Bài tiểu luận phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

Bễ CễNG THNG TRNG I HC CễNG NGHIP THC PHM THNH PH H CH MINH KHOA CễNG NGH THC PHM Mụn : Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm Ti: Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches (Phỏt Hin V m Coliforms Trong Nc Ung: Cỏc Phng Phỏp Hin Thi V Phng Phỏp Tip Cn Ni Bc) GVGD: Phan Th Kim Liờn TP.HCM,THNG 11-2014 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm MC LC MC LC .3 TểM TT Gii Thiu 1.1 Coliforms l gỡ? Mc Tiờu Phng Phỏp C in 10 3.1 K thut lờn men nhiu ng 10 3.2 K thut mng lc 11 Phng Phỏp Enzyme 14 4.1 Nguyờn tc chung 14 4.2 K thut cú/ khụng cú s hin din ca vi khun v m bng cỏc k thut nhiu ng s dng phng phỏp enzyme 16 4.3 MF k thut liờn hp vi phỏt hin enzyme ca vi khun 19 4.4 Xỏc nh trc tip hot tớnh ca enzyme bng fluorimetry 20 4.5 Phỏt hin vi khun bng phng phỏp s dng enzyme m t bo pha rn 21 4.6 Kt lun v phng phỏp enzyme 22 Phng Phỏp Phõn T 22 5.1 Phng phỏp dch 22 5.2 Phng phỏp da trờn axit nucleic 27 Kt Lun 38 LI CM N .41 GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm TểM TT Nhúm coliform c s dng rng rói nh mt ch tiờu ca cht lng nc v v phng din lch s ó dn n khỏi nim bo v sc khe cng ng Mc ớch ca vic xem xột ny l kim tra phng phỏp hin ang c s dng hoc cú th c xut cho vic kim tra nh lng coliforms nc ung Trờn thc t, nhu cu v cỏc th nghim nhanh hn, nhy hn v c th hn l iu cn thit ngnh cụng nghip nc Cỏc k thut thụng thng v c tha nhn rng rói, ó c tho lun, nh l cỏc phng phỏp ni bc t s phỏt trin ca cỏc nghiờn cu gn õy Phng phỏp truyn thng ó c chp nhn phỏt hin coliform bao gm k thut lờn men nhiu ng (MTF) v k thut mng lc (MF) s dng mụi trng nuụi cy c th v iu kin khỏc Nhng phng phỏp ny cũn nhng hn ch, chng hn nh thi gian bnh, s can thip sinh vt i khỏng, thiu tớnh c th v vic phỏt hin kộm i vi cỏc vi sinh vt phỏt trin chm hoc cú th phỏt trin v tn ti m khụng nuụi cy Ngy nay, k thut mng lc n gin v khụng tn kộm l phng phỏp c s dng rng rói nht cho vic nh lng thụng thng coliforms nc ung Vic phỏt hin coliforms da trờn hot tớnh enzyme c trng ó ci thin c nhy ca cỏc phng phỏp ny Cỏc enzyme -D galactosidase v -D glucuronidase c s dng rng rói phỏt hin v nh lng coliforms tng v Escherichia coli, tng ng Nhiu cht chromogenic v fluorogenic c dựng phỏt hin c th hot tớnh ca cỏc enzyme ny v cỏc th nghim mang tớnh thng mi khỏc c da trờn cỏc cht cú sn ny Nhiu s so sỏnh ó cho thy nhng th nghim ny cú th l mt thay th thớch hp cho cỏc k thut c in Tuy nhiờn, phng phỏp ny thỡ t hn, v thi gian , mc dự gim, nhng cũn quỏ di cho kt qu cựng ngy Cỏc cụng c phõn tớch tinh vi hn nh k thut m t bo pha rn cú th c tn dng lm gim thi gian cn thit phỏt hin cỏc hot ng ca GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm enzyme vi khun, vi mt ngng phỏt hin thp Phỏt hin coliforms bng phng phỏp phõn t ny cng c cp, vỡ cỏc phng phỏp ny cho nhng phỏt hin rt c th v nhanh chúng m khụng cn nuụi cy Ba phng phỏp phõn t c ỏnh giỏ õy: cỏc k thut dch, phn ng chui polymerase (PCR) v lai ti ch (ISH) Trong cỏch phng phỏp dch, cỏc khỏng th khỏc chng li vi khun coliform c to ra, nhng vic ỏp dng k thut ny thng cho thy khỏng th mang tớnh c hiu thp PCR cú th c s dng phỏt hin vi khun coliform bng phng phỏp khuch i tớn hiu: trỡnh t DNA mó húa cho cỏc gen lacZ (gen b-galactosidase) v gen uidA (b D gen glucuronidase) ó c s dng phỏt hin tng coliforms v E coli, tng ng Tuy nhiờn, vic nh lng vi PCR thiu chớnh xỏc v ũi hi phi lm vic phũng thớ nghim chuyờn dng K thut FISH liờn quan n vic s dng cỏc u dũ oligonucleotide phỏt hin cỏc trỡnh t b sung bờn t bo c th u dũ oligonucleotide c thit k c bit cho phm vi ca cỏc phõn t RNA 16S ca Enterobacteriaceae cú th c s dng kim soỏt cht lng vi sinh ca cỏc mu nc ung FISH nờn l mt k thut cn quan tõm cú th thay th cho cỏc phng phỏp nuụi cy thụng thng xỏc nh nhúm coliform nc ung, vỡ nú cung cp cỏc d liu nh lng mt khong thi gian khỏ ngn (6 ting), nhng ũi hi n lc nghiờn cu Gii Thiu Vic bo v sc khe cụng ng v mụi trng ũi hi nc ung phi an ton, iu ú cú ngha l khụng cha VSV gõy bnh Gia cỏc VSV phõn tỏn cỏc ngun nc, VSV gõy bnh rut l nhng loi d bt gp nht Nh mt h qu, cỏc ngun ụ nhim phõn nc dnh cho hot ng ngi phi c kim soỏt cht ch Tỏc nhõn gõy bnh ng rut, nh Escherischia coli O157: H7, thng hin din ti nng rt thp mụi trng nc mt h vi thc vt a dng Cỏc phng phỏp phc c ũi hi phỏt hin chỳng, v nhng phng phỏp ny thỡ vụ cựng tn thi gian Hu ht coliform hin din vi s lng ln h thc vt ng rut ca ngi v ng vt mỏu núng khỏc, v GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm vỡ th nờn chỳng c tỡm thy phõn thi Nh mt h qu, coliforms, c phỏt hin nng cao hn vi khun gõy bnh, c s dng nh mt ch s th hin s hin din tim n ca tỏc nhõn gõy bnh ng rut mụi trng nc Vic s dng cỏc nhúm coliform, v c th hn l E coli, nh mt ch s vi sinh ca cht lng nc cú t s phõn lp u tiờn ca cỏc vi sinh vt ny t phõn vo cui th k th 19 Coliforms cng thng c tỡm thy mụi trng t nhiờn a dng, nh mt vi loi s ú cú ngun gc t t, nhng nc ung khụng phi l mt mụi trng t nhiờn ca chỳng S hin din ca chỳng nc ung ớt nht phi c coi l mt mi e da hoc du hiu ca vi sinh vt v s suy thoỏi ca cht lng nc S mu coliform tng dng tớnh mt ngun nc ó c x lý m thng khụng cú coliform thỡ cú th l ch vic x lý khụng cú hiu qu, mt mỏt ca cht kh trựng, b chc thng (McFeters v cỏc cng s, 1986), s xõm nhp ca nc ụ nhim vo cỏc ngun cung cp nc sinh hot (Geldreich v cỏc cng s, 1992; Clark v cỏc cng s, 1996) hoc cỏc tỏi s dng (LeChevallier, 1990) h thng phõn phi, v, nh mt h qu, khụng c cho phộp Vic s dng cỏc nhúm coliform nh mt ch s v vic cú th hin din cỏc tỏc nhõn gõy bnh ng rut cỏc h thng thy sinh l mt ti tranh lun nhiu nm Nhiu tỏc gi ó bỏo cỏo dch bnh qua ng nc cuc hp quy nh coliform nc (Payment v cỏc cng s, nm 1991; Moore v cỏc cng s, 1994; MacKenzie v cỏc cng s, 1994; Gofti v cỏc cng s, 1999) Tuy nhiờn, mc ớch ca bi vit ny khụng phi l tho lun v cỏc khỏi nim ch s, m l xỏc nh phng phỏp hin ang c s dng hoc cú th c ngh cho vic theo dừi coliforms nc ung S cn thit ca cỏc kim nghim nhanh v nhy hn l khụng thay i ngnh cụng nghip nc, vi mc ớch l theo dừi trc tuyn liờn tc ca cỏc nh mỏy x lý nc thi 1.1 Coliforms l gỡ? Cỏc nhúm coliform bao gm mt s a dng phong phỳ v thut ng chi v loi, dự cú hoc khụng thuc h Enterobacteriaceae Hu ht cỏc nh ngha GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm coliforms l ch yu da trờn cỏc c tớnh sinh húa thụng thng Trong cỏc phng phỏp tiờu chun cho vic kim tra nc v nc thi (Part 9221 v 9222; APHA v cỏc cng s, 1998),cỏc thnh viờn nhúm coliform c mụ t nh sau: Tt c u k khớ v hiu khớ tu ý, gram -, khụng bo t, vi khun hỡnh que v lờn men lactose sinh khớ v to axit vũng 48h 35 oC (K thut lờn men nhiu ng; Phn 3.1) hoc Tt c hiu khớ v k khớ nhiu tu ý, gram õm, khụng bo t, vi khun hỡnh que phỏt trin thnh mt khun lc mu ỏnh kim vũng 24h 35oC trờn mt mụi trng loi Endo cú cha lactose (mng lc k thut; Phn 3.2) nh ngha cỏc thnh viờn ca nhúm coliform gn õy ó c m rng bao gm cỏc c im khỏc, chng hn nh phn ng -D-galactosidase dng tớnh (Part 9223; APHA et al, 1998) (kim tra enzyme nn, phn 4.2) Vic tỡm kim cỏc vi sinh vt -galactosidase dng tớnh v m -galactoside-dng tớnh cng cho phộp mt bc xỏc nhn lờn men lactose, ú k thut lờn men nhiu ng c s dng Cỏc th nghim cytochrome oxidase cng c s dng nh l mt th nghim khng nh loi b mt s vi khun ca chi Aeromonas hoc Pseudomonas m cú th lờn men lactose nh ngha ca vi khun coliform hi khỏc tựy thuc vo quc gia hoc cỏc t chc chu trỏch nhim v cỏc quy nh giỏm sỏt vi sinh Ti Canada, nh ngha ging nh M, v khỏc vi mt s nc chõu u Vớ d, Hip hi Tiờu chun Phỏp (NFT90-413 v NFT90-414; AFNOR, 1990), nú cú th c xem l mt mụ hỡnh i din cho lut phỏp chõu u, xỏc nh coliforms tng (TC) nh: Hỡnh que, khụng bo t, gram õm, oxidase õm tớnh, hiu khớ hoc k khớ tu ý Vi khun cú th phỏt trin s hin din ca mui mt hoc cht cú hot tớnh b mt thay th khỏc cú tỏc dng c ch s tng trng tng t v lờn men lactose sinh khớ v sinh acid (hoc aldehyde) vũng 48 gi 37 1oC GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm AFNOR (1990) i xa hn bng cỏch nh ngha nhúm coliform khỏc, bao gm c cỏc coliform chu nhit (cũn gi l coliforms phõn, FC), v c th hn, E coli l: Coliforms chu nhit cú cựng c tớnh lờn men nh coliforms (TC), nhng nhit 44 0,5oC E coli l mt coliform chu nhit, ch khỏc mt vi iu, to indole t tryptophane ti nhit 44 0.5 oC, cho kt qu th nghim methyl dng tớnh, khụng th to acetyl-methyl carbinol v khụng s dng citrate lm ngun carbon nht ca nú Vic s dng cỏc nhúm coliform nh mt ch s ụ nhim phõn phi ph thuc vo cỏc quy nh nghiờm ngt ca chớnh ph (Bng 1) E coli l coliforms ph bin nht h thc vt ng rut ca ng vt mỏu núng ng vt v s hin din ca nú cú th liờn quan ch yu n ụ nhim phõn Do ú khụng c phộp cú E coli nc ung C quan Bo v Mụi trng Hoa K (EPA) ó phờ duyt mt s phng phỏp phỏt hin coliform: cỏc k thut lờn men nhiu ng, k thut mng lc v cỏc th nghim cú mt /khụng cú mt (bao gm cỏc th nghim ONPG MUG) AFNOR (1990) ó phờ duyt k thut lờn men nhiu ng v k thut mng lc Cỏc phng phỏp ny cú nhng hn ch, chng hn nh thi gian , s can thip ca sinh vt i khỏng, thiu tớnh c th cỏc nhúm coliform v phỏt hin kộm ca i vi coliforms phỏt trin chm hoc b tn thng Vỡ th, tựy thuc vo h thng mụi trng, ch mt phn nh (0,1-15%) tng s qun th vi khun cú th c m bi phng phỏp nuụi cy (Amann v cỏc cng s, 1990) T l vi khun khụng nuụi cy cú th b nh hng bi iu kin khụng thun li cho vi khun phỏt trin sut quỏ trỡnh nuụi cy hoc bi kh nng sng sút hoc hot ng ca chỳng trng thỏi khụng nuụi cy (VBNC hoc ABNC) (Roszak v Colwell, 1987; Joux v Lebaron, 2000; Colwell v Grimes, 2000) GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm Bng Mt s quy nh chng nhim khun hin v hng dn cho nc ung Coliform tng Yờu cu giỏm sỏt E.coli Mt Mu/thỏng 0/100 ml (95%) United mt mu liờn tip t 0/100 cựng v trớ khụng c (100%) Statesa ml 1/1000 sinh vt cú coliform 0/100 ml (90%) khụng nờn cha nhiu Canadab hn 10 CFU/100 ml 0/100 ml 9000 90 + (1/10000 sinh vt) a C quan Bo v Mụi trng Hoa K nm 1990 b B y t Canada, 1996 c T chc Y t Th gii, 1994 Mc Tiờu Vỡ nc ung l ch nghốo dinh dng, cỏc phng phỏp nuụi cy kộm nhy vic phỏt hin cỏc t bo vi khun b tn thng v sp cht cú th to nhng hn ch nghiờm trng vic ỏnh giỏ quỏ thp mc ụ nhim Cú tn ti cỏc phng phỏp khỏc m cú th c s dng phỏt hin coliform, v l nhng trng thỏi khỏc ca s phỏt trin v ng dng ỏnh giỏ ny mụ t cỏc nguyờn GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm tc v cỏc cỏch thc thụng thng ca phng phỏp c in, cng nh mt s cỏc phng phỏp i mi v phng phỏp tip cn mi ni Vic ng dng cỏc phng phỏp khỏc phỏt hin coliforms mt mụi trng nghốo cht dinh dng nh nc ung cng c ỏnh giỏ da trờn nhng u im v nhc im ca chỳng Cỏc tiờu nh gii hn phỏt hin v nhy ca cỏc phng phỏp, thi gian cn thit cú c kt qu v cỏc kinh phớ ca phũng thớ nghim (bao gm c k nng, lao ng v chi phớ) cng c tho lun Phng Phỏp C in 3.1 K thut lờn men nhiu ng K thut m coliforms bng phng phỏp lờn men nhiu ng (MTF) ó c s dng hn 80 nm nh l mt phng phỏp kim tra cht lng nc Phng phỏp ny bao gm vic cy mt lot cỏc ng vi dung dch pha loóng thp phõn thớch hp ca cỏc mu nc To bt khớ, hỡnh thnh axit hoc tng trng nhiu ng nghim sau 48 gi 35 oC thỡ cú th l phn ng dng tớnh C mụi trng dch th lactose v lauryl tryptose u cú th c s dng nh mt mụi trng nuụi cy gi nh, nhng Seidler v cỏc cng s (1981) v Evans v cỏc cng s (1981) ó can thip, vi s lng ln vi khun khụng phi l coliform, thỡ s dng mụi trng dich lng lactose Tt c ng cú phn ng dng tớnh gi nh tip sau ú phi thc hin mt th nghim khng nh S hỡnh thnh khớ cỏc ng lờn men cha mụi trng brilliant green lactose bile ti bt k thi im no vũng 48 gi 35oC to thnh mt th nghim khng nh dng tớnh Cỏc th nghim coliform phõn (s dng mt mụi trng canh EC) cú th c ỏp dng cho xỏc nh colifom tng (TC) m c th l FC (APHA v cỏc cng s, 1998): vic to khớ sau 24 gi 44,5 oC canh EC c coi l mt kt qu dng tớnh Cỏc kt qu ca k thut MTF c th hin iu khon s lng cú th xy nht (MPN) v s hin din ca vi sinh vt Con s ny l mt c lng thng kờ ca trung bỡnh s coliform mu H qu l, k thut ny c a GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 10 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm et al., 1999) s phõn bit tỡnh trng sinh lý ca vi khun c phỏt hin mu nc 5.2 Phng phỏp da trờn axit nucleic Hu ht cỏc phng phỏp s dng acid nucleic tớnh lai phõn t, ú cú vic cụng nhn trỡnh t b tr gia thc nghimnucleic v mt mc tiờu nucleic.thm dũ v mc tiờu nucleic Mt phn ng lai cú th c thc hin gia mt tu thm dũ nucleic DNA v mt chui DNA chromosomic (DNA - DNA hybrid- húa) hoc mt rRNA hay tRNA t (DNA - RNA lai) c hiu, õy, ph thuc vo mc - bo tn cỏc mc tiờu nhúm mc tiờu phõn loi Nhng phng phỏp ny cung cp thụng tin phõn loi cỏc cp khỏc nhau, chng hn nh cỏc lp hc, chi, loi hoc phõn loi Mt s s h cú th c thc hin m khụng cn mt bc canh tỏc phc tp, ú cho phộp phỏt hin cỏc vi khun c th vũng vi gi, thay vỡ vi ngy cn thit vi cỏc phng phỏp canh tỏc da trờn Cỏc phng phỏp da trờn nucleic acid thng xuyờn hn l s dng phn ng chui polymerase (PCR) v cỏc phng phỏp lai ti ch (ISH) ỏnh giỏ hiu sut ca h vic phỏt hin vi khun cỏc mu nc ung c tho lun di õy 5.2.1 Phng phỏp phn ng chui polymerase PCR cho phộp mt on DNA mc tiờu c khuch i bng cỏch chộp vũng (cycling replication) Sao chộp ny, cú th c thc hin ng nghim(in vitro) hoc ti ch(in situ), bao gm mt chui phn ng xỳc tỏc bi mt DNA polymerase (Taq polymerase) v s dng cỏc mi oligonucleotidic c hiu phỏt hin ph thuc vo mc tng ng v b sung gia mc tiờu v mi v nhit lai (hybridization temperature) Cỏc vũng chộp ca PCR l kt qu mt khuch i theo cp s nhõn ca s lng cỏc chui mc tiờu v lm tng ỏng k kh nng phỏt hin mt chui him hoc s tng i thp ca cỏc vi sinh vt mc tiờu mt mu (Bej et al, 1990; Waage v cng s, 1999a , b; Burtscher et al, 1999) GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 27 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm Phng phỏp PCRthng c ỏy dng cho vic phỏt hin v xỏc nh cỏc vi khun bao gm mt chộp vũng sau bc tỏch chit DNA ng nghim (in vitro) Khuch i c thc hin trờn hm lng axit nucleic thu c bng mt ly gii t bo theo sau l mt chit xut húa hc Cỏc bc chit tỏchcú th c thc hin trờn mng lc gi li t bo vi khun(Bej v cng s, 1991a; Juck v cng s, 1996; Iqbal v cng s, nm 1997; Tsen et al., 1998) Quỏ trỡnh khuch i PCR bao gm: (i) mt bin tớnh DNA t mch ụi- DNA chui n, (ii) mi vi DNA si n nhit lai c th, v (iii) m rng lút bi mt DNA polymerase Taq Khuch i ca mt chui bng phng phỏp PCR thng ũi hi 20 n 40 chu k Sn phm PCR c phỏt hin sau in di trờn gel agarose v sau nhum cỏc sn phm khuch i bi mt loi thuc nhum fluorochrome hoc lai vi mt u dũ c gn nhón Phng phỏp PCR thng c mụ t phỏt hin v xỏc nh cỏc vi sinh vt thc phm, t, trm tớch v nc Nu chi tit cols nguyờn thy cho vic s dng PCR trờn ples thc sam- mụi trng ó cú sn nhiu nm (Trevors v van Elsas, 1995), ỏp dng phng phỏp ny xỏc nh cỏc vi sinh vt nc ung l gn õy Mt s th nghim ó c phỏt trin phỏt hin cỏc tng coliform (total coliform) TC, coliform phõn (faeacl coliform) FC (E coli v vi sinh vt cú liờn quan) v tỏc nhõn gõy bnh bao gm c vi khun Salmonella spp (Bng 2) i vi vi khun, phỏt trin on mi ó gp khú khn k t nhúm coliform, theo quy nh ca ngnh cụng nghip nc, l mt nhúm a dng, bao gm nhiu chi v loi tr mt s c liờn kt cht ch Kt qu l, mi phi c th m h khụng phỏt hin cht ch phylogenetically khụng liờn quan n vi khun Mi da trờn gen lacZ ó c s dng phỏt hin cỏc vi khun bi vỡ phng phỏp giỏm sỏt coliform thng c da trờn cỏc sn phm biu thc (bgalactosidase) ca gen ny (Bej et al, 1990, 1991a, b;.Fricker v Fricker, 1994) Sn phm PCR ca cỏc kớch c khỏc (326 v 264 bp) c to bng cỏch s dng cp mi khỏc v kt qu l phỏt hin ca TC vi s lng nh nh t bo GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 28 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm 1/100 ml s dng u dũ gen ỏnh du phúng x (Bej et al., 1990, 1991a) Fricker v Fricker (1994) ó nghiờn cu c trng ca mi cựng thit lp nh Bej et al (1991a) trờn 324 chng trc khun nuụi cy H kt lun rng mt b mi nờn c phỏt trin t mc da vo gen lacZ khụng cho phộp phõn bit i x ca mt s chng odorifera Hafnia alvei v Serratia phỏt hin c th ca vi khun E coli, mt vựng ca gen malB ny mó húa mt protein chuyn maltose l chui mc tiờu u tiờn xut (Bej et al., 1990) Khu vc ny bao gm cỏc gen m tht cu mó húa mt protein b mt c cụng nhn bi mt E coli- vi khun c th Tuy nhiờn, cỏc thnh viờn ca Shigella v Salmonella chi cng cú th c phỏt hin bng cỏch s dng b mi ny Vic s dng cỏc gen uidA sau ú ó c xut phỏt hin vi khun E coli (Bej et al., 1991a, b; Tsai v cng s., 1993) C hai khu vc quy nh (uidR) v gen mó húa cỏc uidA dase BD-glucuroni- (GUD) enzyme c s dng sau ú cú Mt khu vc Amplified chi tit: gen lacZ: mó húa cho enzym b-galactosidase; gen cu: mó húa cho mt protein b mt c cụng nhn c th vi khun E coli lambda; gen uidA: mó húa cho enzym BD-glucuronidase; gen uidR: mó húa cho khu vc qun lý ca uidA; gen phoE: mó húa cho mt protein mng ngoi l rng hỡnh thnh Thnh cụng (Fricker v Fricker, 1994; Juck v cng s, 1996;.Iqbal v cng s, 1997) Cỏc cp mi c c th cho E coli v Shigella spp Bej et al (1991b) ó bỏo cỏo nhy tt hn ca phng phỏp PCR so vi cỏc bi kim tra b mt c xỏc nh da MUG- Nhiu chng E coli MUG õm, ú bao gm cỏc E coli gõy bnh ca type huyt O157: H7, ó c phỏt hin sau PCR cation amplifi- ca gen uidA Hn na, Phong et al (1991) ó ch rng nhiu chng MUG õm cú gen uidA c sn phm gen (enzyme b-D-glucuronidase) khụng c th hin Cp mi khỏc c thit k cho hai khu vc khỏc ó c xut phỏt hin vi khun E coli, mt s h mó húa cho mt protein bờn ngoi mng (gen phoE) (Spierings et al., 1993) v GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 29 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm mt trỡnh t DNA mó húa cho cỏc vựng V3 v V6 ca gen 16S rRNA ca bnh v chng khụng gõy bnh ca vi khun E coli (Tsen et al., 1998) Nhng cp mi cho phộp phỏt hin c th ca vi khun E coli, m cũn ca cỏc loi vi khun Shigella cỏc trỡnh t ngh c khuch i tng tớnh c hiu ca vic phỏt hin bng phng phỏp PCR, mt s tỏc gi ó xut vic s dng cỏc phn ng multiplex PCR, ú bao gm ng thi khuch i on DNA khỏc Bej et al (1991b) sa i phng phỏp ny phỏt hin cỏc trỡnh t gen liờn quan n nhúm TC v nhng ngi liờn quan n tỏc nhõn gõy bnh ng rut nh E coli, Salmonella spp v Shigella spp Multiplex PCR cú th khụng hot ng tt vi tt c cỏc hn hp mi, nhiờn Thnh phn v chiu di ca pri- mer oligonucleotide, cng nh kớch thc ca cỏc mnh v AMPLI-fied, cú th nh hng ln khuch i PCR Vớ d, khuch i multiplex ca TC v E coli c thc hin bng nng cõn bng cỏc mi c, nng mi ng phõn t khụng cn thit cho vic phỏt hin ng thi Legion- viờm phi Ella v tt c cỏc vi khun thuc chi (Bej et al., 1991a) phỏt hin cỏc mc thp ca tỏc nhõn gõy bnh hoc vi sinh vt ch th cỏc mu nc, mt bc trung nh lc trc tiờn phi c thc hin Bej et al (1991a) bỏo cỏo s dng phng phỏp lc v phỏt hnh bi DNA úng bng tan bng i xe p m khụng nh hng n s khuch i PCR Khi trc quan ca sn phm PCR c thc hin bng cỏch s dng lai to vi cỏc u dũ phúng x, phng phỏp ny cho phộp mt gii hn phỏt hin lờn n t bo / 100 ml Tuy nhiờn, vic ỏp dng phng phỏp ny theo dừi thng xuyờn cú th l khú vỡ trc quan ca sn phm bi húa hybrid- vi mt u dũ phúng x cú th yờu cu 2-3 ngy k t phi nhim H thng phỏt hin khụng phúng x, ging nh mi biotinylated, cú th l mt thay th hu ớch cho nhiu phỏt hin nhanh chúng ca DNA mc tiờu thm dũ lai Juck et al (1996) ó phỏt trin mt giao thc phỏt hin nhanh chúng nng thp ca E coli cỏc mu nc da trờn giao thc PCR lng v s thay i ca giao thc lc bng Bej et al (1991a) Nested PCR bao gm hai vũng utive consec- khuch i PCR Vic chy u tiờn c GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 30 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm thc hin nh bỡnh thng, vi mi vi cỏc khu vc mc tiờu c th (mu) tip theo l phn m rng cho sion mi Vũng th hai s dng cỏc sn phm ca s khuch i u tiờn lm mu cho mt vũng ca v m rng vi sn lút khỏc Ngi ta thng liờn minh sn phm ca cỏc kt qu khuch i th hai mt mnh ú l ni b sn phm ca vũng u tiờn ca khuch i PCR Nested PCR tng hiu qu khuch i t cỏc cp a phng phỏt hin sn phm PCR to vũng u tiờn c khuch i t c mc phỏt hin vũng th hai.Vic s dng cỏc on mi lng cung cp mt cp quc Ngoaứi tớnh c th k t vũng PCR th hai ch cú th c thc hin nu ỳng trỡnh t (plementary ng mi bờn trong) c khuch i vũng u tiờn Giao thc Nested PCR c s dng phỏt hin vi khun E coli (Juck et al, 1996.) V mt s tỏc nhõn gõy bnh (Delabre et al, 1997.)Trong nc ung, Waage et al (1999a, b) ỏp dng chỳng vo vic phỏt hin s lng thp ca Salmonella spp v Y enterocolitica t bo vựng bin.K thut ny cho phộp phỏt hin mt nhanh hn (6-8 h) so vi PCR thụng thng (vi ngy), k t xỏc nhn ca chui khuch i chớnh xỏc bng u dũ lai l khụng cũn cn thit Mc dự nhy cm ca mỡnh, rt khú s dng PCR xỏc nh s lng vi sinh vt Hai k thut ch yu c phỏt trin cho DNA nh lng bng phng phỏp PCR: ( Toranzos et al, 1993) cỏc i nht cú th xy ra, s lng PCR v PCR cnh tranh (thờm mt i th cnh tranh cho giai on DNA PCR hiu chnh hiu qu PCR) (Zachar et al., 1993). kin thc ca chỳng tụi, cỏc k thut ny cha c ỏp dng t trc n cho cỏc nh lng coliform nc ung.Nh vy, hin nay, nú dng nh khụng th nh lng mt coliform nc ung bng phng phỏp PCR.Cho n nay, MPN-PCR khụng chớnh xỏc v PCR cnh tranh ũi hi s prepara- ỏng k trc i th cnh tranh DNA tt c ỏp dng cho cỏc mu nc Mt cỏch tip cn y hn l thi gian thc tớch nh lng PCR, ú bao gm giỏm sỏt cỏc sn phm fluores- cently PCR chỳng c khuch i (Heid et al., 1996) ng hc ca sn phm PCR l mt giai on tớch ly theo cp s nhõn theo sau l mt giai on cao nguyờn S xut hin ca cao nguyờn ny ph thuc vo nhiu thụng s soỏt khụng kim soỏt, chng hn nh dimerization mi v GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 31 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm s xut hin ca cỏc cht c ch Cation thi gian thc quantifi- l ỏng tin cy hn so vi im cui xỏc nh s lng vỡ cỏc phộp o c thc hin giai on theo cp s nhõn Nú cng cú th phỏt hin cỏc ition inhib- ca phn ng PCR cỏc cht c ch ng tinh khit vi DNA Cỏch tip cn ny gn õy ó c ỏp dng cho vic phỏt hin v enterohemorhagic enterotoxigenic E coli chng vi sinh lõm sng (Bellin et al, 2001; Carroll v cng s, 2001.) Khi sn phm PCR khuch i c nhum vi thuc nhum SYBR Green, s dng mt LightCycler (Roche, Mannheim, Ger- nhiu) hoc mt GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, M), phng phỏp PCR thi gian thc hin nhanh chúng hn v nhy cao hn v c hiu s so sỏnh vi cỏc xột nghim PCR song vi phõn tớch gel truyn thng (Carroll et al., 2001) Tuy nhiờn, phng phỏp ny cha c ỏp dng rng rói phỏt hin c th ca vi sinh vt hin nng thp cỏc mu mụi trng, nhng cú th c phỏt trin tng lai Gn õy hn, Tani et al (1998) ó xut mt iu tra trc tip cỏc t bo mc tiờu bng cỏch s dng trc tip xột nghim PCR ti ch S khuch i ca mt trỡnh t c th c thc hin t mt gen n bn hin din cỏc t bo Cỏc giao thc PCR thụng thng phi c sa i trỡnh t axit nucleic cú th c khuch i c th Vi c nh v permeabilization nhng iu kin thớch hp, mi oligonucleotide v cỏc thnh phn phn ng khỏc cú th khuch tỏn vo cỏc t bo, v i xe p nhit, khuch i trỡnh t mc tiờu c th Sn phm PCR c dỏn nhón bi digoxigenin-UTP (DIG- dUTP), v cỏc mnh v chng DIG Fab 'liờn hp vi thuc nhum hunh quang c s dng phỏt hin bng kớnh hin vi hunh quang epifluores- Cỏch tip cn ny cho phộp nhỡn thy trc tip cỏc sn phm khuch i hunh quang mt mc n bo v ú mt iu tra trc tip cú th c dỏn nhón ca cỏc t bo Cỏc tỏc gi ó ỏp dng phng phỏp PCR mi ny vi s enumera- trc tip ca E coli t mu nc ngt.Kt qu cho thy mt tớn hiu cng hunh quang yu ca cỏc t bo mc tiờu.Tuy nhiờn, h kt lun rng phõn tớch hỡnh nh cho phộp mt iu tra trc tip cỏc t bo mc tiờu E coli Mc dự giao thc PCR ch dng nh ing promis-, nú ó khụng c s dng cho vic phỏt hin thng xuyờn v m s vi sinh vt nc GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 32 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm Nhiu hn ch liờn quan n cỏc c im k AMPLI-PCR ca DNA cn phi c gii quyt trc phng phỏp ny cú th c s dng phõn tớch nhy cm ca vi khun mu nc ung Mc dự phng phỏp ny ó c s dng vi mt s thnh cụng phỏt hin E.coli v coliforms, cn phi ch rng hu ht cỏc nghiờn cu c thc hin trờn mu nc tng vt vi cỏc chng nuụi cy vi khun (Bng 2) v xỏc nhn l him khi, hoc khụng, c thc hin trờn cỏc mu mụi trng Mc dự thc t l PCR c cụng nhn l mt phỏt hin v xỏc nh phng phỏp rt c th, nú cú th trỡnh by mt s hn ch ỏp dng cho vic phỏt hin cỏc t bo mt mu t nhiờn l kh thi hoc trao i cht hot ng m khụng b culturable Tht vy, khuch i PCR ỏp dng i vi acid nucleic chit xut t t bo sng v culturable, kh thi v khụng culturable hay ó cht Do ú, xột nghim PCR khụng th cung cp thụng tin v tỡnh trng sinh lý ca t bo mc tiờu Mt hn ch c hu phõn tớch PCR cỏc mu mụi trng l c ch thng xuyờn ca cỏc phn ng enzym: Cỏc cht humic c gi l (ASE Taqpolymer-) enzyme trựng hp cht c ch, v cht keo cú ỏi lc cao vi DNA (Way v cng s, 1993 ) S hin din ca cỏc yu t ny mt mu nc ú cú th ỏng k gim nng sut khuch i PCR c ỏp dng phỏt hin cỏc vi khun pha loóng rt nhiu H cng cú th hn ch vic tit l cỏc sn phm khuch i (Straub et al., 1995) 5.2.2 K thut lai in situ (In situ hybridization techniques) ISH s dng u dũ oligonucleotide phỏt hinchui axit nucleic bsung Phng phỏp ny khai thỏc kh nng ca axit nucleic bỏm vi mt cỏch b sung rt c th to ging lai Cỏc u dũ c c th bi vỡ chỳng c xõy dng t, v c b sung vo, chn nucleic acid chui ú l nht a mt vi sinh vt, cỏc loi hoc nhúm Cỏc u dũ cú th nhm mc tiờu hoc l ADN hoc cỏc phõn t RNA S dng trỡnh t rRNA (5S, 16S v 23S) nghiờn cu cỏc mi quan h phỏt sinh loi trờn c s ca s phõn k ca h v phỏt trin thit b thm dũ lai rt quyt tõm, bõy gi cng c thnh lp (Amann et al, 1995.) Trỡnh t ca hn 2500 ca rRNA 16S loi vi khun hin trao cỏc gen cú giỏ tr thụng tin GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 33 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm rt cao mt mc phỏt sinh loi So sỏnh trỡnh t lm cho nú cú th xỏc nh cỏc khu vc mc tiờu c bo tn hon ho mc phõn loi khỏc v ú c th cỏc cp, t cỏc tờn phõn loi Cng quan tõm mc tiờu phõn t rRNA l mc cao ca cỏc phõn t rRNA bn, ú l ln lt liờn kt vi s lng ln cỏc ribosome t bo S lng ribosome khỏc nhau, thng t 103 n 105 trờn vi khun, theo cỏc loi v trng thỏi logic physio- ca cỏc t bo, v c trc tip tng quan vi tc tng trng ca t bo (Amann et al., 1995) u dũc th rRNA (ch yu l 16S v 23S rRNA CES tun t) ó tr thnh cụng c tiờu chun xỏc nh sinh vt (Olsen v cng s, 1986.) Mt s thit b thm dũ oligonucleotide thng mi húa v la chn xem cú nờn s dng chỳng hay thit k, nhng ngi c th mi ph thuc phn ln vo ng dng tỡm chui mc tiờu liờn tc nht cho mt vi sinh vt c th, cỏc nh nghiờn cu da vo mỏy tớnh h tr so sỏnh trỡnh t cú sn c s d liu d ỏn ribosome (RDP) (Maidak et al., 1996), GenBank cho DNA (Benson et al., 1999), hoc gúi phn mm ARB (Vin Max Planck, Bremen, c) i vi c trng tt hn, trỡnh t mc tiờu nờn ngn (15 n 30 base) v cú ớt nht 2-3 nucleotide khỏc vi chui ca cỏc sinh vt liờn quan cht ch (DeLong, 1993) Lm vic sm ch lai da vo thm dũ phúng x phỏt hin v phỏt hin cỏc mc tiờu lai probe- (Olsen v cng s, 1986.) Cụng vic hin ti trờn rRNA lai ti ch hunh quang s dng u dũ nucleotide nhón hu nh ch phỏt hin húa hybrid- (FISH) S ph bin ca k thut FISH l li th ca mỡnh i vi nhón phúng x, ú bao gm nhy, tc ca trc quan ca t bo n (bng kớnh hin vi hoc cỏc thit b cytometrical), s n nh ca sn phm lai, an ton, thi gian phỏt hin gim i, nhiu nhón (nhiu mu sc) v d s dng (Richardson et al., 1991; DeLong, nm 1993; Swinger v Tucker, 1996) Hunh quang v thuc nhum Rhodamine l fluorochromes xuyờn s dng thng xuyờn nht (DeLong v cng s nm 1989,; Amann v cs, 1990; Manz v cng s, 1992; Nm 1993; Wagner v cng s, 1994), nhng thuc nhum CY3, sỏng hn v dn n gim hunh quang khụng c hiu hn so vi rochromes fluo- khỏc, gn õy ó thu hỳt c s chỳ ý nhiu hn (Wessendorf v Brelje nm 1992; Glockner GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 34 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm v cng s nm 1996,; Zarda et al, 1997; Kalmbach v cng s 1997a,; Ouverney v Fuhrman, 1999) Trong thc t, cỏc bc th tc cỏ l: c nh t bo, lai (c v nghiờm ngt ph thuc vo nhit v thi gian lai, nng mui, nng thm dũ v chiu di), hu lai ( loi b rng buc hoc khụng c th ti liu rng buc) v phỏt hin T bo lai ny thng c phỏt hin bng kớnh hin vi v mt epifluorescence counterstain nh vy nh DAPI (40,60-diamidino-2-phenylindole) hoc mu cam acridine c s dng xỏc nh tng s t bo Tựy thuc vo nng ca cỏc t bo mc tiờu mu v tng phõn gii, phỏt hin cỏ cú th c thc hin bng cỏc phng tin lu lng hoc pha rn m t bo o dũng t bo cho phộp nh lng cng hunh quang cho mi mc tiờu thm dũ lai (Fuchs v cng s, 1998.) i vi TC, s phỏt trin ca mt c th 16S rRNA thm dũ cho nhúm ny l khụng th, k t nhúm coliform theo quy nh ca ngnh cụng nghip nc l mt nhúm cú cha vi khun t chi c phylogeneti- Cally khỏc Kt qu l, cỏc u dũ (Bng 3) ó c phỏt trin cho h Enterobacteriaceae hn l cho TC Vic u tiờn, Entero (Mittelman et al., 1997) ó c phỏt trin phỏt hin lõm sng ca nhim trựng ng tiu Th hai, ENT1 (Loge et al., 1999) ó c phỏt trin cho cỏc ng dng trờn cỏc mu nc thi Hai mu dũ khỏc thnh phn ca h v cỏc iu kin lai Cỏc Entero thm dũ l di 25 base cú hm lng C + G 48% so vi 17 c s v 70% C + G cho u dũ ENT1 Nghiờn cu RDP (Maidak et al., 1996) cho thy tớnh c hiu cao i vi u dũ ENT1 cho cỏc loi Enterobacteriaceae hn so vi thm dũ Entero (Rompre' v Baudart, NSERC Ch tch cụng nghip vo nc ung, Ecole Polytechnique Montreal,thong tin cỏ nhõn) Trỡnh t rRNA thm dũ mc tiờu phỏt hin vi khun E coli cng ó c cụng b Cỏc u dũ EC1531 (Poulsen et al., 1994), b sung cho mt chui 23S rRNA, bao gm 20 nucleotide vi ni dung C + G 55% Shi et al (1999) ó s dng u dũ ny phỏt hin vi khun E coli sau thay i cỏc iu kin lai, nhng khụng cú kt qu ó cp Cỏc u dũ ó c s dng nh mt iu khin GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 35 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm mt thớ nghim bng cỏch s dng mt mụ hỡnh thu nh chit xut tng vt vi E coli DNA Gn õy hn, Regnault et al (2000) ó phỏt trin thm dũ Colinsitu phỏt hin vi khun E coli v E fergusonii nc tiu, nc (sụng v nc thi) v cỏc mu thc phm Cỏc ng Colinsitu thm dũ mang n nhng b mt chui 16S rRNA v bao gm 24 nucleotide (C + G ni dung ca 46%) thm dũ ny cho thy c hiu tt cho trc quan ca E coli t cỏc phng tin truyn thụng khỏc ó c th nghim v mi c s dng thnh cụng phỏt hin vi khun E coli nc ung mu (Delabre et al., 2001) K thut FISH dng nh l mt phng phỏp phỏt hin rt c th cp t bo; Tuy nhiờn, nú cú th cú mt s hn ch ỏp dng cho vic phỏt hin cỏc cht dinh dng b b cỏc t bo vi khun ph bin drink- bng u dũ oligonucleotide c s dng xỏc nh cỏc Enterobacteriaceae v E coli mụi trng Thm dũ liờn tc (50 -30) rRNA v trớ mc tiờu c ti liu tham kho ENTEROa CATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCC 16S, 1458-1482 Enterobacteriaceae Mittelman et al, 1997 ENT1 CCGCTTGCTCTCGCGAG 16S, 1273-1289 Enterobacteriaceae Loge et al, 1999 EC1531 CACCGTAGTGCTCGTCATCA 23S, 1531 - 1550 E coli Poulsen et al, 1994 COLINSINTU GAGACTCAAGATTGCCAGTATCAG 16S, 637-660 E coli Regnault et al, 2000 PNA thm dũ GCAAAGCAGCAAGCTC 16S, 71-86 E coli Prescott v Fricker, 1999 õy Entero cho s khỏc bit d dng hn vỡ khụng cú tờn ó c a bi cỏc tỏc gi nc Nhng hn ch ny cú liờn quan n mt ni dung ribosom ca vi khun nh v ú s lng nh cỏc 16S rRNA mc tiờu ca cỏc t GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 36 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm bo, ú gõy tớn hiu lai hunh quang yu (Amann et al, 1995; Lebaron et al, 1997.) õy cú l l lý ti cỏ him c mụ t cỏc ti liu nc ung vo lỳc ny Kt qu l, h thng khuch i rescence fluo-, chng hn nh nhiu thm dũ (thay vỡ monolabeled thm dũ k thut FISH ventional dng), tớnh tng tỏc ca cỏc biotine - avidine phc v / hoc ci nga trm oxydase liờn hp vi fluorochrome - tyramide- nn , cú th i din cho mt cỏch tng cng ca tớn hiu hunh quang phỏt bi cỏc t bo lai (Lebaron et al, 1997; scho nhuber et al, 1997.) Gn õy, Prescott v Fricker (1999) bỏo cỏo vic s dng mt axit nucleic peptide (PNA) thm dũ cho lai to ti ch v phỏt hin cỏc vi khun E coli nc mỏy Cỏc kt qu lai cng tng t nh nhng ngi thu c t phng phỏp m tm Mt PNA l mt axit nucleic tng hp, ú xng sng ng c thay th bng mt xng sng peptide Nhng li th s dng PNA thay vỡ u dũ DNA bao gm khỏng tt hn nuclease tn cụng, hybrid- húa c lp vi nng mui, nhiu bit rng buc cific v trỡnh t thm dũ ngn hn, t c nhy ln hn K t thm dũ PNA liờn kt mnh m hn vi cỏc trang web mc tiờu, phn ng lai cú th c hon thnh mt thi gian ngn (30 phỳt) Theo hiu bit ca chỳng tụi, ngoi tr tu thm dũ E coli PNA (Prescott v Fricker, 1999), khụng s nhng thit b thm dũ ó c s dng cho vi khun hoc vi khun gõy bnh giỏm sỏt nc ung Trc h c chp nhn nh mt phng phỏp iu tra coliform nhy cm, h phi u tiờn phi chu mt giai on xỏc nhn thm dũ phự hp nht cho cỏc mu phõn tớch cú th c la chn v ti u húa cỏc iu kin lai nu cn thit Kh nng di ng l mt cõu hi ln ny sinh vic s dng cỏ theo dừi ụ nhim ngun nc ung Nú c thnh lp rng ni dung rRNA ca cỏc t bo vi khun cú tng quan trc tip vi tc tng trng (Amann et al., 1995) Tuy nhiờn, ni dung rRNA ca mt loi vi khun cú th khụng hon ton phn ỏnh tỡnh trng sinh lý ca nú Cú v nh mt s lng nh cỏc phõn t rRNA cú th trỡ mt thi gian tng i di sau mt culturability S aureus v E coli rRNA cũn phỏt hin 48 gi sau kớch hot va phi nhit hoc tia UV (McKillip et al., 1998) Sheridan et al (1998) cũn tỡm thy vi khun E coli 16S GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 37 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm rRNA 16 gi sau ngng hot ng nhit mc 100, 80 v 60 C Cui cựng, Prescott v Fricker (1999) tip xỳc vi mt chng E coli n 1,5 mg / l clo cho n 30 phỳt S dng u dũ PNA v tyramide hunh quang h thng cation amplifi(TSA b; Perkin Elmer Khoa hc i sng, Ontario, Canada), h vi khun phỏt hin s sau kh trựng bng clo, khụng cú cỏc t bo c phỏt hin bi s lng a hoc cỏc phng phỏp Colilert Hai tun sau kh trựng bng clo, 10% cỏc t bo b phỏt hin bi b PNA thm dũ-TSA iu ny cú th c xem nh l mt li th cho cỏc phng phỏp ú cỏc hỡnh thc colikhụng culturable cú th c phỏt hin, hoc l mt bt li ú cỏc t bo cht cú th c lit kờ Nghiờn cu sõu hn v tỡnh trng sinh lý ca vi khun c lit kờ bi cỏ cũn cn thit i n mt kt lun v cõu hi ny Mt cỏch cú th nghiờn cu ny l vi k thut s kh thi trc tip (DVC) (Kog- ure et al., 1979) vi phỏt hin FISH (Nishimura et al., nm 1993; Kalmbach et al., 1997b) Khp ni ny gn õy ó c ỏp dng phỏt hin vi khun E coli nc ung ca Delabre et al (2001) Cỏc tỏc gi thy ỏng k cao hn E coli phong phỳ vi giao thc ca h hn bi s lng tm C hin ang c coi l mt phng phỏp phỏt hin t bo c hiu cao, v l tng i d dng thc hin Cỏc c trng ca phỏt hin ph thuc vo c trng ca tu thm dũ oligonucleotidic v tớnh cht ch cỏc iu kin s dng lai Cation Identifi- ca chui mc tiờu cũn t nht, nhiờn, cỏ khụng th c ỏp dng phỏt hin cỏc phi phylogenetically xỏc nh vi sinh vt, chng hn nh vi khun Trong trng hp ny, cụng vic cú th c thc hin trờn nghieọp obacteriaceae, cỏc phylogenetically xỏc nh nhúm gn nht m cú th c coi l mt ch s tim nng ca ụ nhim phõn Kt Lun Mc ớch ca bi vit ny l: - truyn t inventory v gn õy hn l phng phỏp phỏt hin nhúm coliforms, ch yu l nhng ỏp dng cho phõn tớch cht lng vi sinh GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 38 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm - ỏnh giỏ nhng hn ch ca phng phỏp ny v nhy v ng dng ca nú Ngy k thut mng lc l mt phng phỏp ph bin nht cho vic m coliforms nc ung , k thut ny n gin, d thc hin v khụng tn kộm, ũi hi phi cú thi gian ớt nht l qua ờm ( 24-72 gi hn) sau iu tra khun lc ban u, Hn na, tiờu chun media mụi trng thch c s dng vi k thut ny l c ch, coliforms yu hoc b tn thng phỏt trin mụi trng c bit nh( m-T7) v vic b sung cỏc hp cht c th ( nh pyruvate) nõng cao t l phc hi ca cỏc t bo yu hoc b tn thng, Ngoi ra, thi gian thc hin di, di ca nú ph thuc vo cỏc th nghim sinh húa s dng cho cỏc bc xỏc nhn, cũn yu t hn ch Nhng thỏch thc quan trng i vi s phỏt trin ca phng phỏp phỏt hin coliforms mi l ci thin cỏc c tớnh ca phng phỏp ny, m cú th loi b lm tn thi gian, a vo cỏc t bo yu hoc b tn thng v gim thi gian phõn tớch Mt cuc iu tra hot ng ca enzyme c th nờn c ci thin nhy ca vic phỏt hin EColi, s dng -D galactosidase v -Dglucuronidase, Nhiu cht chromgenic v cht hunh quang tn ti cho vic phỏt hin hot ng ca enyme v th nghim trờn c s cỏc cht nn cú sn, Rt nhiu so sỏnh gia th nghim ny v cỏc phng phỏp tiờu chun ó ch rng nú cú th l la chn phự hp vi k thut MF, Cỏc bi kim tra d dng thc hin, ch yờu cu thit b, phũng thớ nghim c bn, hin th nhy v c hiu cao, Tuy nhiờn phng phỏp ny c hn, thm nhiu hn nh vy nu thi gian gim (khong 18h ) v mt quỏ lõu cú kt qu ngy Phỏt hin coliforms bng phng phỏp tip cn tỡm hiu enzyme mc t bo kt hp vi cỏc u dũ hunh quang cng cú th c xut, cỏc phng phỏp ny cho phộp phỏt hin rt c th v nhanh chúng m khụng cn mt bc nuụi cy no, thi gian thc phng phỏp phỏt hin c phỏt trin bi Van Poucke GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 39 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm v Nelis ( 2000a,b),Phng phỏp tip cn mi ny cho phộp tng nhy nhanh hn so vi th nghim khỏc Phng phỏp dch, phng phỏp ny ó rt ph bin, d dng ỏp dng nhng cũn mt s hn ch lien quan n phn ng chộo ca cỏc t bo khụng mc tiờu ca khỏng th, Phng phỏp PCR cung cp mt phỏt hin mc c hiu cao hn, Neverless, phng phỏp ny cú hn ch ln ỏp dng cho cỏc mu t nhiờn, bao gm t l khuch i thp, liờn quan n s hin din ca cỏc cht c ch v thiu thụng tin v hot ng sinh lý ca t bo Phng phỏp PCR yờu cu i ng nhõn viờn cú tay ngh cao cng nh khụng gian phũng thớ nghim chuyờn dng v thuc th c th trỏnh nhim bn ca cỏc mu AND bờn ngoi, c bit l nested-PCR yờu cu Phng phỏp FISH cng cn c xem xột nh l phng phỏp m thay th cho vic iu tra coliforms nc ung, nh phng phỏp ny cng ch hin nh lng vũng ngy Hin vic s dng cỏc thit b thm dũ oligomicnucleonde cho vic m coliform l khụng ph bin Cỏc ln vi vic ỏp dng FISH m cỏc t bo cú ch s phõn mu nc uụng lien quan n tỡnh trng sinh lớ ca vi khun nc uụng (do cht kh trựng) Trờn thc t nhng t bo vi khun thng c c trng bi hm lng sibosome nh, lm phc vic phõn tớch ca positne fluoucseent signals Vic s dng cỏc u dũ PNA thay DNA hoc s dng cỏc h thy khuch i hunh quang nờn cng nhy cao v cng hunh quang ca positive signdes Vic ỏp dng FISH mu nc ung hin ũi hi phi phỏt trin cao hn na t c vic m ti u cỏc t bo thiu dinh dng yu i Thng coliforms c tỡm thy vi s lng nh mu nc ung ú vic iu tra cp t bo ca t bo mc tiờu lien quan n vic la chn Mi õy Joux and Lebara (2000) phõn tớch nhng hn ch v s lng v cht lng ca cụng c phõn tớch hunh quang khỏc (kớnh hin vi hunh quang, flow cytometer, confocal scanning laser microscope and the new solid phase laser scanning cytometer), GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 40 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm S xut hin cỏc phỏt hin v thi gian thc ca cỏc phng phỏp mi cú lien quang n s cn thit cho cỏc chun oỏn ỏnh giỏ tt hn v cht lng vi sinh ca nc, Mc tiờu ny cú th t c thong qua s gia tng vic phỏt hin c th v gim thi gian phõn tớch Tuy nhiờn k thut phc v chi phớ tng ng cao hn ch ca mỡnh tr thnh phng phỏp chun húa cho vic phỏt hin coliforms mu nc ung Hn na , vi kin thc hin cú cụng vic hin ti ngoi tr Delabre et al(2001) nghiờn cu, cha chng minh c rng mt t l ỏng k cỏc ch th t bo c tỡm thy mt trng thỏi kh thi hoc hot ng nhng khụng culturable h thng phõn phi, Nu õy l mt trng hp, cỏc bc nghiờn cu tip theo s l ỏnh giỏ kh nng tỏc ng ca cỏc t bo sng hoc hot ng nhng khụng ch v kh nng gõy bnh, m cũn v kh nng tỏi sinh LI CM N ỏnh giỏ ny l mt phn ca d ỏn nghiờn cu mt cỏch tip cn ton din kim soỏt ton b coliforms h thng phõn phi nc ung c h tr bi Vivendi Water-US-Filter, Tỏc gi cỏm n tin s Camper v Dr.V.Gautheir cho nhng r soỏt hu ớch ca h bn tho GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 41 [...]... phỏp min dch hunh quang trong phng phỏp lai ti ch (FISH) (xem phn sau) Mt trong nhng li ớch FISH s tc trong vic s dng ca mt khỏng th nh chng Fis (Rockabrand GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 26 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm et al., 1999) s phõn bit tỡnh trng sinh lý ca vi khun c phỏt hin trong mu nc 5.2 Phng phỏp da trờn axit nucleic Hu ht cỏc phng phỏp s dng acid nucleic tớnh lai phõn t, trong ú cú vic cụng nhn... tng tớnh nhy cm vi mui mt hoc cỏc cht hot ng b mt thay th (sodium desoxycholate hoc Tergitol 7) cha trong mt s mụi trng nuụi cy chn lc Mt s ci tin trong phng phỏp ó tng phỏt hin i vi vi khun coliform b tn thng, bao gm c vic phỏt trin cỏc mụi trng m-T7 c bit dnh cho vic phc hi ca coliforms b tn thng trong nc ung (LeChevallier v cỏc cng s, 1983) ỏnh giỏ thng xuyờn v cỏc mu nc ung (LeChevallier v cỏc... glucuronidase ch yu l gii hn E coli S ph bin ca enzyme ny v tin ớch ca nú trong vic phỏt hin vi khun E coli trong nc sau ú ó c xem xột bi Hartman (1989) Phn ng B-D-glucuronidase dng tớnh ó c quan sỏt trong 94- 96% ca E coli phõn lp c th nghim (Kilian v Bulow, 1976; Feng v Hartman, 1982; Edberg v Kontnick, 1986; Kaspar v cng s, 1987), trong khi Chang v cng al (1989) tỡm thy mt t l cao hn ca B-D-glucuronidaseE... (Ofjord et al, 1998; Berg v cng s, 1998.) Cỏc mu c (sau khi tp trung bng cỏch lc, nu cn thit) 37oC cho TC v 44oC FC trong mt mụi trng phỏt trin cú chn lc cho coliforms v cha MUGal Nu s lng coliform trong mu l , s gia tng hunh quang do MUGal thy phõn bi cỏc vi khun hin nay cú th c o trong vũng cha y 2 gi Nu khụng, vic phỏt hin mt tớn hiu hunh quang quan trng ũi hi s phỏt trin ca vi khun trc Vic phỏt... ó c n lc thc hin s dng phỏt hin cỏc ch tiờu cht lng nc trong nc ung.Obst et al (1989) ó phỏt trin mt phng phỏp ELISA s dng khỏng th n dũng chng li cỏc khỏng nguyờn enterobacterial chung (ECA), mtloilipopolysaccharide , c liờn kt trong mng ngoi ca Enterobacteriaceae Phng phỏp ny khụng nhy , tuy nhiờn, do únuụi cy mu trc trong mt canh chn lc trong 24 gi l cn thit nh gii hn phỏt hin ca phng phỏp ELISA... phỏp min dch phỏt hin E.coli v coliforms vn cha thnh cụng Hn na, kin thc ca chỳng tụi, cỏc khỏng th thc chng li tt c cỏc chng mụi trng ca vi khun E coli khụng tn ti vo thi im ny Vic ỏp dng cỏc khỏng th n dũng phỏt hin cỏc sinh vt c th trong mt mụi trng t nhiờn, c bit l cỏc vi khun trong nc ung, cú th cn iu tra phc tp hn hng v khỏng th c hiu v s phong phỳ ca vi khun trong mt mu nc ung Bi vỡ khỏng...Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm nh lng s b coliforms Tuy nhiờn, chớnh xỏc ca vic c lng thỡ thp v ph thuc vo s ng dựng phõn tớch: vớ d, nu ch 1 ml c xem xột trong mt mu cha 1 coliform / ml, khong 37% trong cỏc ng 1 ml cú th mong i d kin s mang li kt qu õm tớnh vỡ cỏc phõn phi ngu nhiờn ca cỏc vi khun trong mu Nhng, nu nm ng, mi 1 ml mu, c s dng, mt kt qu õm tớnh cú th c... cỏc kt qu khuch i th hai trong mt mnh ú l ni b sn phm ca vũng u tiờn ca khuch i PCR Nested PCR tng hiu qu khuch i t cỏc cp a phng phỏt hin sn phm PCR to ra trong vũng u tiờn c khuch i t c mc phỏt hin vũng th hai.Vic s dng cỏc on mi lng nhau cung cp mt cp quc Ngoaứi tớnh c th k t vũng PCR th hai ch cú th c thc hin nu ỳng trỡnh t (plementary ng mi bờn trong) c khuch i trong vũng u tiờn Giao thc... chúng hn v nhy cao hn v c hiu trong s so sỏnh vi cỏc xột nghim PCR song vi phõn tớch gel truyn thng (Carroll et al., 2001) Tuy nhiờn, phng phỏp ny cha c ỏp dng rng rói phỏt hin c th ca vi sinh vt hin nay nng thp trong cỏc mu mụi trng, nhng cú th c phỏt trin trong tng lai Gn õy hn, Tani et al (1998) ó xut mt iu tra trc tip cỏc t bo mc tiờu bng cỏch s dng trc tip trong xột nghim PCR ti ch S khuch... Mc dự trong giao thc PCR ch dng nh ing promis-, nú ó khụng c s dng cho vic phỏt hin thng xuyờn v m s vi sinh vt trong nc GVGD: Phan Th Kim Liờn Trang 32 Phõn Tớch Vi Sinh Thc Phm Nhiu hn ch liờn quan n cỏc c im k AMPLI-PCR ca DNA cn phi c gii quyt trc khi phng phỏp ny cú th c s dng phõn tớch nhy cm ca vi khun trong mu nc ung Mc dự phng phỏp ny ó c s dng vi mt s thnh cụng phỏt hin E.coli v coliforms, ... vòng vài giờ, thay vài ngày vớiu cầu phương pháp truyền thống Một số phương pháp phân tử áp dụng cho việc phát cụ thể Coliform nước nước uống thảo luận 5.1 Phương pháp miễn dịch Phương pháp miễn... phương pháp IFA trực tiếp kết hợp với phát ScanRDI1 Phương pháp tiếp cận nhiều giai đoạn áp dụng mẫu nước nhọn cho thấy mức độ cao nhạy cảm so với phương pháp dựa ni cấy Việc sử dụng phương pháp. .. đổi phương pháp tiếp cận Việc ứng dụng phương pháp khác để phát coliforms mơi trường nghèo chất dinh dưỡng nước uống đánh giá dựa ưu điểm nhược điểm chúng Các tiêu chí giới hạn phát độ nhạy phương