báo cáo khoa học xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật pcr

XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH Ở HEO BẰNG KỸ THUẬT PCR Nguyễn thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Bộ môn Vi Sinh - Sinh Học Phân Tử, Huỳnh thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc Bộ môn Động Vật - Sinh Lý Động Vật, Khoa Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Tp HCM. Sự xác định giới tính ở động vật có vú phụ thuộc vào sự hiện diện của gen sry, quy định giới tính đực. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể giới tính Y và là gen chủ đạo khởi động quá trình biệt hoá cá thể dẫn đến sự hình thành tinh hoàn ở con đực. Gen này không có tương đồng trên nhiễm sắc thể X. Ngoài ra, một số gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là ZFY và tương đồng là ZFX, cũng được sử dụng làm nhân tố chỉ thị giới tính. Heo là một mô hình được ưa chuộng cho các nghiên cứu về sự hình thành giới tính ở vật nuôi vì ở heo có hiện tượng lưỡng tính tự nhiên. Việc xác định giới tính trên heo còn có ý nghĩa trong quản lý nguồn vật nuôi và trong kỹ nghệ nhân giống. Cho đến nay, các thử nghiệm nhằm xác định giới tính ở heo chủ yếu dựa trên : flow cytometry nhằm chọn lọc tinh trùng mang nhiễm sắc thể X hoặc Y dùng cho thụ tinh nhân tạo, huỳnh quang miễn dịch nhằm phát hiện kháng nguyên HY trên phôi đực. Các kỹ thuật trên cho hiệu quả không cao. Những năm gần đây, nhiều kỹ thuật xác định giới tính được tiến hành thành công trên bò, dê và heo chủ yếu dựa trên sự nhân bản những trình tự đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản hai trình tự trên gen sry và ZFY/X. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP Vật liệu: các mẫu mô từ heo được thu nhận từ lò mổ Vissan, gồm mẫu mô gan, máu, buồng trứng; riêng tinh trùng được thu nhận từ một cơ sở sản xuất giống tại thành phố Hồ Chí Minh. Tiền xử lý mẫu: trước khi tiến hành tách chiết ADN, các mẫu được xử lý như sau : (1) 20 ml máu chống đông được ly tâm trong 15 phút ở 1300g để thu phân đoạn bạch cầu, (2) tế bào trứng được tách từ buồng trứng, (3) gan được nghiền trong dung dịch sinh lý để tạo dịch đồng nhất. Phương pháp tách chiết ADN (Boom & cs, 1990) : 100 l mẫu (dịch bạch cầu, tế bào trứng, tinh trùng, dịch đồng nhất gan) được ủ với 900 l dung dịch ly giải (guanidinium thiocyanate 4M, EDTA pH8 0,2M, Triton X100) và 30 l silica (Sigma) trong 15 phút. Sau đó, silica với các nucleic acid hấp phụ trên bề mặt được rửa nhiều lần để loại tạp chất. Cuối cùng là quá trình giải hấp phụ và thu nhận dịch nucleic acid tinh sạch (30 l). Phương pháp PCR : được tiến hành trong 25 l có chứa 1 l ADN tinh sạch, dNTP 0.2mM, mồi xuôi và mồi ngược 0.5uM mỗi loại và Taq polymerase 0.5 đơn vị. Chương trình PCR bao gồm 95 o C-6 phút, 30 chu kỳ với 94 o C-1 phút, 54 o C-1 phút, 72 o C-1 phút, cuối cùng là 72 o C-10 phút. Trình tự hai cặp mồi sử dụng và kích thước sản phẩm PCR được trình bày trong bảng sau : Các sản phẩm PCR sau đó được phân tích trên gel agarose 1,5%. Cặp mồi P1-5EZ và P2-3EZ sẽ cho một vạch có kích thước 447 bp trên con đực và 445 bp trên con cái, hai vạch này không phân biệt được trên gel agarose. Cặp mồi P1 và P3Y chỉ cho phép nhân bản một trình tự 166 bp ở con đực, ở con cái không có vạch này. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hiệu quả tách chiết ADN từ các loại mô khác nhau: Kết quả điện di trên gel agarose (hình) các sản phẩm tách chiết cho thấy ADN tách chiết từ bạch cầu có chất lượng tốt nhất thể hiện qua vạch có trọng lượng phân tử cao. ADN tách chiết từ gan bị phân hủy nhiều có lẽ do hàm lượng enzyme nội bào cao. ADN tách chiết từ trứng và tinh trùng có hàm lượng thấp nhất nhưng chất lượng đủ để làm nguyên liệu cho phản ứng PCR. Điều này có ý nghĩa cho việc ứng dụng vào công tác nhân giống. Nhìn chung, ADN tách từ các mô đã nêu đều có thể dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR. Hình 1. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% dịch ADN tách chiết từ các loại mô 1. ADN tinh trùng 2. ADN trứng 3. ADN gan 4. ADN bạch cầu 5. HindIII Hiệu quả nhân bản và tính đặc hiệu của các mồi sử dụng Khi sử dụng cặp mồi P1 - P3Y, kết quả phản ứng PCR cho thấy sự hiện diện của một vạch có kích thước như mong đợi (166 bp) ở mẫu ADN tách chiết từ con đực mà không thấy ở mẫu tách chiết từ con cái (hình 2). Hình 2. Hiệu quả nhân bản và tính đặc hiệu của mồi sử dụng 1: sản phẩm PCR với cặp mồi P1-5EZ &P2-3EZ trên mẫu heo cái 2: sản phẩm PCR với cặp mồi P1-5EZ &P2-3EZ trên mẫu heo đực 3: sản phẩm PCR với cặp mồi P1 & P3Y trên mẫu heo cái 4: sản phẩm PCR với cặp mồi P1 & P3Y trên mẫu heo đực 5: sản phẩm PCR multiplex với hai cặp mồi P1-5EZ &P2- 3EZ và P1 & P3Y trên mẫu heo cái. 6: sản phẩm PCR multiplex với hai cặp mồi P1-5EZ &P2- 3EZ và P1 & P3Y trên mẫu heo đực. 7: thang X174HaeIII Cặp mồi P1-5EZ và P2-3EZ cho kết quả dương tính ở cả đực và cái trên heo với vạch có kích thứơc như dự kiến (445, 447 bp). Vì cặp mồi này được thiết kế để nhân bản một trình tự bảo tồn của gen ZFX ở con cái và ZFY ở con đực của các loài khác nhau (1) nên trong nghiên cứu này, chúng được dùng như một chỉ thị về hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR. Tín hiệu dương tính với cặp mồi này cho phép khẳng định rằng phản ứng PCR đã hoạt động tốt. Khi tiến hành phản ứng PCR multiplex sử dụng cả hai cặp mồi đã nêu trên heo đực và cái, chúng tôi thấy rằng các tín hiệu dương tính nhận được rõ và phù hợp với giới tính của mẫu sử dụng (hình 3). ở các mẫu lấy từ con cái chỉ có sự hiện diện của vạch 445 bp, đây là một đảm bảo cho hiệu quả nhân bản ; còn các mẫu lấy từ con đực cho cả hai vạch 447 bp và 166 bp. Việc xác định giới tính tiến hành trên 5 con đực và 5 con cái lấy ngẫu nhiên đều cho kết quả tương tự. Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng các mồi giới tính ở con đực và con cái 1-5: Sản phẩm PCR với cặp mồi P1-5EZ và P2-3EZ trên các mẫu heo đực. 6: Thang X174HaeIII 7-11: Sản phẩm PCR với cặp mồi P1-5EZ và P2-3EZ trên các mẫu heo cái. KẾT LUẬN 1. ADN tách chiết theo phương pháp Boom từ các mô khác nhau đều có thể sử dụng cho phản ứng PCR. 2. Cặp mồi P1-5EZ/P2-3EZ và cặp mồi P1/P3Y sử dụng riêng lẻ hay chung trong một phản ứng đều cho tín hiệu dương tính rõ. 3. Hai cặp mồi P1-5EZ/P2-3EZ và P1/P3Y sử dụng trong phản ứng PCR multiplex cho phép đồng thời khẳng định hiệu quả nhân bản và xác định giới tính của mẫu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aasen, E. & Medrano, J.F. 1990. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology, 8:1279-1281. 2. Pailhoux, E., Pelliniemi, L., Barbosa, A., Parma, P., Kuopio & Cotinot, C. 1997. Relevance of intersexuality to breeding and reproductive biotechnology programs, XX sex reversal in pigs. Theriogenology, 47:93-102. 3. Sathasivam, K., Kageyama, S., Chikuni, K., Notarianni, E. 1995. Sex determination in the domestic pig by ADN amplification using the HMG-box sequence. Animal Reproduction Science, 38:321-326. SUMMARY Sex determination in pig by dna amplification In vitro fertilization programs in animal husbandry, especially for cattle, are in the first phase of development in Viet Nam. These programs required the establishment of many methods including sex determination of embryos for further implantation. We set up a PCR-based protocol for sex determination in domestic pigs as models for further applications. Genomic DNA was extracted from hepatocytes, leucocytes, oocytes and spermatozoa by the Boom method. Leucocytes gave the best quality DNA. P1/P3Y primer pair (Pailhoux & cs, 1997) was used in the amplification reaction to distinguish male from female. DNA from male samples gave a band of 166 bp, absent from female samples. The primer pair P1-5EZ/P2-3EZ (Aasen & cs, 1990) gave a [...]... dùng để kiểm tra hiệu quả nhân bản Kết quả áp dụng quy trình trên 05 cá thể đực và 05 cá thể cái cho thấy quy trình có thể sử dụng cho việc xác định giới tính ở heo cũng như có thể được triển khai ứng dụng cho công tác nhân giống vật nuôi Người thẩm định nội dung khoa học: Lê Đình Lương ... TẮT Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA từ gan, bạch cầu, trứng và tinh trùng heo bằng phương pháp Boom và nhân bản bằng PCR Kết quả tốt nhất được ghi nhận với DNA tách từ bạch cầu Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi cho phản ứng PCR Cặp P1/P3Y cho phép phân biệt cá thể đực và cái, chỉ ở cá thể đực mới xuất hiện một vạch sản phẩm PCR có kích thước 166 bp Cặp mồi P1-5EZ/P2-3EZ được dùng để kiểm tra hiệu quả...band of 445 bp (for female) and 447 bp (for male), indistinguished by agarose gel electrophoresis These primers were used as a control of the PCR reaction efficiency Using these two primer pairs, multiplex PCR performed in five males gave two amplicons and in female samples gave one amplicon with expected sizes These results showed that the protocol is suitable for sex determination . Động Vật, Khoa Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Tp HCM. Sự xác định giới tính ở động vật có vú phụ thuộc vào sự hiện diện của gen sry, quy định giới tính đực XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH Ở HEO BẰNG KỸ THUẬT PCR Nguyễn thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Bộ môn Vi Sinh - Sinh Học Phân Tử, Huỳnh thị Lệ Duyên,. vì ở heo có hiện tượng lưỡng tính tự nhiên. Việc xác định giới tính trên heo còn có ý nghĩa trong quản lý nguồn vật nuôi và trong kỹ nghệ nhân giống. Cho đến nay, các thử nghiệm nhằm xác định