Những vấn đề kỹ thuật cần được quan tâm khi áp dụng PCR Real - time PCR trong phòng thí nghiệm chẩn đoán trình bày về các vấn đề như: Sự khác biệt giữa phòng thí nghiệm chẩn đoán và phòng thí nghiệm nghiên cứu; các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm áp dụng PCR và Real - time trong chẩn đoán; xây dựng một phòng thí nghiệm PCR/Real - time PCR chẩn đoán. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết tài liệu.
Những vấn kỹ thuật c n quan tâm áp dụng PCR real-time PCR phịng thí nghiệm chẩn đốn Sự khác biệt phịng thí nghiệm chẩn đốn phịng thí nghiệm nghiên c u Phịng thí nghiệm nghiên cứu phịng thí nghiệm mà thử nghiệm thực để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu nhằm giúp nhà nghiên cứu giải đáp vấn đề khoa học Kết phịng thí nghiệm nghiên cứu khơng liên quan trực tiếp tức thời đến định người gửi mẫu xét nghiệm, chăn nuôi hay thủy sản không liên quan đến định hủy hay cô lập quần thể gia súc hay tôm cá, hay y học không liên quan đến định điều trị bác sĩ bệnh nhân Do kết phịng thí nghiệm nghiên cứu không cần thiết phải kịp thời đến tay người gửi mẫu xét nghiệm Phịng thí nghiệm chẩn đốn phịng thí nghiệm có nhiệm vụ yếu làm xét nghiệm mẫu thử để phát tác nhân gây bệnh trả lời kết đến người gửi yêu cầu xét nghiệm để họ thể cho cách giải cụ thể vật chủ lấy mẫu gửi xét nghiệm Trong chăn nuôi hay thủy sản, kết phịng thí nghiệm chẩn đốn quan trọng có liên quan đến định giới hữu trách để tiêu hủy hay cô lập bầy đàn gia súc hay tôm cá Trong y học, phịng thí nghiệm chẩn đốn cịn gọi phịng thí nghiệm lâm sàng kết xét nghiệm nhà lâm sàng tham khảo để đưa phát đồ điều trị bệnh nhân Chính phịng thí nghiệm chẩn đốn phải phịng thí nghiệm khơng cho kết xác mà phải cho kết kịp thời đến tay người làm xét nghiệm Việc ứng dụng PCR real-time PCR chẩn đoán trở nên ngày dễ dàng cơng nghệ mở, phịng thí nghiệm tự pha chế thuốc thử để thực thử nghiệm Ngoài ra, nhu cầu sử dụng PCR real-time PCR chẩn đoán ngày nhiều có nhiều tác nhân gây bệnh chẩn đốn hay theo dõi cơng nghệ PCR real-time PCR Không vậy, giới, cơng nghệ PCR chẩn đốn hết quyền nên có bùng nổ sản phẩm chẩn đốn dựa cơng nghệ PCR real-time PCR nhiều hãng sản xuất cung cấp Do vậy, nói PCR khơng cịn bó hẹp cánh của phịng thí nghiệm nghiên cứu mà xâm nhập vào phịng thí nghiệm chẩn đoán 115 Tuy nhiên việc áp dụng PCR real-time PCR chẩn đốn địi hỏi người làm thí nghiệm phải biết quan tâm đến vấn đề kỹ thuật có liên quan để kết xét nghiệm đạt độ xác cao, đạt độ nhạy cảm tuyệt vời chất PCR real-time PCR, phải kịp thời đến tay người định xét nghiệm Các vấn kỹ thuật c n quan tâm áp dụng PCR real-time PCR chẩn ốn Tiến trình xét nghiệm PCR real-time PCR Kể từ lấy mẫu thử gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm PCR hay real- time PCR chẩn đoán kết xét nghiệm đến tay người cho định xét nghiệm, tiến trình qua bước mà bước có vấn đề kỹ thuật cần quan tâm người làm xét nghiệm, người lấy mẫu xét nghiệm, người nhận để sử dụng kết xét nghiệm Sơ đồ trình bày bước Lấy chuyển mẫu thử làm xét nghiệm PCR/realtime PCR Các vấn đề kỹ thuật lấy gửi mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử tách chiết nucleic acid từ mẫu thử Các vấn đề kỹ thuật tách chiết nucleic acid (NA) Thực phản ứng khuếch đại nucleic acid (PCR/real-time PCR) Các vấn đề kỹ thuật khuếch đại NA Làm thí nghiệm để đọc kết Phân tích kết Các vấn đề kỹ thuật thí nghiệm đọc KQ phân tích KQ Sử dụng kết xét nghiệm PCR/real-time PCR Các vấn đề kỹ thuật sử dụng kết Vấn đề ngăn ngừa nhiễm chéo loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại tiến trình xét nghiệm Sơ đồ 3: Tiến trình xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đoán vấn đề kỹ thuật cần quan tâm 116 Các v✯n ✬✁ kỹ thuật cần quan tâm a Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm lấy gửi mẫu thử Mẫu thử lấy làm xét nghiệm PCR/real-time PCR mẫu lấy từ vật chủ nơi mà người lấy mẫu cho có diện nucleic acid tác nhân đích, phải lấy mẫu thử chổ Ví dụ để phát M tuberculosis gây lao phổi bệnh nhân mẫu thử phải lấy đàm hay dịch hút từ rửa khí/phế quản, khơng thể lấy máu hay huyết Hay muốn phát Cytomegalovirus bệnh nhân mẫu thử tốt máu tòan phần để tách huyết tương hay tách bạch cầu, máu đông để tách huyết Vật liệu dùng để lấy giữ mẫu thử phải quan tâm khơng, nucleic acid tác nhân đích có mẫu bị phân hủy hay mẫu thử chứa chất ức chế phản ứng khuếch đại sau Do vật liệu tốt để lấy giữ mẫu thử vật liệu tinh mặt sinh học, nghĩa không nhiễm protein hay nuclease tiết từ vi sinh vật endonuclease, ribonuclease; sử dụng lần, không nên rửa xài lại Hình 59 mơ tả số vật liệu nên sử dụng để lấy giữ mẫu thử làm xét nghiệm PCR/qPCR Các vật liệu hiên có sẵn cơng ty Nam Khoa Hình 59: Các lọ tube nên sử dụng để lấy giữ mẫu thử làm xét nghiệm PCR/qPCR Để bảo quản chuyên chở mẫu vấn đề kỹ thuật cần quan tâm làm mẫu giữ ngun trạng, nucleic acid tác nhân đích khơng bị phân hủy trình bảo quản Do mẫu mà nucleic acid đích cần phát DNA bảo quản ngắn ngày (trong vòng 48 giờ) tủ mát 2-8oC, bảo quản lâu dài cần giữ -18oC đến -30oC Đối với RNA, mẫu hay khơng bị tạp nhiễm máu, dịch thể bảo quản 48 2-8oC, mẫu ✶✶ tạp nhiễm nhiều quệt họng, quệt mũi sau tìm virus, đàm hay cần bảo quản dài ngày phải giữ mẫu -70oC Để chuyên chở mẫu cần chuyên chở thùng lạnh với thời gian chuyên chở không 48 Nếu thời gian chuyên chở lâu cần phải giữ đá khơ Nói chung, vấn đề kỹ thuật nêu lên nhằm mục tiêu, lấy mẫu cho chổ nơi có diện nucleic acid đích muốn tìm, phải giữ chun chở mẫu thử đến phịng thí nghiệm điều kiện cho nucleic acid muốn tìm khơng bị phân hủy mẫu thử không bị nhiễm chất sinh học gây ức chế phản ứng khuếch đại mẫu thử không bi nhiễm chéo b Các vấn đề kỹ thuật chuẩn bị mẫu thử tách chiết nucleic acid Trong khâu này, mục tiêu phải tách chiết tối đa nucleic acid đích dù lượng nucleic acid tác nhân đích có nhỏ có bị pha lỗng q thấp mẫu thử Tách chiết thu phải tinh khiết, không lẫn protein hay chất gây ức chế phản ứng khuếch đại Tùy loại mẫu thử tùy loại tác nhân đích có mẫu thử mà có mẫu thử đưa vào tách chiết nucleic acid ngay, có mẫu thử cần phải chuẩn bị trước đưa vào tách chiết nueic acid (NA) Ví dụ mẫu thử huyết thanh, huyết tương, cấy tế bào với tác nhân đích virus hay vi khuẩn có cấu tạo tế bào khơng đặc biệt đưa vào tách chiết nuleic acid ngay, với mẫu thư mẫu mô, mẫu sinh thiết hay vi khuẩn có cấu tạo tế bào đặc biệt M tuberculosis, nấm men, nấm sợi, mơ thực vật cây-lá-rễ-hoa cần phải đưa vào chuẩn bị trước để cấu trúc mô tan (vdụ phải sử lý proteinase K), để tế bào (vdụ dùng chất tẩy TRITON X100, hay tán siêu âm, hay nghiền nitrogen lỏng ), hay trường hợp lát cắt sinh thiết đúc sáp cần phải loại bỏ sáp khỏi mơ, mẫu có chất nhầy đàm cần phải làm tan nhầy (bằng NALC ) trước đưa vào tách chiết nucleic acid Do vậy, người làm xét nghiệm cần phải biết không mẫu thử cần phải qua giai đọan xử lý mẫu trước tách chiết NA mà phải biết phải sử dụng phương pháp với qui trình kỹ thuật 118 Tùy loại mẫu thử; tùy loại tác nhân đích vi khuẩn, virus, vi nấm, hay tế bào có nhân; tùy NA phải tách chiết DNA hay RNA mà phải lựa chọn phương pháp tách chiết cho phù hợp, khơng nên lẫn lộn Ví dụ phương pháp Boom tốt để tách chiết dịch sinh học hay mẫu thử lẫn DNA vật chủ nguyên tắc dựa vào hấp phụ DNA hạt silica, nên mẫu có nhiều DNA vật chủ mô sinh thiết DNA tác nhân đích bị cạnh tranh khơng bám vào hạt silica Do vậy, để tách chiết DNA cho mẫu thử mô sinh thiết nên chọn phương pháp phenol/chloroform phương pháp BOOM Cũng sử dụng phương pháp tách chiết cho RNA vào để tách chiết DNA, mà thấy phương pháp BOOM tốt cho tách chiết DNA lại cho tách chiết RNA Khi lựa chọn phương pháp hay thuốc thử tách chiết cho tác nhân virus hay vi khuẩn đích, phải xem kỹ tách chiết hay phương pháp tách chiết NA mà lựa chọn có áp dụng cho vi khuẩn hay virus khơng? Vì có thất bại xét nghiệm PCR vô ý Tách chiết NA khâu quan trọng; tách chiết NA phải đảm bảo độ nhạy xét nghiệm PCR đạt độ nhạy mong muốn Do tự pha thuốc thử tách chiết NA hay sản xuất thuốc thử tách NA, trước đưa vào sử dụng xét nghiệm PCR/real-time PCR, phòng thí nghiệm hay nhà sản xuất phải kiểm tra chất lượng để xem tách chiết có đảm bảo độ nhạy hay không Phương pháp kiểm tra phải thử độ pha lõang tác nhân đích (là đối tượng mà phịng thí nghiệm hay người dùng phải sử dụng tách chiết NA để thực xét nghiệm) hay tác nhân khác tương đương Đạt độ nhạy tách chiết NA thử nghiệm độ pha loãng tác nhân đích phải đạt giới hạn phát (limit of detection, LOD), tức đạt số lượng vi khuẩn đích thấp có đơn vị thể tích mẫu thử mà phương pháp hay thử nghiệm tách chiết phát Minh họa (hình 60) kết kiểm tra chất lượng kit tách chiết DNA tên NK DNAPREP-BOOM công ty Nam Khoa sản xuất kiểm tra chất lượng Phương pháp kiểm tra sử dụng độ pha loãng vi khuẩn M tuberculosis, cho vào tách chiết DNA với thuốc thử sản xuất đồng thời so sánh với thuốc thử NK DNAPREP-BOOM sản xuất trước Kết kiểm tra cho ✂✂✄ thấy thuốc thử NK DNAPREP-BOOM sản xuất thuốc thử NK DNAPREP- BOOM sản xuất trước đạt khả tách chiết vi khuẩn đích đến độ pha lõang 10-4, chứa vi khuẩn thể tích 100ml dịch vi khuẩn đưa vào tách chiết Trong phương pháp huyền dịch vi khuẩn có bị giảm chất lượng kết kiểm tra đọc nhờ có so sánh NK DNAPREP-BOOM sản xuất với NK DNAPREP-BOOM sản xuất lơ trước lơ đạt chất lượng Hình 60: Kết kiểm tra chất lượng thuốc thử NKDNAPREP-BOOM công ty Nam Khoa sản xuất Đối tượng dùng để kiểm tra thuốc thử huyền dịch vi khuẩn M tuberculosis TB1 chứa 10.000 tế bào vi khuẩn/ml pha loãng theo hệ số 10 để có 1,000 tế bào vi khuẩn/ml (T2), 100/ml (T3), 10/ml (T4), NK 1/ml (T5) Phương pháp kiểm tra sử dụng thuốc thử DNAPREP-BOOM cần kiểm tra NK DNAPREP-BOOM sản xuất trước để thực tách chiết huyền dịch vi khuẩn pha lỗng này, thể tích huyền dịch để tách chiết 100ml, lấy 10ml dịch tách chiết để chạy PCR phát M tuberculosis Phát DNA M tuberculosis có dịch tach chiết qua điện di phát sản NK phẩm khuếch đại 249bps Kết cho thấy hai thuốc thử DNAPREP-BOOM củ đạt LOD tế bào vi khuẩn M tuberculosis thể tích tách chiết Khơng kiểm tra chất lượng thuốc thử tách chiết NA pha chế trước sử dụng, mà lần sử dụng để làm xét nghiệm, thuốc thử tách chiết phải kiểm soát độ nhạy cách cho nucleic acid chứng nội nồng độ LOD vào mẫu chứng [-] muốn, cho vào mẫu thử để thực tách chiết lúc với mẫu thử (xem phần chứng nội tại) c Các vấn đề kỹ thuật khuếch đại nucleic acid đích Về ngun tắc PCR/real-time PCR đạt độ nhạy cao, nhiên thực tế độ nhạy cịn tùy thuộc nhiều vào thiết kế hay chọn lựa mồi; vào thiết bị luân nhiệt; vào hóa chất, đặc biệt enzyme Taq polymerase sử dụng Khâu 120 khuếch đại khó đạt độ nhạy trì độ nhạy trình lưu trữ nhà sản xuất hay người làm thí nghiệm khơng chọn lọc Taq polymerase để sử dụng Ngoài yếu tố kỹ thuật cần phải quan tâm trên, để đảm bảo độ nhạy khâu khuếch đại, tự pha hay sản xuất PCR mix cho phản ứng khuếch đại, người làm thí nghiệm hay nhà sản xuất phải kiểm tra độ nhạy PCR mix trước đưa vào sử dụng Phương pháp kiểm tra thử nghiệm độ pha lõang DNA đích biết trước số lượng copy đơn vị thể tích PCR mix gọi đạt độ nhạy đạt giới hạn phát (LOD) copy DNA đích cho vào PCR mix, nghĩa thể tích mẫu cho vào PCR mix cần có copy DNA đích cho kết khuếch đại thành nhiều phát phân tích kết (xem mục kiểm tra độ nhạy PCR mix pha PCR-các vấn đề bản) 10 100 1,000 10,000 Biểu đồ 16: Kết kiểm tra chất lượng real-time PCR mix sử dụng mồi Taqman probe định lượng HBVDNA Kết kiểm tra cho thấy độ nhạy PCR mix đạt LOD copy HBV-DNA thể tích mẫu cho vào PCR mix Các đường biểu diễn màu xanh sáng đường biểu diễn khuếch đại chứng nội cho vào PCR mix nồng độ LOD với mẫu kiểm tra Biểu đồ 16 minh họa kết kiểm tra chất lượng real-time PCR mix dùng mồi Taqman probe để phát định lượng HBV-DNA công ty Nam Khoa sản xuất Kết kiểm tra cho thấy độ nhạy PCR mix đạt LOD copy cho thể tích mẫu cho vào PCR mix, độ nhạy địi hỏi PCR/real-time PCR chẩn đốn 121 Ngồi việc kiểm tra chất lượng PCR mix trước đưa vào sử dụng, người làm xét nghiệm thực xét nghiệm PCR phải kiểm soát cho độ nhạy PCR mix sử dụng lần làm xét nghiệm Thực vấn đề kiểm soát điều kiện bắt buộc dù PCR mix có kiểm tra đạt chất lượng sau pha chế hay sản xuất, giảm chất lượng q trình lưu trử hay bảo quản, đặc biệt pha chế nguồn Taq polymerase không đảm bảo chất lượng Có nhiều cách để kiểm sốt chất lượng PCR mix làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn Có thể sử dụng chứng [+] DNA đích pha sẵn hay nhà sản xuất cung cấp nồng độ LOD cho vào PCR mix lần làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn, hay sử dụng DNA chứng nội sử dụng chung mồi pha nồng độ LOD cho vào PCR chung với tách chiết DNA từ mẫu để kiểm soát ức chế PCR đồng thời kiểm soát độ nhạy PCR mix (xin xem thêm mục chứng nội tại, chứng dương, chứng âm phần chuẩn mực kiểm soát chất lượng cho xét nghiệm PCR/real-time PCR dành cho chẩn đoán) d Ngừa nhiễm chéo loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại Muốn sử dụng PCR/real-time PCR chẩn đoán, người làm xét nghiệm phải nhận diện để có biện pháp kỹ thuật ngăn ngừa hay loại trừ nguy ngoại nhiễm làm cho mẫu thử khơng có tác nhân đích lại bị có kết dương tính làm xét nghiệm, nghĩa bị nguy dương tính giả Ngoại nhiễm xét nghiệm PCR/realtime PCR chẩn đốn xãy hai nguyên Nguyên thứ nhiễm chéo làm cho mẫu âm hay thuốc thử làm xét nghiệm bị nhiễm nucleic acid đích từ mẫu dương Với ngun người làm thí nghiệm hịan tịan phịng ngừa trí phịng thí nghiệm cách hợp lý với phương tiện thiết bị phù hợp, ví dụ thiết kế để khu vực pha thuốc thử cách xa khu làm mẫu; không để lẫn lộn thuốc thử pha dùng với nguyên liệu dung dịch dùng để pha thuốc thử; dụng cụ tài liệu dùng khu vực làm mẫu không đem qua khu vực pha thuốc thử; khơng để phịng thí nghiệm vi sinh ni cấy tác nhân đích phịng thí nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn phát tác nhân Ngồi cách bố trí phịng thí nghiệm làm việc cho hợp lý, người làm xét nghiệm PCR/real-time PCR phải 122 huấn luyện để nhuần nhuyễn thao tác vô trùng đặc biệt đóng mở tube, chai lọ, thao tác pipetting, bố trí vật liệu dụng cụ thao tác Đối với nguyên thứ hai ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại với giải pháp kỹ thuật nêu khó tránh nguy này, lý phịng xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn, sản phẩm PCR tích tụ ngày nhiều chắn khơng sớm muộn sản phẩm PCR nhiễm vào dụng cụ, thuốc thử, thiết bị đến lúc người làm xét nghiệm nhận dạng thảm họa mẫu xét nghiệm PCR cho kết dương tính Đến lúc có giải pháp đổ bỏ tịan thuốc thử, khử nhiễm tịan phịng thí nghiệm, đóng vài tháng Rồi lại mở cửa làm lại, thảm họa tái xuất Mô tả để thấy khơng thể có biện pháp hiệu để ngừa ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại, mà có cách phải loại trừ nguy Để làm điều cách phịng thí nghiệm PCR chẩn đoán từ đầu phải sử dụng PCR mix có pha thêm dUTP UNG Cơ chế loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại dUTP UNG nói chi tiết mục loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại PCR-các vấn đề Qua phân tích trên, thấy muốn làm xét nghiệm PCR chẩn đốn, khơng thể khơng sử dụng biện pháp dùng PCR mix có pha dUTP UNG Nếu khơng áp dụng biện pháp này, khơng sớm muộn, thảm họa ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại xãy Tuy nhiên có vấn đề kỹ thuật dùng dUTP UNG khơng chọn enzyme UNG hiệu phù hợp độ nhạy PCR/real-time PCR giảm và/hay khơng thể có hiệu loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại Chính người sử dụng phải kiểm tra độ nhạy kiểm tra khả loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại PCR mix công bố có dUTP UNG Hiện tất hãng nước sản xuất PCR mix dùng cho PCR/real-time PCR chẩn đoán sử dụng dUTP UNG Tại Việt Nam, công ty Nam Khoa công ty tiên phong hàng đầu áp dụng giải pháp Tất thuốc thử PCR/real-time PCR dùng chẩn đốn cơng ty Nam Khoa sản xuất sử dụng PCR mix có dUTP UNG nguồn hóa chất chọn lọc để đảm bảo không giảm độ nhạy mà hiệu loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại cao với chứng kiểm tra chất lượng độ nhạy kèm với sản phẩm 123 e Các vấn đề kỹ thuật thử nghiệm điện di thạch để đọc kết Đối với phương pháp PCR cổ điển muốn đọc kết quả, người làm thí nghiệm phải làm tiếp thí nghiệm để xác định ống phản ứng có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu hay không Phương pháp thường áp dụng phịng thí nghiệm PCR chẩn đoán dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản phẩm khuếch đại có kích thước mong muốn hay khơng Chính phương pháp thường sử dụng nhất, nên xin đưa số vấn đề kỹ thuật cần người làm thí nghiệm quan tâm § Chọn tỷ lệ % agarose để điện di cho phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại Trung bình dùng tỷ lệ 2% Đối với sản phẩm khuếch đại lớn 500bps nên dùng agarose 1.5%, cịn sản phẩm khuếch đại kích thước 100bps nên dùng agarose 2.5% § Khi pha gel agarose, lưu ý phải làm tan hòan tòan agarose đệm điện di, để làm điều phải cho agarose vào bình có sẵn dung dịch đệm diện di, nhờ tránh agarose bị bám vào đáy bình khơng tan sau đun Trước cho vào lị vi sóng phải lắc trộn để agarose hòa dung dịch đệm Khi đun, phải hai lần lấy bình khỏi lị vi sóng để lắc trộn cho vào đun tiếp Phải đảm bảo agarose tan dung dịch đệm, khơng cịn thấy lợn cợn dù nhỏ Có có kết điện di tốt § Trước đổ agarose vào khn, phải đảm bảo khuôn nằm mặt phẳng nằm ngang kiểm tra bóng khí để bề dày agarose thật dày kết điện di xác § Trong PCR chẩn đốn, không nên trộn đệm tải với sản phẩm PCR giấy paraffin làm gây nguy ngoại nhiễm Nên cho đệm tải với thể tích ¼ thể tích dung dịch phản ứng có tube PCR trộn tube § Thể tích mẫu cho vào giếng khơng nên q mà phải từ 15ml trở lên có phát kết [+] yếu § Ln điện di kèm với thang DNA chuẩn khơng dùng để xác định kích thước vạch điện di mẫu mà chuẩn để kiểm 124 Chứng [✲] cho PCR mix Định nghĩa: Chứng [-] cho PCR mix mẫu nước tinh hay TE 1X cho vào PCR mix lần làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn Vai trị: Chứng [-] cho PCR mix nên cho vào PCR mix cho lần chạy PCR, cho vào cuối sau cho mẫu chứng [+] vào PCR mix tương ứng mục đích sau: § Chứng minh thao tác cho mẫu chứng [+] vào PCR mix không bị nhiễm chéo hay không bị nhiễm sản phẩm khuếch đại chứng [-] cho PCR mix lại có kết [+] sản phẩm khuếch đại thao tác bị nhiễm chéo hay ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại § Chứng minh PCR mix sử dụng hồn tồn tinh khơng bị nhiễm DNA ngoại lai chứng [-] lại có kết sản phẩm khuếch đại khơng đặc hiệu [+] chứng tỏ PCR mix bị nhiễm DNA ngoại lai § Tuy nhiên chứng [-] cho PCR mix khơng kiểm tra tồn qui trình thực thử nghiệm PCR có bị ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại hay nhiễm chéo khơng Muốn kiểm tra tồn qui trình thực thử nghiệm PCR người thực thử nghiệm phải thực qui trình PCR mẫu thử biết trước [-] tính thực song song với mẫu bệnh phẩm Vì mục đích nên thực thử nghiệm PCR, người thực thử nghiệm nên để dành PCR mix chứng [-] Chứng nội (Internal control, IC) Định nghĩa: Là DNA khuếch đại song song với DNA đích cho sản phẩm khuếch đại có: (1) kích thước khác (trong PCR kinh điển) sản phẩm khuếch đại DNA đích nhờ phân biệt điện di; và/hay (2) trình tự khác hoàn toàn hay khác phần (trong PCR-ELISA hay real-time PCR) nhờ phân biệt sử dụng dò đặc hiệu (specific probe) Các loại chứng nội tại: Có loại chứng nội sau đây, tùy nguồn gốc thiết kế: § Chứng nội DNA gen vật chủ (hình 63-A), ví dụ β globin gene bệnh phẩm mơ lấy từ người, hay myoglobin gene tôm bệnh phẩm 131 mẫu tơm sú Để khuếch đại DNA chứng nội tại, phải cho thêm vào PCR mix cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội nên thiết kế mồi cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp mồi dành cho DNA đích, không tạo dimer primer với mồi DNA đích Do sử dụng DNA gene vật chủ nên chứng nội kiểm sốt mẫu thử có đủ khơng, kiểm sốt hệ thống tách chiết nucleic acid mẫu thử có tốt khơng, kiểm sốt ức chế có hay khơng Tuy nhiên loại chứng nội khơng kiểm sốt hệ thống khuếch đại DNA đích dùng mồi khác biệt dùng cho số bệnh phẩm có chứa đủ lượng tế bào mơ vật chủ B A D C Hình 63: Các lọai chứng nội (A) gene vật chủ; (B) DNA tổng hợp có nguồn gốc từ DNA đích; (c) DNA tổng hợp có nguồn khác DNA đích sử dụng mồi DNA đích; (D) DNA khác biệt hịan tịan với DNA đích § Chứng nội DNA tổng hợp có nguồn gốc DNA đích (hình 63-B), DNA tổng hợp cách dùng sản phẩm khuếch đại DNA đích cắt ngắn hay chèn đoạn DNA nhỏ để làm cho dài Chứng nội loại sử dụng mồi với DNA đích nên khơng cần thiết kế mồi thêm vào PCR mix § Chứng nội DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đích sử dụng mồi với DNA đích (hình 63-C), DNA tổng hợp cách dùng 132 sản phẩm khuếch đại DNA khác biệt với DNA đích chèn hai đầu trình tự giống hệt trình tự mồi DNA đích Do sử dụng mồi với DNA đích nên không cần thiết kế mồi thêm vào PCR mix § Chứng nội hệ thống mồi DNA khác biệt với DNA đích (hình 63- D), Được khuếch đại song song với DNA đích dùng mồi khác biệt DNA đích DNA chứng nội có nguồn gốc khác biệt hồn tồn với DNA đích Để khuếch đại DNA chứng nội tại, phải cho thêm vào PCR mix cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội nên thiết kế mồi cho nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ bắt cặp mồi dành cho DNA đích, không tạo dimer primer với mồi DNA đích Vai trị chứng nội tại: Tuỳ cho vào giai đoạn mà chứng nội dùng cho vai trị sau: § Kiểm soát tách chiết mẫu bệnh phẩm tốt hay không cho vào bệnh phẩm lượng tối thiểu vừa đủ (LOD) hay có sẵn bệnh phẩm § Kiểm sốt ức chế để xác định kết âm tính thật hay âm tính giả có ức chế cịn diện mẫu tách chiết cho vào PCR mix nồng độ LOD trước hay sau cho tách chiết DNA từ bệnh phẩm § Kiểm sốt hệ thống khuếch đại DNA đích có đạt độ nhạy hay không chứng nội dùng chung mồi với DNA đích diện mẫu thử hay cho vào PCR mix nồng độ LOD § Kiểm sốt hệ thống tách chiết dùng có tốt hay khơng thao tác có ngoại nhiễm khơng có sẵn mẫu thật làm chứng âm hay cho vào mẫu thật làm chứng âm để tham gia tách chiết với mẫu bệnh phẩm h Các vấn đề kỹ thuật cần biết đọc phân tích kết real-time PCR định lượng sử dụng mồi taqman probe Sau hịan tất chương trình chạy real-time PCR máy, phân tích để có kết định lượng xác vấn đề quan trọng địi hỏi người phân tích phải hiểu rõ vấn đề lý thuyết kỹ thuật real-time PCR Ở chúng tơi xin trình bày bước phân tích kết real-time PCR với mồi đặc hiệu Taqman probe gắn màu FAM phát hùynh quang dành phát hiện/định lượng DNA đích, cịn 133 Taqman probe gắn màu Hex phát hùynh quang dành phát sản phẩm khuếch đại từ chứng nội sử dụng chung mồi DNA đích Phân tích kết nên theo bước sau Trước hết chọn giếng chứng ❬☎✆: Chỉ chọn giếng để phân tích giếng chứng [-] Chọn kênh hùynh quang “Fam”, thấy giếng chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại không vượt qua khỏi đường hùynh quang (baseline) tức âm tính Nếu kênh “Fam” mà chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua khỏi baseline (dương tính) có nguy ngoại nhiễm trình cho mẫu vào PCR mix Bỏ kênh hùynh quang “Fam”, chọn kênh hùynh quang “Hex”, lúc chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua khỏi baseline (dương tính) Nếu kênh “Hex” mà chứng [-] cho đường biểu diễn khuếch đại khơng vượt qua khỏi baseline (âm tính) có nguy PCR mix khơng đủ nhạy cảm cho khuếch đại/phát DNA chứng nội hay chứng nội cho vào bị hư (khi tất giếng khác, đường biểu diễn khuếch đại kênh Hex âm tính, tình phải yêu cầu nhà sản xuất cung cấp lại chứng nội tại) Định đường chuẩn: Chỉ chọn kênh hùynh quang “Fam” kênh hùynh quang cho taqman probe DNA đích, “Hex” không Chọn chọn kênh giếng chuẩn giếng chứng [-], đồng thời loại trừ giếng có mẫu thử giếng khác Sau cho giá trị số (copies) DNA đích chuẩn ban đầu Biểu đồ 17: Một biểu đồ chuẩn đánh giá đạt có E khỏang 90-105%, cịn R2≥0.99 Phải có biểu đồ chuẩn đạt tiếp tục phân tích kết vào giếng chứa độ pha loãng DNA chuẩn Sau cho giá trị số copies vào giếng chuẩn, để máy chọn đường baseline theo chế độ tự động để có biểu đồ chuẩn (gọi standard graph) Nếu đường baseline mà máy chọn theo chế độ tự động cắt phải đường biểu diễn chứng [-] người sử dụng trước hết chỉnh baseline cycle (các chu kỳ nền) giếng chứng [-] để xem đường biểu diễn chứng [-] có hạ 134 xuống khơng, khơng phải nâng đường baseline lên để đường baseline không cắt đường biểu diễn chứng âm Đánh giá biểu đồ chuẩn lý tưởng (biểu đồ 17) biểu đồ cho hệ số tương quan (R) ≥0.990; đồng thời hiệu PCR (PCR efficiency = E) từ 90% đến 105%, độ dốc (slope) đường biểu diễn khỏang -3.4 đến -3.6 Nếu đường biểu diễn không đạt chúng ta, trước hết xem lại giếng chuẩn để điều chỉnh baseline cycle giếng kết hợp với việc nâng lên hay hạ xuống đường baseline để đưa giá trị R E trị số lý tưởng Nếu chưa đưa R E giá trị lý tưởng thay đổi giá trị trị số copies khỏang cho phép không độ pha lõang (ví dụ giá trị ghi 10 copies, thay giá trị từ 10 đến 99; hay giá trị ghi 100 thay giá trị từ 100 đến 999) để có đường biểu diễn chuẩn đạt lý tưởng (tuy nhiên làm cách cách bất khả kháng thơi thật phải thay đổi giá trị số copies chuẩn có nghĩa phải chấp nhận sai số thao tác pipetting rồi, mà chấp nhận phải chấp nhận có sai số kết định lượng) Chuyển biểu đồ khuếch đại sang dạng log để cố định đường sau chuyển lại dạng graph bình thường Ghi nhận trị số baseline đường chuẩn Lưu ý: Việc thực PCR mẫu chuẩn có hai ý ngh a: (1) Cho đường chuẩn để làm sở tính tốn số copies ban đầu mẫu thử; (2) Kiểm soát thao tác pipetting người làm thí nghiệm có tốt khơng, qua trị số R E có đạt khơng Do mà người làm thí nghiệm bắt buộc phải cho mẫu chuẩn chạy PCR Một số công ty nước không hiểu ý nghĩa việc nên họ cung cấp chuẩn cho sẵn vào PCRmix, làm kết định lượng chắn khơng đảm bảo xác khơng thể kiểm soát thao tác pipetting người làm xét nghiệm có tốt khơng Định s✻ lượng copies ban đầu có giếng chứa mẫu thử: Sau có đường chuẩn, xác định số lượng copies ban đầu (SQ = starting quantity) DNA đích giếng mẫu thử cách chọn giếng vào phân tích với giếng chuẩn Đối với mẫu có đường biểu diễn khuếch đại cắt đường baseline số lượng định lượng SQ có thể tích mẫu đưa vào phản ứng (biểu đồ 18) Để tính số copies 1ml huyết thanh, nhân SQ với hệ số K (là 135 hệ số có liên quan đến độ thu hồi sau tách chiết mẫu chuẩn biết rõ số copy có chèn DNA) Biểu đồ ✝✞✟ Mẫu có đường biểu diễn khuếch đại ngóc lên cắt baseline mẫu định lượng dương tính Trị số định lượng SQ xác định số copies có thể tích mẫu thử cho vào ống phản ứng Số lượng copiesDNA có ml máu bệnh nhân tính cách nhân SQ với 50 Biểu đồ 19: Mẫu kết luận âm tính (đường biểu diễn khuếch đại đọc kêng FAM khơng ngóc lên) hay ngưỡng phát (đường biểu diễn khuếch đại đọc kêng FAM ngóc lên khơng cắt đường baseline) có tín hiệu khuếch đại chứng nội đọc kênh hùynh quang HEX Đối với mẫu mà đường biểu diễn khuếch đại khơng ngóc lên hay ngóc lên khơng cắt baseline chọn thêm kênh màu “Hex” để xem có đường biểu diễn khuếch đại DNA chứng nội hay khơng? Nếu có kết luận “mẫu âm tính” mẫu có đường biểu diễn khuếch đại khơng ngóc lên (biểu đồ 19) trả lời “mẫu ngưỡng phát hiện” mẫu có đường biểu diễn khuếch đại ngóc lên khơng cắt đường baseline Nếu khơng có đường biểu diễn khuếch đại chứng nội có khả mẫu cịn chất ức chế, nên thực lại tách chiết, mẫu bị ức chế (khơng có tín hiệu 136 khuếch đại DNA chứng nội tại) kết luận “mẫu bị ức chế, xin mẫu khác để làm lại” Đối với mẫu có đường biểu diễn khuếch đại cắt đường baseline sớm ngóc lên sớm cắt đường baseline lại khơng ngóc lên thêm nữa, chọn giếng này, chỉnh lại baseline cycle có máy tự động chọn khỏang baseline cycle ngắn nên làm mẫu có tín hiệu khuếch đại ngóc lên q sớm Nếu sau chọn lại mẫu có đường biểu diễn khuếch đại giống mẫu âm tính phân tích mẫu âm tính Nếu có đường biểu diễn khuếch đại giống mẫu dương tính phân tích giống mẫu dương tính i Trả lời kết PCR/real-time PCR chuẩn mực PCR/real-time PCR xét nghiệm nhạy cảm đặc hiệu Tuy nhiên chất lượng xét nghiệm tuỳ thuộc vào phương pháp trình độ thực xét nghiệm, ưu điểm đạt người làm xét nghiệm có đủ tri thức để kiểm sốt sơ sót q trình thực xét nghiệm thơng qua chuẩn mực bắt buộc phải có làm xét nghiệm Chứng [+] phải cho kết [+] để chứng minh khâu khu❀ch ✠✡i ✠✡ t ✠☛ nhạy Chứng [-] phải cho kết [-]với đích phải cho kết [+] với chứng nội để chứng minh khâu tách chi❀ t khu❀ch ✠✡ i ✠✡ t ✠☛ nhạy q trình làm xét nghiệm khơng b ❄ ngoại nhi❆ m Mẫu muốn kết luận [-] phải cho kết [+] với chứng nội kết [-] với đích để chứng minh m ❈u khơng bị ức chế Hình 64: Một kết PCR định tính chuẩn mực phải thể tất điểm kiểm sốt q trình làm xét nghiệm giải thích Ngồi địi hỏi quan real-time PCR định lượng, phải có kết định lượng xác Trong y sinh học, xét nghiệm định lượng đòi hỏi phải chạy mẫu thử lúc với mẫu chuẩn Mẫu chuẩn PCR định lượng phải cho kết đạt tuyến tính cao với hiệu PCR tuyệt đối để chứng minh người làm xét nghiệm thao tác pipetting chuẩn, khơng có sơ sót Khơng 137 phải biết sử dụng chuẩn mực để kiểm soát chất lượng khâu làm xét nghiệm, mà khâu trả lòi kết xét nghiệm, người làm thí nghiệm phải thể kiểm soát phiếu trả lời Một kết xét nghiệm PCR định tính đến Khuếch đại nộng độ chuẩn trình tự đích Khuếch đại chứng nội phát nhờ taqman probe đặc hiệu giúp người sử dụng kiểm sóat đ c c ch mẫu có hay khơng tay người định xét ☞✌ ✰ nghiệm khơng Khuếch đại trình tự chứng nội ✍ Khơng có khuếch đại đích xem chuẩn mực phiếu trả lời kết chứng minh kiểm sốt có ✦✎ Các chuẩn giúp kiểm sóat xác pipetting biểu đồ chuẩn đạt R≥0.99 and E=90-105% giúp định lượng xác số copies đích có mẫu thử thực trình làm xét nghiệm Hình 64 minh họa cắt nghĩa chuẩn mực phải thể kết xét nghiệm PCR định tính Một kết xét Biểu đồ 20: Minh họa trình bày kết PCR định lượng chuẩn mực với biểu đồ chuẩn chứng minh mẫu chạy chung với chuẩn thao tác pipetting kiểm soát chuẩn mực (B), nhờ mà kết định lượng xác (A) nghiệm PCR định lượng đến tay người định xét nghiệm không xem chuẩn mực phiếu trả lời kết chứng minh (i) mẫu thử chạy chung với mẫu chuẩn qua đường biểu diễn chuẩn có vị trí mẫu thử, (ii) thao tác định lượng chuẩn mực qua hiệu PCR hệ số tương quan biểu đồ chuẩn đạt thông số lý tưởng, (iii) mẫu kết luận âm tính hay ngưỡng phải có dường biểu diễn khuếch đại chứng nội Các biểu đồ 20-A 20-B minh họa cắt nghĩa chuẩn mực phải thể kết xét nghiệm real-time PCR định lượng Thao tác thí nghiệm chuẩn mực thể kết chuẩn mực, PCR/real-time PCR chẩn đốn 138 j Các vấn đề kỹ thuật cần biết sử dụng kết PCR/real-time PCR chẩn đoán PCR/real-time PCR công cụ tuyệt vời dùng chẩn đốn độ nhạy cảm khó có xét nghiệm sánh kịp, đồng thời độ đặc hiệu PCR/realtime PCR chẩn đoán phát tác nhân vi sinh gây bệnh khơng khác phương pháp vi sinh nuôi cấy Tuy nhiên việc sử dụng kết PCR/real-time PCR có hiệu hay khơng tùy thuộc vào hiểu biết người sử dụng kết cho định làm xét nghiệm Chúng xin đưa số minh họa sử dụng kết PCR/real-time PCR để phát tác nhân vi sinh gây bệnh cho người Kết PCR/real-time PCR [+] có xác định người bị thử nhiễm tác nhân vi sinh gây bệnh?: Đúng PCR/real-time PCR phát trực tiếp tác nhân vi sinh gây bệnh thơng qua phát nucleic acid đích đặc hiệu vi sinh vật có mặt bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân Tuy xác định người bị thử thử nhiễm tác nhân vi sinh gây bệnh có xác định người bị bệnh hay không để điều trị vấn đề khác Lấy ví dụ người thử đàm phát vi khuẩn lao thử nghiệm PCR, kết [+], bác sĩ chưa nên cho định điều trị lao mà phải xem thử X quang phổn có thâm nhiễm rõ đỉnh phổi tiêu biểu cho nhiễm lao hay không điều trị Nếu X quang phổi bình thường nên theo dõi tiếp quan xét nghiệm PCR qua X quang phổi để xem có diễn tiến đến lao hay khơng tong vịng 1-3 tháng, khơng diễn tiến đến lao khơng cần thiết để điều trị cho bệnh nhân Kết PCR/real-time PCR [-] có xác định người bị thử không mang tác nhân gây bệnh không? Không PCR/real-time PCR khơng thể cho giá trị tiên đoán âm (negative predictive value, NPV) đạt 100% cho dù lấy mẫu xác thử nghiệm xác, kết tùy thuộc nhiều vào diễn tiến tác nhân gây bệnh thể người thử Ví dụ người HbsAg [+], thử HBV-DNA cho kết [-], nói người khơng nhiễm HBV hay khơng? Chắc chắn khơng, người mang HBV gan giai đọan mà miễn dịch không đặc hiệu thể át chế virus nên HBV gan tạo virus khơng hịan chỉnh kháng ngun bề mặt khơng có lõi DNA mà thơi Đây trường hợp người lành mang HBV, người bị nhiễm HBV có 139 nguy lây nhiễm cho người khác Do thường gặp nhiều kết HBV-DNA [-] bệnh nhân HBsAg [+] Sử dụng kết real-time PCR định lượng cho đúng? Đây vấn đề cần bàn Chúng ta biết real-time PCR dùng định lượng tác nhân vi sinh đích, gọi qPCR, có giá trị để đánh giá theo dõi hiệu điều trị bệnh nhiễm virus HBV, HCV, HIV Tuy nhiên làm để biết khác biệt kết định lượng có ý nghĩa? Có nhiều người nhầm lẫn vấn đề nên cho đánh giá hay nhận xét sai lầm hiệu điều trị Kết định lượng coi khác biệt khác biệt hai lần thử hay 100 lần, gọi log10 Lý phải log10 định lượng người ta xây dựng đường chuẩn dựa vào độ pha loãng theo hệ số 10 nồng độ DNA chuẩn, sai số chấp nhận vòng độ pha lõang nên kết xem khác biệt cách độ pha lõang, tức log10 Chính vậy, để tránh cho nhà lâm sàng đánh giá sai, giới nhà bệnh học chấp nhận trả lòi kết log10 khơng phải số lượng copy xác Ví dụ kết 425,379,000 copy trả lời 4.25 log 8, hay đơn giản log Như kết lần 117,318,000 copy trả lời 1.17 log 8, hay đơn giản log Với cách trả lời bác sĩ điều trị thấy lượng virus chưa giảm sau thời gian điều trị Ngoài ra, nhà điều trị hiểu vấn đề này, họ không định cho bệnh nhân làm xét nghiệm định lượng thời gian ngắn vài tuần sau xét nghiệm định lượng, chắn thời gian ngắn khó để đánh giá so sánh kết định lượng với d ng m t phịng thí nghiệm time PCR chẩn ốn Một phịng thí nghiệm PCR chẩn đốn bao gồm phòng khu vực làm việc sau: Phòng tách chiết nucleic acid Đây phòng làm nhiệm vụ tách chiết nucleic acid cho mẫu tách chiết vào PCR/real-time PCR mix để chuẩn bị cho vào máy chạy PCR Phòng cần trang bị thiết bị dụng cụ sau: 140 Một buồng thao tác PCR tủ thao tác khí tỉnh có trang bị đèn chiếu sáng đèn cực tím, buồng đặt từ hãng sản xuất nước ngồi hay tự đóng (hình 65) Kích thước tối thiểu cho người làm việc Trong buồng thao tác phải trang bị dụng cụ thiết bị sau: vortex x 2, máy ủ nhiệt khô x 2, máy hút chân không x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, lọ để vật liệu dơ, nhiễm x Các thiết bị khác phải có: máy ly tâm 13,000 x 2, máy ly tâm lạnh 13,000 x 1, máy ly tâm bàn 4000 cho tube 15ml x 1, tủ đông -18 đến -30oC với số lượng tùy vào mẫu nhiều hay ít, tủ mát # 280 lít với số lượng tùy mẫu nhiều hay Phịng đặt máy PCR real-time PCR Đây phòng làm nhiệm vụ chạy máy PCR real-time PCR Phòng cần trang bị máy real-time PCR máy PCR thường với số lượng tùy mẫu nhiều hay Để làm chẩn đốn nên đặt máy hãng có giấy phép quốc tế (lisence) cung cấp máy PCR/real-time PCR dùng cho chẩn đốn Biorad cơng ty có giấy phép Để đảm bảo máy chạy ổn định, khơng bị tắt cúp điện chừng nên trang bị lưu điện 6KVA phải có dây nối đất Phịng đặt máy PCR nên thơng với phòng tách chiết nucleic acid Phòng điện di đọc kết Đây phòng làm nhiệm vụ chế gel điện di, thực điện di đọc kết điện di Phòng phải trang bị thiết bị dụng cụ sau: Một buồng thao tác điện di: tủ thao tác khí tỉnh có trang bị đèn chiếu sáng đèn cực tím, buồng đặt từ hãng sản xuất nước ngồi hay tự đóng (hình 65) Kích thước tối thiểu cho người làm việc Trong buồng thao tác phải trang bị dụng cụ thiết bị sau: vortex x 1, điện di agarose loại minigel x 2, máy ly tâm compact x 1, micropipette 1-20ul x 1, hộp nhựa đựng gel dùng xong x 1, hộp nhựa đựng gel chưa/đang dùng x 1, hộp nhựa đựng đầu pipette dơ x Các dụng cụ thiết bị khác phải có là: lị vi sóng, hệ thống chụp ảnh gel, tủ đổ gel, cân điện tử để cân agarose 141 Phòng điện di đọc kết nên tách biệt hay thông với phòng đặt máy PCR/real-time PCR Phòng pha chế thuốc thử PCR real-time PCR Chỉ có phịng thí nghiệm chẩn đốn lớn nên có phịng này, phải tách phịng nói Phòng trước vào phải thay áo áo chun dùng phịng mà thơi Các thiết bị, hóa chất, dụng cụ để pha để phịng, khơng đem ngồi Nói chung phòng phải tinh Các thiết bị dụng cụ phịng nên có là: Tủ thao tác pha chế thuốc thử, nên clean bench dành cho người có trang bị đèn cực tím đèn chiếu sáng Trong tủ trang bị: vortex x 1, máy ủ nhiệt khô x 1, máy ly tâm 13000 x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, lọ để vật liệu dơ, nhiễm x Tủ thao tác cân chỉnh pH, nên clean bench dành cho hay người có trang bị đèn cực tím đèn chiếu sáng, bên có: cân điện tử x 1, máy đo pH x1, khuấy từ x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x1 Tủ thao tác pha hóa chất độc, nên tủ an tịan sinh học lớp bên trang bị cân điện tử x 1, máy đo pH x1, khuấy từ x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x 1, pipette aid x Các thiết bị khác, có số lượng tùy qui mơ, máy làm đá vảy, máy ly tâm 13,000 x1, máy ly tâm bàn 4000 cho tube 15ml x 1, tủ đông -18 đến -30oC với số lượng tùy vào mẫu nhiều hay ít, tủ mát # 280 lít với số lượng tùy mẫu nhiều hay Dưới minh họa phịng thí nghiệm sinh học phân tử chẩn đốn lớn bao gồm cà PCR/real-time PCR giải trình tự (hình 66, 67) dành cho bệnh viện lớn thành phố Hồ Chí Minh mà chúng tơi gửi thiết kế Ngồi chúng tơi đưa thiết kế phịng thí nghiệm PCR/real-time PCR cho phịng thí nghiệm trung bình (hình 68) 142 Hình 65: Mơ hình tủ thao tác PCR tự đóng Hình 66: Sơ đồ phòng pha chế thuốc thử sinh học phân tử 143 Hình 67: Sơ đồ phịng tách chiết nucleic acid phịng điện di kết hợp phịng giải trình tự 144 Hình ✏✑: Sơ đồ phịng thí nghiệm PCR real-time PCR dành cho phịng thí nghiệm lâm sàng bệnh viện tuyến thành phố hay tỉnh 145 ... xét nghiệm PCR/ real- time PCR chẩn đoán vấn đề kỹ thuật cần quan tâm 116 Các v✯n ✬✁ kỹ thuật cần quan tâm a Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm lấy gửi mẫu thử Mẫu thử lấy làm xét nghiệm PCR/ real- time. .. xét nghiệm real- time PCR định lượng Thao tác thí nghiệm chuẩn mực thể kết chuẩn mực, PCR/ real- time PCR chẩn đoán 138 j Các vấn đề kỹ thuật cần biết sử dụng kết PCR/ real- time PCR chẩn đốn PCR/ real- time. .. PCR, phải kịp thời đến tay người định xét nghiệm Các vấn kỹ thuật c n quan tâm áp dụng PCR real- time PCR chẩn oán Tiến trình xét nghiệm PCR real- time PCR Kể từ lấy mẫu thử gửi đến phịng thí nghiệm