Những vấn về kỹ thuật cần Được quan tâm khi áp dụng PCR và realtime PCR trong phòng thí nghiệm chẩn Đoán

Nh ng v n v k thu t c n ủ c quan tõm ỏp d ng PCR v real-time PCR phũng thớ nghi m ch n ủoỏn S khỏc bi t gi a phũng thớ nghi m ch n ủoỏn v phũng thớ nghi m nghiờn c u Phũng thớ nghi m nghiờn c u l phũng thớ nghi m m cỏc th nghi m ủ c th c hi n ủ ủỏp ng m t nhu c u nghiờn c u no ủú nh m giỳp nh nghiờn c u gi i ủỏp m t v n ủ c a khoa h c K t qu c a m t phũng thớ nghi m nghiờn c u khụng liờn quan tr c ti p v t c th i ủ n quy t ủ nh c a ng i g i m u xột nghi m, v y chn nuụi hay th y s n s khụng liờn quan ủ n quy t ủ nh h y hay cụ l p m t qu n th gia sỳc hay tụm cỏ, hay y h c khụng liờn quan ủ n quy t ủ nh ủi u tr c a bỏc s trờn b nh nhõn Do v y k t qu c a phũng thớ nghi m nghiờn c u s khụng c n thi t ph i k p th i ủ n tay ng i g i m u xột nghi m Phũng thớ nghi m ch n ủoỏn l phũng thớ nghi m cú nhi m v chớnh y u l lm xột nghi m trờn cỏc m u th ủ phỏt hi n ủ c tỏc nhõn gõy b nh v tr l i k t qu ủ n ng i g i yờu c u xột nghi m ủ h th cho cỏc cỏch gi i quy t c th trờn cỏc v t ch ủ c l y m u g i ủi xột nghi m Trong chn nuụi hay th y s n, k t qu c a m t phũng thớ nghi m ch n ủoỏn s r t quan tr ng vỡ cú liờn quan ủ n quy t ủ nh c a gi i h u trỏch ủ tiờu h y hay cụ l p m t b y ủn gia sỳc hay tụm cỏ Trong y h c, phũng thớ nghi m ch n ủoỏn cũn ủ c g i l phũng thớ nghi m lõm sng vỡ k t qu xột nghi m s ủ c cỏc nh lõm sng tham kh o ủ phỏt ủ ủi u tr trờn b nh nhõn Chớnh vỡ v y m t phũng thớ nghi m ch n ủoỏn ph i l phũng thớ nghi m khụng ch cho k t qu chớnh xỏc m cũn ph i cho k t qu k p th i ủ n tay ng i lm xột nghi m Vi c ng d ng PCR v real-time PCR ch n ủoỏn ủó tr nờn ngy cng d dng vỡ ủõy l m t cụng ngh m , phũng thớ nghi m cú th t pha ch cỏc thu c th ủ th c hi n th nghi m Ngoi ra, nhu c u s d ng PCR v real-time PCR ch n ủoỏn ngy cng nhi u vỡ cú nhi u tỏc nhõn gõy b nh ch cú th ch n ủoỏn hay theo dừi ủ c b ng cụng ngh PCR v real-time PCR Khụng ch v y, hi n trờn th gi i, cụng ngh PCR ch n ủoỏn s p h t b n quy n nờn ủang cú s bựng n cỏc s n ph m ch n ủoỏn d a trờn cụng ngh PCR v real-time PCR ủ c nhi u hóng s n xu t cung c p Do v y, cú th núi PCR hi n khụng cũn bú h p cỏnh c a c a cỏc phũng thớ nghi m nghiờn c u m ủó d n d n xõm nh p vo cỏc phũng thớ nghi m ch n ủoỏn 115 Tuy nhiờn vi c ỏp d ng PCR v real-time PCR ch n ủoỏn cng ủũi h i ng i lm thớ nghi m ph i bi t quan tõm ủ n cỏc v n ủ k thu t cú liờn quan ủ k t qu xột nghi m ủ t ủ c ủ chớnh xỏc cao, v ủ t ủ c ủ nh y c m t v i ủỳng nh b n ch t c a PCR v real-time PCR, v ph i k p th i ủ n tay ng i ch ủ nh xột nghi m Cỏc v n k thu t c n quan tõm ỏp d ng PCR v real-time PCR ch n oỏn Ti n trỡnh xột nghi m PCR v real-time PCR K t l y m u th g i ủ n phũng thớ nghi m ủ lm xột nghi m PCR hay real- time PCR ch n ủoỏn cho ủ n k t qu xột nghi m ủ n tay ng i cho ch ủ nh xột nghi m, ti n trỡnh s qua cỏc b c m m i b c ủ u cú nhng v n ủ k thu t r t c n ủ c quan tõm b i ng i lm xột nghi m, ng i l y m u xột nghi m, v ng i nh n ủ s d ng k t qu xột nghi m ny S ủ d i ủõy trỡnh by cỏc b c L y v chuy n m u th ủi lm xột nghi m PCR/realtime PCR Cỏc v n ủ k thu t l y v g i m u th Chu n b m u th v tỏch chi t nucleic acid t m u th Cỏc v n ủ k thu t tỏch chi t nucleic acid (NA) Th c hi n ph n ng khu ch ủ i nucleic acid (PCR/real-time PCR) Cỏc v n ủ k thu t khu ch ủ i NA Lm thớ nghi m ủ ủ c k t qu Phõn tớch k t qu Cỏc v n ủ k thu t thớ nghi m ủ c KQ v phõn tớch KQ S d ng k t qu xột nghi m PCR/real-time PCR V n ủ ngn ng a nhi m chộo v lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i m t ti n trỡnh xột nghi m Cỏc v n ủ k thu t s d ng k t qu S
ủ 3: Ti n trỡnh m t xột nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn v cỏc v n ủ k thu t c n ủ c quan tõm 116 Cỏc v n k thu t c n quan tõm a Cỏc v n ủ k thu t c n quan tõm l y v g i m u th Ă9 B M u th ủ c l y lm xột nghi m PCR/real-time PCR l cỏc m u ủ c l y t v t ch t i ni m ng i l y m u cho l cú th cú s hi n di n c a nucleic acid c a tỏc nhõn ủớch, v y ph i l y m u th ủỳng ch Vớ d ủ phỏt hi n M tuberculosis gõy lao ph i trờn b nh nhõn thỡ m u th ph i l y l ủm hay d ch hỳt t r a khớ/ph qu n, khụng th l y mỏu hay huy t Hay mu n phỏt hi n Cytomegalovirus b nh nhõn thỡ m u th t t nh t l mỏu tũan ph n ủ tỏch huy t tng hay tỏch b ch c u, khụng th l mỏu ủụng ủ tỏch huy t ủ c V t li u dựng ủ l y v gi m u th cng ph i ủ c quan tõm vỡ n u khụng, cỏc nucleic acid c a tỏc nhõn ủớch cú m u s b phõn h y hay m u th s ch a cỏc ch t c ch ph n ng khu ch ủ i sau ny Do v y v t li u t t nh t ủ l y v gi m u th l cỏc v t li u tinh s ch v m t sinh h c, ngha l khụng nhi m cỏc protein hay cỏc nuclease ti t t cỏc vi sinh v t nh endonuclease, ribonuclease; v ch s d ng m t l n, khụng nờn ủ c r a xi l i Hỡnh 59 mụ t m t s v t li u nờn ủ c s d ng ủ l y v gi cỏc m u th lm xột nghi m PCR/qPCR Cỏc v t li u ny hiờn cú s n t i cụng ty Nam Khoa Hỡnh 59: Cỏc l v tube nh th ny nờn ủ c s d ng ủ l y v gi cỏc m u th lm xột nghi m PCR/qPCR b o qu n v chuyờn ch m u thỡ v n ủ k thu t c n quan tõm l lm th no m u gi nguyờn tr ng, nucleic acid c a tỏc nhõn ủớch khụng b phõn h y quỏ trỡnh b o qu n Do v y ủ i v i cỏc m u m nucleic acid ủớch c n phỏt hi n l DNA thỡ cú th b o qu n ng n ngy (trong vũng 48 gi ) t mỏt 2-8oC, cũn n u b o qu n lõu di thỡ c n gi -18oC ủ n -30oC i v i RNA, n u l cỏc m u ớt hay khụng b t p nhi m nh mỏu, d ch c th thỡ cú th b o qu n 48 gi 2-8oC, nhng ủ i v i cỏc m u II t p nhi m nhi u nh qu t h ng, qu t mi sau tỡm virus, ủm hay c n b o qu n di ngy thỡ ph i gi m u -70oC chuyờn ch m u thỡ ch c n chuyờn ch thựng l nh v i th i gian chuyờn ch khụng quỏ 48 gi N u th i gian chuyờn ch lõu hn thỡ r t c n ph i gi ủỏ khụ Núi chung, cỏc v n ủ k thu t ủ c nờu lờn l ch nh m m t m c tiờu, ủú l l y m u cho ủỳng ch l ni cú s hi n di n c a nucleic acid ủớch mu n tỡm, ph i gi v chuyờn ch m u th ủ n phũng thớ nghi m ủi u ki n cho nucleic acid mu n tỡm khụng b phõn h y cng nh m u th khụng b nhi m cỏc ch t sinh h c gõy c ch ph n ng khu ch ủ i v m u th khụng bi nhi m chộo b Cỏc v n ủ k thu t chu n b m u th v tỏch chi t nucleic acid Trong khõu ny, m c tiờu chớnh l ph i lm tỏch chi t ủ c t i nucleic acid ủớch dự l ng nucleic acid c a tỏc nhõn ủớch cú nh v cú b pha loóng quỏ th p m u th Tỏch chi t thu ủ c ph i tinh t, khụng l n cỏc protein hay ch t gõy c ch ph n ng khu ch ủ i Tựy lo i m u th v cng tựy lo i tỏc nhõn ủớch cú m u th m cú nh ng m u th cú th vo tỏch chi t nucleic acid ngay, nhng cng cú nh ng m u th c n ph i ủ c chu n b tr c vo tỏch chi t nueic acid (NA) Vớ d cỏc m u th nh huy t thanh, huy t tng, c y t bo v i cỏc tỏc nhõn ủớch nh virus hay cỏc vi khu n cú c u t o t bo khụng ủ c bi t thỡ cú th vo tỏch chi t nuleic acid ngay, nhng v i cỏc m u th nh m u mụ, m u sinh thi t hay cỏc vi khu n cú c u t o t bo ủ c bi t nh M tuberculosis, n m men, n m s i, mụ th c v t nh cõy-lỏ-r -hoa thỡ c n ph i ủ c vo chu n b tr c ủ cỏc c u trỳc c a mụ tan ủi (vd ph i s lý proteinase K), ủ t bo v (vd dựng cỏc ch t t y TRITON X100, hay tỏn siờu õm, hay nghi n nitrogen l ng ), hay nh tr ng h p cỏc lỏt c t sinh thi t ủỳc sỏp thỡ c n ph i lo i b sỏp kh i mụ, ho c cỏc m u cú cỏc ch t nh y nh ủm thỡ c n ph i lm tan nh y (b ng NALC ) tr c vo tỏch chi t nucleic acid Do v y, ng i lm xột nghi m c n ph i bi t khụng ch cỏc m u th no c n ph i qua giai ủ an x lý m u tr c tỏch chi t NA m cũn ph i bi t ph i s d ng phng phỏp gỡ v i qui trỡnh k thu t nh th no 118 Tựy lo i m u th ; tựy lo i tỏc nhõn ủớch l vi khu n, virus, vi n m, hay t bo cú nhõn; v tựy NA ph i tỏch chi t l DNA hay RNA m ph i l a ch n phng phỏp tỏch chi t cho phự h p, khụng nờn l n l n Vớ d phng phỏp Boom r t t t ủ tỏch chi t cỏc d ch sinh h c hay cỏc m u th ớt l n DNA c a v t ch vỡ nguyờn t c l d a vo s h p ph c a DNA trờn h t silica, nờn n u m u cú quỏ nhi u DNA v t ch nh cỏc mụ sinh thi t thỡ DNA tỏc nhõn ủớch s b c nh tranh khụng bỏm ủ c vo h t silica Do v y, ủ tỏch chi t DNA cho cỏc m u th l mụ v sinh thi t thỡ nờn ch n phng phỏp phenol/chloroform hn l phng phỏp BOOM Cng khụng th s d ng phng phỏp tỏch chi t cho RNA vo ủ tỏch chi t DNA, v y m chỳng ta th y phng phỏp BOOM r t t t cho tỏch chi t DNA nhng l i r t kộm cho tỏch chi t RNA Khi l a ch n phng phỏp hay b thu c th tỏch chi t cho tỏc nhõn virus hay vi khu n ủớch, cng ph i xem k b tỏch chi t hay phng phỏp tỏch chi t NA m mỡnh ủang l a ch n cú ỏp d ng ủ c cho vi khu n hay virus khụng? Vỡ cú s th t b i xột nghi m PCR l nh ng s vụ ý ny Tỏch chi t NA l m t khõu r t quan tr ng; tỏch chi t NA ph i ủ m b o ủ c ủ nh y thỡ xột nghi m PCR m i cú th ủ t ủ c ủ nh y mong mu n Do v y t pha m t b thu c th tỏch chi t NA hay s n xu t m t b thu c th tỏch chi c NA, tr c vo s d ng xột nghi m PCR/real-time PCR, phũng thớ nghi m hay nh s n xu t ph i ki m tra ch t l ng ủ xem b tỏch chi t cú ủ m b o ủ c ủ nh y hay khụng Phng phỏp ki m tra l ph i th trờn cỏc ủ pha lừang c a m t tỏc nhõn ủớch (l ủ i t ng m phũng thớ nghi m hay ng i dựng s ph i s d ng b tỏch chi t NA ủ th c hi n xột nghi m) hay c a m t tỏc nhõn khỏc tng ủng t ủ nh y l b tỏch chi t NA th nghi m trờn cỏc ủ pha loóng tỏc nhõn ủớch ny ph i ủ t ủ c gi i h n phỏt hi n (limit of detection, LOD), t c l ủ t ủ c s l ng vi khu n ủớch th p nh t cú m t ủn v th tớch m u th m phng phỏp hay b th nghi m cú th tỏch chi t v phỏt hi n ủ c Minh h a d i ủõy (hỡnh 60) l m t k t qu ki m tra ch t l ng b kit tỏch chi t DNA tờn l NK DNAPREP-BOOM cụng ty Nam Khoa s n xu t v ủ c ki m tra ch t l ng Phng phỏp ki m tra l s d ng cỏc ủ pha loóng c a vi khu n M tuberculosis, cho vo tỏch chi t DNA v i b thu c th ủó s n xu t ủ ng th i so sỏnh NK DNAPREP-BOOM ủ c s n xu t tr c ủú K t qu ki m tra cho Ê v i b thu c th th y b thu c th NK DNAPREP-BOOM m i s n xu t v b thu c th NK DNAPREP- BOOM s n xu t tr c ủú ủ u ủ t ủ c kh nng tỏch chi t vi khu n ủớch ủ n ủ pha lừang 10-4, ch a vi khu n m t th tớch 100àl d ch vi khu n vo tỏch chi t Trong phng phỏp ny n u huy n d ch vi khu n cú b gi m ch t l ng thỡ k t qu ki m tra v n cú th ủ c ủ c nh cú so sỏnh NK DNAPREP-BOOM m i s n xu t v i NK DNAPREP-BOOM s n xu t lụ tr c ủú v lụ ny ủó ủ t ch t l ng Hỡnh 60: K t qu ki m tra ch t l ng b thu c th NKDNAPREP-BOOM cụng ty Nam Khoa s n xu t i t ng dựng ủ ki m tra b thu c th l huy n d ch vi khu n M tuberculosis TB1 ch a 10.000 t bo vi khu n/ml ủ c pha loóng theo h s 10 ủ cú 1,000 t bo vi khu n/ml (T2), 100/ml (T3), 10/ml (T4), v NK 1/ml (T5) Phng phỏp ki m tra l s d ng b thu c th DNAPREP-BOOM c n ki m tra v b NK DNAPREP-BOOM ủ c s n xu t tr c ủú ủ th c hi n tỏch chi t trờn cỏc huy n d ch vi khu n ủó pha loóng ny, th tớch huy n d ch ủ tỏch chi t l 100àl, r i l y 10àl d ch tỏch chi t ủ ch y PCR phỏt hi n M tuberculosis Phỏt hi n DNA c a M tuberculosis cú d ch tach chi t qua ủi n di phỏt hi n s n NK ph m khu ch ủ i 249bps K t qu cho th y c hai b thu c th DNAPREP-BOOM m i v c ủ u ủ t LOD l t bo vi khu n M tuberculosis th tớch tỏch chi t Khụng ch ki m tra ch t l ng cỏc b thu c th tỏch chi t NA ủ c pha ch tr c s d ng, m c m i l n s d ng ủ lm xột nghi m, b thu c th tỏch chi t cng ph i ủ c ki m soỏt ủ nh y b ng cỏch cho nucleic acid ch ng n i t i n ng ủ LOD vo m u ch ng [-] v n u mu n, cú th cho vo m u th ủ ủ c th c hi n tỏch chi t cựng lỳc v i cỏc m u th (xem ph n ch ng n i t i) c Cỏc v n ủ k thu t khu ch ủ i nucleic acid ủớch V nguyờn t c thỡ PCR/real-time PCR ủ t ủ c ủ nh y r t cao, nhiờn trờn th c t thỡ ủ nh y cũn tựy thu c r t nhi u vo s thi t k hay ch n l a m i; vo thi t b luõn nhi t; vo húa ch t, ủ c bi t l enzyme Taq polymerase ủ c s d ng Khõu 120 khu ch ủ i s r t khú ủ t ủ c ủ nh y v trỡ ủ nh y quỏ trỡnh lu tr n u nh s n xu t hay ng i lm thớ nghi m khụng ch n l c Taq polymerase ủ s d ng Ngoi cỏc y u t k thu t c n ph i quan tõm trờn, ủ ủ m b o ủ c ủ nh y c a khõu khu ch ủ i, n u t pha hay s n xu t PCR mix cho ph n ng khu ch ủ i, ng i lm thớ nghi m hay nh s n xu t ph i ki m tra ủ nh y c a cỏc PCR mix tr c vo s d ng Phng phỏp ki m tra l th nghi m trờn cỏc ủ pha lừang c a DNA ủớch ủó bi t tr c s l ng copy m t ủn v th tớch PCR mix ủ c g i l ủ t ủ nh y ủ t ủ c gi i h n phỏt hi n (LOD) l m t copy DNA ủớch cho vo PCR mix, ngha l th tớch m u cho vo PCR mix ch c n cú copy DNA ủớch l cú th cho k t qu khu ch ủ i thnh nhi u b n cú th phỏt hi n ủ c phõn tớch k t qu (xem m c ki m tra ủ nh y c a PCR mix ủó pha bi PCR-cỏc v n ủ c b n) 10 100 1,000 10,000 Bi u ủ 16: K t qu ki m tra ch t l ng real-time PCR mix s d ng m i v Taqman probe ủ nh l ng HBVDNA K t qu ki m tra cho th y ủ nh y c a PCR mix ủ t LOD copy HBV-DNA m t th tớch m u cho vo PCR mix Cỏc ủ ng bi u di n mu xanh sỏng l ủ ng bi u di n khu ch ủ i c a ch ng n i t i ủ c cho vo PCR mix n ng ủ LOD cựng v i m u ki m tra Bi u ủ 16 minh h a m t k t qu ki m tra ch t l ng real-time PCR mix dựng m i v Taqman probe ủ phỏt hi n v ủ nh l ng HBV-DNA cụng ty Nam Khoa s n xu t K t qu ki m tra cho th y ủ nh y c a PCR mix ủ t LOD l copy cho m t th tớch m u cho vo PCR mix, ủõy chớnh l ủ nh y ủũi h i c a PCR/real-time PCR ch n ủoỏn 121 Ngoi vi c ki m tra ch t l ng cỏc PCR mix tr c vo s d ng, ng i lm xột nghi m th c hi n xột nghi m PCR cng ph i ki m soỏt cho ủ c ủ nh y c a PCR mix ủ c s d ng m i l n lm xột nghi m Th c hi n v n ủ ki m soỏt ny l m t ủi u ki n b t bu c vỡ dự PCR mix cú ủ c ki m tra ủ t ch t l ng sau pha ch hay s n xu t, v n cú th gi m ch t l ng quỏ trỡnh lu tr hay b o qu n, ủ c bi t ủ c pha ch b ng ngu n Taq polymerase khụng ủ m b o ch t l ng Cú nhi u cỏch ủ ki m soỏt ch t l ng PCR mix m i lm xột nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn Cú th s d ng ch ng [+] l DNA ủớch ủ c pha s n hay ủ c nh s n xu t cung c p n ng ủ LOD cho vo PCR mix m i l n lm xột nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn, hay cú th s d ng DNA ch ng n i t i s d ng chung m i ủ c pha n ng ủ LOD cho vo PCR chung v i tỏch chi t DNA t m u ủ ki m soỏt c ch PCR v ủ ng th i ki m soỏt ủ nh y c a PCR mix (xin xem thờm cỏc m c ch ng n i t i, ch ng dng, v ch ng õm ph n cỏc chu n m c v ki m soỏt ch t l ng cho xột nghi m PCR/real-time PCR dnh cho ch n ủoỏn) d Ng a nhi m chộo v lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i Mu n s d ng PCR/real-time PCR ch n ủoỏn, ng i lm xột nghi m ph i nh n di n ủ c ủ cú cỏc bi n phỏp k thu t ngn ng a hay lo i tr cỏc nguy c ngo i nhi m lm cho m u th khụng cú tỏc nhõn ủớch l i b cú k t qu dng tớnh lm xột nghi m, ngha l b nguy c dng tớnh gi Ngo i nhi m xột nghi m PCR/realtime PCR ch n ủoỏn cú th xóy hai nguyờn Nguyờn th nh t l nhi m chộo lm cho m u õm hay cỏc thu c th lm xột nghi m b nhi m nucleic acid ủớch t cỏc m u dng V i nguyờn ny thỡ ng i lm thớ nghi m hũan tũan cú th phũng ng a ủ c b ng cỏc b trớ phũng thớ nghi m m t cỏch h p lý v i cỏc phng ti n v thi t b phự h p, vớ d thi t k ủ khu v c pha cỏc thu c th cỏch xa khu lm m u; khụng ủ l n l n cỏc thu c th ủó pha v ủang dựng v i cỏc nguyờn li u v dung d ch s ủ c dựng ủ pha thu c th ; cỏc d ng c v ti li u dựng khu v c lm m u khụng ủ c ủem qua khu v c pha thu c th ; khụng ủ phũng thớ nghi m vi sinh nuụi c y tỏc nhõn ủớch phũng thớ nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn phỏt hi n ủỳng tỏc nhõn ủú Ngoi cỏch b trớ phũng thớ nghi m lm vi c cho h p lý, ng i lm xột nghi m PCR/real-time PCR ph i ủ c 122 hu n luy n ủ nhu n nhuy n cỏc thao tỏc vụ trựng ủ c bi t ủúng m tube, chai l , thao tỏc pipetting, b trớ cỏc v t li u v d ng c thao tỏc i v i nguyờn th hai l ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i thỡ ch v i cỏc gi i phỏp k thu t nh ủó nờu trờn v n khú cú th trỏnh ủ c nguy c ny, lý l m t phũng xột nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn, s n ph m PCR s tớch t ngy cng nhi u v ch c ch n khụng s m thỡ mu n cỏc s n ph m PCR ny s nhi m vo cỏc d ng c , thu c th , thi t b v ủ n m t lỳc no ủú ng i lm xột nghi m s nh n d ng ủ c th m h a ny cỏc m u xột nghi m PCR ủ u cho k t qu dng tớnh n lỳc ny thỡ ch cú m t gi i phỏp l ủ b tũan b thu c th , kh nhi m tũan b phũng thớ nghi m, ủúng c a vi thỏng R i l i m c a lm l i, r i th m h a tỏi xu t hi n Mụ t nh v y ủ chỳng ta th y r ng khụng th cú bi n phỏp no hi u qu ủ ng a ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i, m ch cú m t cỏch nh t ủú l ph i lo i tr ủ c nguy c ny lm ủ c ủi u ny thỡ cỏch nh t l phũng thớ nghi m PCR ch n ủoỏn t ủ u ph i s d ng cỏc PCR mix cú pha thờm dUTP v UNG C ch lo i tr ủ c ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i b ng dUTP v UNG ủó ủ c núi chi ti t m c lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i c a bi PCR-cỏc v n ủ c b n Qua phõn tớch nh trờn, chỳng ta th y l n u mu n lm ủ c xột nghi m PCR ch n ủoỏn, khụng th khụng s d ng bi n phỏp dựng PCR mix cú pha dUTP v UNG N u khụng ỏp d ng bi n phỏp ny, khụng s m thỡ mu n, th m h a ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i s xóy Tuy nhiờn cng cú cỏc v n ủ k thu t dựng dUTP v UNG vỡ n u khụng ch n ủ c enzyme UNG hi u qu v phự h p thỡ ủ nh y c a PCR/real-time PCR s gi m v/hay khụng th cú hi u qu lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i Chớnh vỡ v y ng i s d ng ph i ki m tra ủ nh y v ki m tra kh nng lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i c a PCR mix ủ c cụng b l cú dUTP v UNG Hi n t t c cỏc hóng n c ngoi s n xu t cỏc PCR mix dựng cho PCR/real-time PCR ch n ủoỏn ủ u s d ng dUTP v UNG T i Vi t Nam, cụng ty Nam Khoa l cụng ty tiờn phong v hng ủ u ỏp d ng gi i phỏp ny T t c cỏc b thu c th PCR/real-time PCR dựng ch n ủoỏn cụng ty Nam Khoa s n xu t ủ u s d ng PCR mix cú dUTP v UNG b ng ngu n húa ch t ch n l c ủ ủ m b o khụng gi m ủ nh y m hi u qu lo i tr ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i v n cao v i b ng ch ng ki m tra ch t l ng v ủ nh y luụn ủi kốm v i s n ph m 123 e Cỏc v n ủ k thu t th nghi m ủi n di trờn th ch ủ ủ c k t qu i v i phng phỏp PCR c ủi n thỡ mu n ủ c ủ c k t qu , ng i lm thớ nghi m ph i lm ti p thớ nghi m ủ xỏc ủ nh ủ c ng ph n ng cú s n ph m khu ch ủ i ủ c hi u hay khụng Phng phỏp th ng ủ c ỏp d ng nh t cỏc phũng thớ nghi m PCR ch n ủoỏn l dựng k thu t ủi n di ủ xỏc ủ nh kớch th c s n ph m khu ch ủ i cú ủỳng nh kớch th c mong mu n hay khụng Chớnh vỡ ủõy l phng phỏp th ng ủ c s d ng nh t, nờn chỳng tụi xin ủõy m t s v n ủ k thu t c n ủ c ng i lm thớ nghi m quan tõm Ch n t l % agarose ủ ủi n di cho phự h p v i kớch th c s n ph m khu ch ủ i Trung bỡnh nh t l dựng t l 2% i v i cỏc s n ph m khu ch ủ i l n trờn 500bps thỡ nờn dựng agarose 1.5%, cũn ủ i v i cỏc s n ph m khu ch ủ i kớch th c d i 100bps thỡ nờn dựng agarose trờn 2.5% Khi pha gel agarose, lu ý l ph i lm tan hũan tũan agarose ủ m ủi n di, v ủ lm ủ c ủi u ny ph i cho agarose vo bỡnh ủó cú s n m t ớt dung d ch ủ m di n di, nh v y trỏnh agarose b bỏm vo ủỏy bỡnh r i s khụng tan ủ c sau ủun Tr c cho vo lũ vi súng ph i l c tr n ủ agarose hũa ủ u dung d ch ủ m Khi ủun, ph i ớt nh t hai l n l y bỡnh kh i lũ vi súng ủ l c tr n ủ u r i m i cho vo ủun ti p Ph i ủ m b o agarose tan ủ u dung d ch ủ m, khụng cũn th y l n c n dự r t nh Cú nh v y m i cú k t qu ủi n di t t Tr c ủ agarose vo khuụn, ph i ủ m b o khuụn n m trờn m t ph ng n m ngang ki m tra b ng búng khớ ủ b dy c a agarose th t s dy ủ u nh v k t qu ủi n di s chớnh xỏc hn Trong PCR ch n ủoỏn, khụng nờn tr n ủ m t i v i s n ph m PCR trờn gi y paraffin vỡ lm nh v y s gõy nguy c ngo i nhi m Nờn cho ủ m t i v i th tớch b ng ẳ th tớch c a dung d ch ph n ng cú tube PCR r i tr n tube Th tớch m u cho vo gi ng khụng nờn quỏ ớt m ph i t 15àl tr lờn vỡ cú nh v y m i cú th phỏt hi n ủ c cỏc k t qu [+] y u Luụn ủi n di kốm v i thang DNA vỡ ủõy l m t chu n khụng ch dựng ủ xỏc ủ nh kớch th c c a cỏc v ch ủi n di cỏc m u m cũn l m t chu n ủ ki m 124 Ch ng [ ] cho PCR mix E nh ngha: Ch ng [-] cho PCR mix l m u n c tinh s ch hay TE 1X ủ c cho vo PCR mix m i l n lm xột nghi m PCR/real-time PCR ch n ủoỏn Vai trũ: Ch ng [-] cho PCR mix nờn ủ c cho vo m t PCR mix cho m i l n ch y PCR, v cho vo cu i cựng sau ủó cho m u v ch ng [+] vo cỏc PCR mix tng ng vỡ cỏc m c ủớch sau: Ch ng minh thao tỏc cho m u v ch ng [+] vo cỏc PCR mix khụng b nhi m chộo hay khụng b nhi m s n ph m khu ch ủ i vỡ n u ch ng [-] cho PCR mix l i cú k t qu [+] s n ph m khu ch ủ i thỡ cú th cỏc thao tỏc trờn b nhi m chộo hay ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i Ch ng minh PCR mix ủang s d ng l hon ton tinh s ch khụng b nhi m cỏc DNA ngo i lai vỡ n u ch ng [-] l i cú k t qu s n ph m khu ch ủ i khụng ủ c hi u [+] thỡ ch ng t PCR mix ủó b nhi m cỏc DNA ngo i lai Tuy nhiờn ch ng [-] cho PCR mix khụng ki m tra ủ c ton b qui trỡnh th c hi n th nghi m PCR cú b ngo i nhi m s n ph m khu ch ủ i hay nhi m chộo khụng Mu n ki m tra ủ c ton b qui trỡnh th c hi n th nghi m PCR thỡ ng i th c hi n th nghi m ph i th c hi n qui trỡnh PCR trờn m t m u th ủó bi t tr c [-] tớnh v th c hi n song song v i cỏc m u b nh ph m Vỡ cỏc m c ủớch nh v y nờn th c hi n th nghi m PCR, ng i th c hi n th nghi m nờn luụn ủ dnh m t PCR mix ủ cho ch ng [-] Ch ng n i t i (Internal control, IC) nh ngha: L DNA ủ c khu ch ủ i song song v i DNA ủớch nhng cho s n ph m khu ch ủ i cú: (1) kớch th c khỏc (trong PCR kinh ủi n) s n ph m khu ch ủ i c a DNA ủớch nh v y cú th phõn bi t ủ c ủi n di; v/hay (2) trỡnh t khỏc hon ton hay khỏc m t ph n (trong PCR-ELISA hay real-time PCR) nh v y cú th phõn bi t ủ c s d ng dũ ủ c hi u (specific probe) Cỏc lo i ch ng n i t i: Cú lo i ch ng n i t i sau ủõy, tựy ngu n g c v thi t k : Ch ng n i t i l DNA b gen v t ch (hỡnh 63-A), vớ d globin gene n u b nh ph m l mụ l y t ng i, hay myoglobin gene c a tụm n u b nh ph m l cỏc 131 m u tụm sỳ cú th khu ch ủ i ủ c DNA ch ng n i t i, chỳng ta ph i cho thờm vo PCR mix m t c p m i ủ c hi u v i DNA ch ng n i t i v nờn thi t k m i cho nhi t ủ b t c p tng t nhi t ủ b t c p c a m i dnh cho DNA ủớch, v khụng t o cỏc dimer primer v i m i c a DNA ủớch Do s d ng DNA b gene v t ch nờn ch ng n i t i ny ki m soỏt ủ c m u th cú ủ khụng, ki m soỏt ủ c h th ng tỏch chi t nucleic acid trờn m u th cú t t khụng, ki m soỏt ủ c c ch cú hay khụng Tuy nhiờn lo i ch ng n i t i ny khụng ki m soỏt ủ c h th ng khu ch ủ i DNA ủớch vỡ dựng m i khỏc bi t v ch dựng cho m t s b nh ph m cú ch a ủ l ng t bo mụ v t ch B A D C Hỡnh 63: Cỏc l ch ng n i t i (A) l b gene v t ch ; (B) l DNA t ng h p cú ngu n g c t DNA ủớch; (c) DNA t ng h p cú ngu n khỏc DNA ủớch nhng s d ng cựng m i DNA ủớch; (D) DNA khỏc bi t hũan tũan v i DNA ủớch Ch ng n i t i l DNA t ng h p cú ngu n g c l DNA ủớch (hỡnh 63-B), ủú l DNA ủ c t ng h p b ng cỏch dựng ủỳng s n ph m khu ch ủ i c a DNA ủớch nhng c t ng n ủi hay chốn m t ủo n DNA nh ủ lm cho nú di hn Ch ng n i t i lo i ny s d ng cựng m i v i DNA ủớch nờn khụng c n thi t k m i ủ cho thờm vo PCR mix Ch ng n i t i l DNA t ng h p cú ngu n g c khỏc DNA ủớch nhng s d ng cựng m i v i DNA ủớch (hỡnh 63-C), ủú l DNA ủ c t ng h p b ng cỏch dựng 132 s n ph m khu ch ủ i c a DNA khỏc bi t v i DNA ủớch nhng chốn hai ủ u cỏc trỡnh t gi ng h t trỡnh t m i c a DNA ủớch Do s d ng cựng m i v i DNA ủớch nờn khụng c n thi t k m i ủ cho thờm vo PCR mix Ch ng n i t i l m t h th ng m i v DNA khỏc bi t v i DNA ủớch (hỡnh 63D), c khu ch ủ i song song v i DNA ủớch nhng dựng m i khỏc bi t DNA ủớch v DNA ch ng n i t i cú ngu n g c khỏc bi t hon ton v i DNA ủớch cú th khu ch ủ i ủ c DNA ch ng n i t i, ph i cho thờm vo PCR mix m t c p m i ủ c hi u v i DNA ch ng n i t i v nờn thi t k m i cho nhi t ủ b t c p tng t nhi t ủ b t c p c a m i dnh cho DNA ủớch, v khụng t o cỏc dimer primer v i m i c a DNA ủớch Vai trũ ch ng n i t i: Tu ủ c cho vo cỏc giai ủo n no m ch ng n i t i cú th ủ c dựng cho cỏc vai trũ sau: Ki m soỏt ủ c s tỏch chi t trờn m u b nh ph m t t hay khụng n u ủ c cho vo b nh ph m l ng t i thi u v a ủ (LOD) hay cú s n b nh ph m Ki m soỏt ủ c c ch ủ xỏc ủ nh ủ c k t qu l õm tớnh th t hay õm tớnh gi cú c ch cũn hi n di n cỏc m u tỏch chi t n u ủ c cho vo PCR mix n ng ủ LOD tr c hay sau cho tỏch chi t DNA t b nh ph m Ki m soỏt ủ c h th ng khu ch ủ i DNA ủớch cú ủ t ủ c ủ nh y hay khụng n u ch ng n i t i dựng chung m i v i DNA ủớch v hi n di n m u th hay cho vo PCR mix n ng ủ LOD Ki m soỏt ủ c h th ng tỏch chi t ủang dựng cú t t hay khụng v thao tỏc cú ngo i nhi m khụng n u cú s n m u th t lm ch ng õm hay ủ c cho vo m u th t lm ch ng õm ủ ủ c tham gia tỏch chi t cựng v i m u b nh ph m h Cỏc v n ủ k thu t c n bi t ủ c v phõn tớch m t k t qu real-time PCR ủ nh l ng s d ng m i v taqman probe Sau hũan t t chng trỡnh ch y real-time PCR trờn mỏy, phõn tớch ủ cú k t qu ủ nh l ng chớnh xỏc l m t v n ủ r t quan tr ng ủũi h i ng i phõn tớch ph i hi u rừ cỏc v n ủ lý thuy t cng nh k thu t real-time PCR ủõy chỳng tụi xin trỡnh by cỏc b c phõn tớch m t k t qu real-time PCR v i m i ủ c hi u v Taqman probe g n mu FAM phỏt hựynh quang dnh phỏt hi n/ủ nh l ng DNA ủớch, cũn 133 Taqman probe g n mu Hex phỏt hựynh quang dnh phỏt hi n s n ph m khu ch ủ i t ch ng n i t i s d ng chung m i DNA ủớch Phõn tớch k t qu nờn theo cỏc b c sau : Ch ch n gi ng ủ phõn tớch l gi ng ch ng [-] ƠÔ Tr c h t ch n gi ng ch ng Ch n kờnh hựynh quang Fam, chỳng ta s th y gi ng ch ng [-] cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i khụng v t qua kh i ủ ng hựynh quang n n (baseline) t c l õm tớnh N u kờnh Fam m ch ng [-] cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i v t qua kh i baseline (dng tớnh) thỡ cú nguy c ngo i nhi m quỏ trỡnh cho m u vo cỏc PCR mix B kờnh hựynh quang Fam, ch n kờnh hựynh quang Hex, lỳc ny ch ng [-] cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i v t qua kh i baseline (dng tớnh) N u kờnh Hex m ch ng [-] cho ủ ng bi u di n khu ch ủ i khụng v t qua kh i baseline (õm tớnh) thỡ cng cú nguy c l PCR mix khụng ủ nh y c m cho khu ch ủ i/phỏt hi n DNA ch ng n i t i hay ch ng n i t i cho vo b h (khi ủú t t c cỏc gi ng khỏc, ủ ng bi u di n khu ch ủ i kờnh Hex ủ u õm tớnh, tỡnh hu ng ny ph i yờu c u nh s n xu t cung c p l i ch ng n i t i) nh ủ ng chu n: Ch ch n kờnh hựynh quang Fam l kờnh hựynh quang cho taqman probe c a DNA ủớch, khụng Hex ch n Ch n kờnh cỏc gi ng chu n v gi ng ch ng [-], ủ ng th i lo i tr cỏc gi ng cú m u th cng nh cỏc gi ng khỏc Sau ủú cho cỏc giỏ tr s b n (copies) DNA ủớch chu n ban ủ u Bi u ủ 17: M t bi u ủ chu n ủ c ủỏnh giỏ ủ t cú E kh ang 90-105%, cũn R20.99 Ph i cú bi u ủ chu n ủ t m i ti p t c phõn tớch k t qu vo cỏc gi ng ch a cỏc ủ pha loóng DNA chu n Sau ủó cho cỏc giỏ tr s copies vo cỏc gi ng chu n, chỳng ta ủ mỏy ch n ủ ng baseline theo ch ủ t ủ ng ủ cú bi u ủ chu n (g i l standard graph) N u ủ ng baseline m mỏy ch n theo ch ủ t ủ ng c t ph i ủ ng bi u di n c a ch ng [-] thỡ ng i s d ng tr c h t ch nh baseline cycle (cỏc chu k n n) c a gi ng ch ng [-] ủ xem ủ ng bi u di n ch ng [-] cú h 134 xu ng khụng, n u khụng ủ c thỡ cú th ph i nõng ủ ng baseline lờn ủ ủ ng baseline ny khụng c t ủ ng bi u di n c a ch ng õm ỏnh giỏ bi u ủ chu n lý t ng nh t (bi u ủ 17) l bi u ủ cho h s tng quan (R) l 0.990; ủ ng th i hi u qu PCR (PCR efficiency = E) t 90% ủ n 105%, ủ d c (slope) c a ủ ng bi u di n kh ang -3.4 ủ n -3.6 N u ủ ng bi u di n khụng ủ t thỡ chỳng ta, tr c h t xem l i t ng gi ng chu n ủ ủi u ch nh baseline cycle c a t ng gi ng k t h p v i vi c nõng lờn hay h xu ng ủ ng baseline ủ cú th cỏc giỏ tr R v E v cỏc tr s lý t ng N u v n cha ủ c R v E v cỏc giỏ tr lý t ng thỡ cú th thay ủ i giỏ tr c a cỏc tr s copies kh ang cho phộp khụng quỏ m t ủ pha lừang (vớ d n u giỏ tr ghi l 10 copies, cú th thay giỏ tr t 10 ủ n 99; hay n u giỏ tr ghi l 100 thỡ cú th thay giỏ tr t 100 ủ n 999) ủ chỳng ta cú ủ c ủ ng bi u di n chu n ủ t lý t ng (tuy nhiờn ch lm cỏch ny m t cỏch b t kh khỏng thụi vỡ th t n u ph i thay ủ i giỏ tr s copies chu n cú ngha l chỳng ta ủó ph i ch p nh n sai s thao tỏc pipetting r i, m n u ch p nh n nh v y thỡ chỳng ta cng s ph i ch p nh n cú sai s k t qu ủ nh l ng) Chuy n bi u ủ khu ch ủ i sang d ng log ủ c ủ nh ủ c ủ ng n n r i sau ủú chuy n l i d ng graph bỡnh th ng Ghi nh n tr s baseline c a ủ ng chu n Lu ý: Vi c th c hi n PCR cỏc m u chu n cú hai ý ngh a: (1) Cho ủ c ủ ng chu n ủ lm c s tớnh toỏn s copies ban ủ u c a m u th ; (2) Ki m soỏt ủ c thao tỏc pipetting c a ng i lm thớ nghi m cú t t khụng, qua tr s R v E cú ủ t khụng Do v y m ng i lm thớ nghi m b t bu c ph i cho cỏc m u chu n v ch y PCR M t s cụng ty n c khụng hi u ủ c ý ngha c a vi c ny nờn h cung c p chu n ủó cho s n vo PCRmix, v lm nh v y thỡ k t qu ủ nh l ng ch c ch n s khụng ủ m b o ủ c s chớnh xỏc vỡ khụng th ki m soỏt ủ c thao tỏc pipetting c a ng i lm xột nghi m cú t t khụng nh s l ng copies ban ủ u cú cỏc gi ng ch a m u th : Sau ủó cú T ủ ng chu n, xỏc ủ nh s l ng copies ban ủ u (SQ = starting quantity) c a DNA ủớch cỏc gi ng m u th b ng cỏch ch n t ng gi ng vo phõn tớch cựng v i cỏc gi ng chu n i v i cỏc m u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i c t ủ c ủ ng baseline thỡ s l ng ủ nh l ng ủ c chớnh l SQ cú th tớch m u vo ph n ng (bi u ủ 18) tớnh ủ c s copies 1ml huy t thanh, chỳng ta s nhõn SQ v i h s K (l 135 h s cú liờn quan ủ n ủ thu h i sau tỏch chi t cỏc m u chu n bi t rừ s copy cú chốn DNA) ăĐƯ Bi u ủ M u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i ngúc lờn c t ủ c baseline l m u ủ nh l ng dng tớnh Tr s ủ nh l ng SQ ủ c xỏc ủ nh l s copies cú th tớch m u th cho vo ng ph n ng S l ng copiesDNA cú ml mỏu b nh nhõn ủ c tớnh b ng cỏch nhõn SQ v i 50 Bi u ủ 19: M u ch cú th k t lu n õm tớnh (ủ ng bi u di n khu ch ủ i ủ c b ng kờng FAM khụng ngúc lờn) hay d i ng ng phỏt hi n (ủ ng bi u di n khu ch ủ i ủ c b ng kờng FAM ngúc lờn nhng khụng c t ủ c ủ ng baseline) cú tớn hi u khu ch ủ i c a ch ng n i t i ủ c ủ c b ng kờnh hựynh quang HEX i v i cỏc m u m ủ ng bi u di n khu ch ủ i khụng ngúc lờn ủ c hay ngúc lờn ủ c nhng v n khụng c t ủ c baseline thỡ ch n thờm kờnh mu Hex ủ xem cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i c a DNA ch ng n i t i hay khụng? N u cú thỡ k t lu n l m u õm tớnh ủ i v i cỏc m u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i khụng ngúc lờn ủ c (bi u ủ 19) v tr l i l m u d i ng ng phỏt hi n ủ i v i cỏc m u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i ngúc lờn ủ c nhng khụng c t ủ c ủ ng baseline N u khụng cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i c a ch ng n i t i thỡ cú th cú kh nng l m u cũn ch t c ch , nờn th c hi n l i tỏch chi t, n u m u v n cũn b 136 c ch (khụng cú tớn hi u khu ch ủ i c a DNA ch ng n i t i) thỡ k t lu n l m u b c ch , xin m u khỏc ủ lm l i i v i cỏc m u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i c t ủ ng baseline quỏ s m hay l ngúc lờn quỏ s m c t ủ ng baseline r i l i khụng ngúc lờn thờm n a, ch n gi ng ny, ch nh l i baseline cycle vỡ cú mỏy t ủ ng ch n kh ang baseline cycle quỏ ng n nờn ủó lm m u cú tớn hi u khu ch ủ i ngúc lờn quỏ s m N u sau ch n l i cỏc m u ny cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i gi ng cỏc m u õm tớnh thỡ phõn tớch nh cỏc m u õm tớnh N u cú ủ ng bi u di n khu ch ủ i gi ng cỏc m u dng tớnh thỡ phõn tớch gi ng cỏc m u dng tớnh i Tr l i k t qu PCR/real-time PCR chu n m c PCR/real-time PCR l m t xột nghi m r t nh y c m v ủ c hi u Tuy nhiờn vỡ ch t l ng xột nghi m r t tu thu c vo phng phỏp v trỡnh ủ th c hi n xột nghi m, v y u ủi m ny ch ủ t ủ c ng i lm xột nghi m cú ủ tri th c ủ ki m soỏt ủ c cỏc s sút quỏ trỡnh th c hi n xột nghi m thụng qua cỏc chu n m c b t bu c ph i cú lm xột nghi m Ch ng [+] ph i cho k t qu [+] i t â â  â ủ ch ng minh khõu khu c h nh y Y Ch ng [-] ph i cho k t qu [-]v i ủớch nhng ph i cho k t qu [+] v i ch ng n i t i ủ ch ng minh khõu tỏch chi t v khu c h i t nh y v quỏ trỡnh lm xột nghi m khụng b ngo i nhi m e â â â c Y Y M u mu n k t lu n [-] ph i cho k t qu [+] v i ch ng n i t i v k t qu [-] v i ủớch ủ ch ng minh m u khụng b c ch g Hỡnh 64: M t k t qu PCR ủ nh tớnh chu n m c ph i th hi n ủ c t t c cỏc ủi m ki m soỏt quỏ trỡnh lm xột nghi m nh ủ c gi i thớch Ngoi m t ủũi h i r t quan n a ủ i v i real-time PCR ủ nh l ng, ủú l ph i cú k t qu ủ nh l ng chớnh xỏc Trong y sinh h c, b t c m t xột nghi m ủ nh l ng no cng ủũi h i ph i ch y m u th cựng lỳc v i m u chu n M u chu n PCR ủ nh l ng ph i cho k t qu ủ t n tớnh cao v i hi u qu PCR t ủ i ủ ch ng minh ng i lm xột nghi m thao tỏc pipetting chu n, khụng cú s sút Khụng 137 ch ph i bi t s d ng cỏc chu n m c ủ ki m soỏt ch t l ng c a cỏc khõu lm xột nghi m, m c khõu tr lũi k t qu xột nghi m, ng i lm thớ nghi m cng ph i th hi n ủ c cỏc ki m soỏt ny trờn phi u tr l i M t k t qu xột nghi m PCR ủ nh tớnh ủ n khụng ủ c C  nghi m s ủ nh xột Khu ch ủ i trỡnh t ch ng n i t i  tay ng i ch Khu ch ủ i cỏc n ng ủ chu n c a trỡnh t ủớch Khu ch ủ i ch ng n i t i ủ c phỏt hi n nh taqman probe ủ c hi u giỳp ng i s d ng ki m súat ủ c c ch m u cú hay khụng Khụng cú khu ch ủ i ủớch xem l chu n m c n u trờn phi u tr l i k t qu khụng th hi n v ch ng minh ủ c cỏc ki m soỏt cú Cỏc chu n giỳp ki m súat chớnh xỏc pipetting bi u ủ chu n ủ t R0.99 and E=90-105% v giỳp ủ nh l
ng chớnh xỏc s copies ủớch cú cỏc m u th 3 th c hi n quỏ trỡnh lm xột nghi m Hỡnh 64 minh h a v c t ngha cỏc chu n m c ph i th hi n trờn k t qu xột nghi m PCR ủ nh tớnh M t k t qu xột Bi u ủ 20: Minh h a m t trỡnh by k t qu PCR ủ nh l ng chu n m c v i bi u ủ chu n ch ng minh m u luụn ch y chung v i chu n v thao tỏc pipetting ủ c ki m soỏt chu n m c (B), nh v y m k t qu ủ nh l ng l chớnh xỏc (A) nghi m PCR ủ nh l ng ủ n tay ng i ch ủ nh xột nghi m s khụng ủ c xem l chu n m c n u trờn phi u tr l i k t qu khụng th hi n v ch ng minh ủ c l (i) m u th ủ c ch y chung v i m u chu n qua ủ ng bi u di n chu n cú v trớ c a m u th , (ii) thao tỏc ủ nh l ng chu n m c qua hi u qu PCR v h s tng quan trờn bi u ủ chu n ủ t cỏc thụng s lý t ng, v (iii) n u m u k t lu n õm tớnh hay d i ng ng ph i cú d ng bi u di n khu ch ủ i c a ch ng n i t i Cỏc bi u ủ 20-A v 20-B minh h a v c t ngha cỏc chu n m c ph i th hi n trờn k t qu xột nghi m real-time PCR ủ nh l ng Thao tỏc thớ nghi m chu n m c v th hi n k t qu chu n m c, ủú m i l PCR/real-time PCR ch n ủoỏn 138 j Cỏc v n ủ k thu t c n bi t s d ng m t k t qu PCR/real-time PCR ch n ủoỏn PCR/real-time PCR l m t cụng c t v i dựng ch n ủoỏn vỡ ủ nh y c m khú cú th cú m t xột nghi m no sỏnh k p, ủ ng th i ủ ủ c hi u c a PCR/realtime PCR ch n ủoỏn phỏt hi n cỏc tỏc nhõn vi sinh gõy b nh cng khụng khỏc gỡ phng phỏp vi sinh nuụi c y Tuy nhiờn vi c s d ng k t qu PCR/real-time PCR cú hi u qu hay khụng l r t tựy thu c vo s hi u bi t c a ng i s d ng k t qu v cho ch ủ nh lm xột nghi m Chỳng tụi xin m t s minh h a s d ng k t qu PCR/real-time PCR ủ phỏt hi n tỏc nhõn vi sinh gõy b nh cho ng i K t qu PCR/real-time PCR [+] cú xỏc ủ nh ủ c ng i b th nhi m tỏc nhõn vi sinh gõy b nh?: ỳng nh v y vỡ PCR/real-time PCR phỏt hi n tr c ti p tỏc nhõn vi sinh gõy b nh thụng qua phỏt hi n cỏc nucleic acid ủớch ủ c hi u vi sinh v t cú m t b nh ph m l y t b nh nhõn Tuy xỏc ủ nh ủ c l ng i b th th nhi m tỏc nhõn vi sinh gõy b nh nhng cú xỏc ủ nh ủ c ng i ủú b b nh hay khụng ủ ủ c ủi u tr l m t v n ủ khỏc L y vớ d m t ng i th ủm phỏt hi n vi khu n lao b ng th nghi m PCR, k t qu [+], bỏc s v n cha nờn cho ch ủ nh ủi u tr lao m ph i xem th X quang ph n cú thõm nhi m rừ ủ nh ph i tiờu bi u cho nhi m lao hay khụng r i m i ủi u tr N u X quang ph i v n v bỡnh th ng thỡ ch nờn theo dừi ti p quan xột nghi m PCR v qua X quang ph i ủ xem cú di n ti n ủ n lao hay khụng tong vũng 1-3 thỏng, n u khụng di n ti n ủ n lao thỡ khụng c n thi t ủ ủi u tr cho b nh nhõn K t qu PCR/real-time PCR [-] cú xỏc ủ nh ủ c ng i b th khụng mang tỏc nhõn gõy b nh khụng? Khụng ch c nh v y vỡ PCR/real-time PCR khụng th cho giỏ tr tiờn ủoỏn õm (negative predictive value, NPV) ủ t 100% cho dự l y m u chớnh xỏc v th nghi m chớnh xỏc, vỡ k t qu cũn tựy thu c r t nhi u vo di n ti n c a tỏc nhõn gõy b nh c th ng i th Vớ d m t ng i HbsAg [+], th HBV-DNA cho k t qu [-], cú th núi ng i ủú khụng nhi m HBV hay khụng? Ch c ch n l khụng, vỡ ng i ủú v n cũn mang HBV gan v ủang giai ủ an m mi n d ch khụng ủ c hi u c a c th cũn ỏt ch ủ c virus nờn HBV ch gan v t o cỏc virus khụng hũan ch nh l cỏc khỏng nguyờn b m t khụng cú lừi DNA m thụi õy chớnh l cỏc tr ng h p ng i lnh mang HBV, v n l ng i ủang b nhi m HBV v v n cú 139 nguy c lõy nhi m cho ng i khỏc Do v y chỳng ta cng r t th ng g p nhi u k t qu HBV-DNA [-] trờn b nh nhõn HBsAg [+] S d ng k t qu real-time PCR ủ nh l ng nh th no cho ủỳng? õy cng l m t v n ủ c n bn Chỳng ta ủ u bi t real-time PCR dựng ủ nh l ng tỏc nhõn vi sinh ủớch, g i l qPCR, r t cú giỏ tr ủ ủỏnh giỏ v theo dừi ủ c hi u qu ủi u tr cỏc b nh nhi m virus nh HBV, HCV, HIV Tuy nhiờn lm th no ủ bi t ủ c s khỏc bi t v k t qu ủ nh l ng l cú ý ngha? Cú nhi u ng i nh m l n v n ủ ny nờn cho ủỏnh giỏ hay nh n xột sai l m v hi u qu ủi u tr K t qu ủ nh l ng ch ủ c coi l khỏc bi t s khỏc bi t gi a hai l n th l trờn hay b ng 100 l n, g i l log10 Lý ph i log10 l vỡ ủ nh l ng ng i ta ủó xõy d ng ủ ng chu n d a vo cỏc ủ pha loóng theo h s 10 c a cỏc n ng ủ DNA chu n, v sai s cú th ch p nh n ủ c l vũng ủ pha lừang nờn k t qu ch ủ c xem l khỏc bi t cỏch ủ pha lừang, t c l log10 Chớnh vỡ v y, ủ trỏnh cho cỏc nh lõm sng ủỏnh giỏ sai, hi n trờn th gi i cỏc nh b nh h c ch p nh n tr lũi k t qu l log10 ch khụng ph i l s l ng copy chớnh xỏc Vớ d k t qu l 425,379,000 copy thỡ s tr l i l 4.25 log 8, hay ủn gi n l log Nh v y n u k t qu l n l 117,318,000 copy thỡ s tr l i l 1.17 log 8, hay ủn gi n l log V i cỏch tr l i ny bỏc s ủi u tr s th y ủ c l l ng virus cha gi m sau th i gian ủi u tr Ngoi ra, nh ủi u tr m t ủó hi u ủ c v n ủ ny, h s khụng ch ủ nh cho b nh nhõn lm xột nghi m ủ nh l ng th i gian quỏ ng n ch vi tu n sau xột nghi m ủ nh l ng, vỡ ch c ch n ch th i gian ng n nh v y r t khú ủ ủỏnh giỏ v so sỏnh k t qu ủ nh l ng v i d ng m t phũng thớ nghi m time PCR ch n oỏn M t phũng thớ nghi m PCR ch n ủoỏn s bao g m cỏc phũng v khu v c lm vi c nh sau: Phũng tỏch chi t nucleic acid õy l phũng lm nhi m v tỏch chi t nucleic acid v cho cỏc m u tỏch chi t vo cỏc PCR/real-time PCR mix ủ chu n b cho vo mỏy ch y PCR Phũng ny c n trang b cỏc thi t b v d ng c sau: 140 M t bu ng thao tỏc PCR l m t t thao tỏc khớ t nh cú trang b ủốn chi u sỏng v ủốn c c tớm, bu ng ny cú th ủ t t cỏc hóng s n xu t n c ngoi hay t ủúng (hỡnh 65) Kớch th c t i thi u cho ng i lm vi c Trong bu ng thao tỏc ny ph i trang b cỏc d ng c v thi t b nh sau: vortex x 2, mỏy nhi t khụ x 2, mỏy hỳt chõn khụng x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, l ủ v t li u d, nhi m x Cỏc thi t b khỏc ph i cú: mỏy ly tõm 13,000 x 2, mỏy ly tõm l nh 13,000 x 1, mỏy ly tõm bn 4000 cho tube 15ml x 1, t ủụng -18 ủ n -30oC v i s l ng tựy vo m u nhi u hay ớt, t mỏt # 280 lớt cng v i s l ng tựy m u nhi u hay ớt Phũng ủ t mỏy PCR v real-time PCR õy l phũng lm nhi m v ch y mỏy PCR v real-time PCR Phũng ny c n trang b mỏy real-time PCR v mỏy PCR th ng v i s l ng tựy m u nhi u hay ớt lm ch n ủoỏn thỡ nờn ủ t mỏy c a cỏc hóng cú gi y phộp qu c t (lisence) ủ c cung c p mỏy PCR/real-time PCR dựng cho ch n ủoỏn v hi n Biorad l cụng ty cú ủ c gi y phộp ny ủ m b o mỏy ch y n ủ nh, khụng b t t cỳp ủi n gi a ch ng thỡ nờn trang b b lu ủi n 6KVA v ph i cú dõy n i ủ t Phũng ủ t mỏy PCR nờn thụng v i phũng tỏch chi t nucleic acid Phũng ủi n di ủ c k t qu õy l phũng lm nhi m v ch cỏc gel ủi n di, th c hi n ủi n di v ủ c k t qu ủi n di Phũng ny ph i trang b cỏc thi t b v d ng c sau: M t bu ng thao tỏc ủi n di: l m t t thao tỏc khớ t nh cú trang b ủốn chi u sỏng v ủốn c c tớm, bu ng ny cú th ủ t t cỏc hóng s n xu t n c ngoi hay t ủúng (hỡnh 65) Kớch th c t i thi u cho ng i lm vi c Trong bu ng thao tỏc ny ph i trang b cỏc d ng c v thi t b nh sau: vortex x 1, b ủi n di agarose lo i minigel x 2, mỏy ly tõm compact x 1, micropipette 1-20ul x 1, h p nh a ủ ng gel ủó dựng xong x 1, h p nh a ủ ng gel cha/ủang dựng x 1, h p nh a ủ ng ủ u pipette d x Cỏc d ng c v thi t b khỏc ph i cú l: m t lũ vi súng, m t h th ng ch p nh gel, m t t ủ gel, m t cõn ủi n t ủ cõn agarose 141 Phũng ủi n di ủ c k t qu nờn tỏch bi t hay ch thụng ủ c v i phũng ủ t mỏy PCR/real-time PCR Phũng pha ch thu c th PCR v real-time PCR Ch cú cỏc phũng thớ nghi m ch n ủoỏn l n m i nờn cú phũng ny, v ph i tỏch r t phũng núi trờn Phũng ny tr c vo ph i thay ỏo b ng ỏo chuyờn ch dựng phũng ny m thụi Cỏc thi t b , húa ch t, d ng c ủ pha ch ủ phũng, khụng ủ c ủem ngoi Núi chung ủõy l phũng ph i tinh s ch Cỏc thi t b v d ng c phũng nờn cú l: T thao tỏc pha ch thu c th , nờn l cỏc clean bench dnh cho ng i cú trang b ủốn c c tớm v ủốn chi u sỏng Trong t ny trang b : vortex x 1, mỏy nhi t khụ x 1, mỏy ly tõm 13000 x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, l ủ v t li u d, nhi m x T thao tỏc cõn ch nh pH, cng nờn l cỏc clean bench dnh cho hay ng i cú trang b ủốn c c tớm v ủốn chi u sỏng, bờn cú: cõn ủi n t x 1, mỏy ủo pH x1, khu y t x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x1 T thao tỏc pha cỏc húa ch t ủ c, nờn l t an tũan sinh h c l p bờn cng trang b cõn ủi n t x 1, mỏy ủo pH x1, khu y t x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x 1, pipette aid x Cỏc thi t b khỏc, cú s l ng tựy qui mụ, nh mỏy lm ủỏ v y, mỏy ly tõm 13,000 x1, mỏy ly tõm bn 4000 cho tube 15ml x 1, t ủụng -18 ủ n -30oC v i s l ng tựy vo m u nhi u hay ớt, t mỏt # 280 lớt cng v i s l ng tựy m u nhi u hay ớt D i ủõy minh h a m t phũng thớ nghi m sinh h c phõn t ch n ủoỏn l n bao g m c PCR/real-time PCR v gi i trỡnh t (hỡnh 66, 67) dnh cho m t b nh vi n l n c a thnh ph H Chớ Minh m chỳng tụi ủó g i thi t k Ngoi chỳng tụi cng thi t k phũng thớ nghi m PCR/real-time PCR cho cỏc phũng thớ nghi m trung bỡnh (hỡnh 68) 142 Hỡnh 65: Mụ hỡnh m t t thao tỏc PCR t ủúng Hỡnh 66: S ủ phũng pha ch cỏc thu c th sinh h c phõn t 143 Hỡnh 67: S ủ phũng tỏch chi t nucleic acid v phũng ủi n di k t h p phũng gi i trỡnh t 144  Hỡnh : S ủ m t phũng thớ nghi m PCR v real-time PCR dnh cho phũng thớ nghi m lõm sng t i cỏc b nh vi n n thnh ph hay t nh 145