10 2.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV 2.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV • Giai đoạn 1: • 1 Chu kì 95 o C trong 10 phút. • 30 chu kì: – Biến tính (94 o C, 45 giây) – Bắt cặp (62 o C, 1 phút) – Kéo dài (72 o C, 1 phút). • Chu kì cuối cùng 10 phút ở 72 o C. . BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REAL- TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn:. Điện di trên gel 1.85% agarose. 2.2. Phản ứng nested PCR phát hiện DNA PrV 2.2. Phản ứng nested PCR phát hiện DNA PrV 14 2.3. Real-time PCR định lượng DNA