PCR và realtime PCR các vấn đề cơ bản và áp dụng thường gặp

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác MẪU MÁU Mục tiêu · Giúp lâm sàng cho đònh cấy máu thích hợp biết đònh cấy máu thời điểm tốt để thực cấy máu, · Thực cách xét nghiệm cấy máu biết cách thực cấy máu nào, bao gồm thể tích máu nên lấy để cấy bao nhiêu, nên cấy máu lần? · Lựa chọn phương tiện thích hợp cho cấy máu bệnh viện nhờ biết phương tiện (môi trường) phù hợp để cấy máu · Thực tốt qui trình theo dõi cấy máu cho kết xác – kòp thời đến lâm sàng biết qui trình theo dõi cấy máu · Biện luận cách xác kết cấy máu biết vi khuẩn thường gặp cấy máu vi khuẩn nào? Làm để nhận biết cấy máu dương tính thật với cấy máu dương tính ngoại nhiễm Chỉ đònh cấy máu ¦ Phải đònh cấy máu trước trường hợp nhiễm trùng có du khuẩn huyết tạm thời (transient bacteremia) hay nhiễm trùng huyết (septicemia) ¦ Do vậy, nên đònh cấy máu trước bệnh nhân có triệu chứng sốt, ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim (cardiac murmur) nghi ngờ viêm nội tâm mạc, có xuất huyết da hay niêm mạc, xuất huyết dạng (splinder) móng tay, choáng Thời điểm cấy máu ¦ Phải cấy máu trước bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống Trong bệnh viện, Bác só phải cho cấy máu trước bắt đầu cho bệnh nhân dùng kháng sinh ¦ Tuy nhiên trường hợp bệnh nhân điều trò kháng sinh triệu chứng du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết không thuyên giảm bác só nên cho đònh cấy máu để phát tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng ¦ Thời điểm tốt để cấy máu bệnh nhân bò ớn lạnh hay lạnh run trước sốt, hay lúc bệnh nhân lên sốt 14 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác ¦ Có thể cấy máu lần vòng đầu, thực cấy máu vò trí lấy máu khác thể (vd: lần đầu lấy máu tay mặt lần sau lấy máu tay trái) Cách lấy máu để cấy ¦ Lấy máu tónh mạch phương pháp vô trùng (sát trùng da cồn 70%, chờ khô chọc kim lấy máu) ¦ Thể tích máu lấy để cấy nên chiếm 1/10 hay tối đa 1/5 thể tích môi trường cấy máu Thông thường lấy 3-10ml máu để cấy vào môi trường cấy máu tích 50ml Đối với trường hợp bệnh nhân trẻ em, lấy khoảng 2-3ml máu để cấy vừa Môi trường cấy máu ¦ BHI, TSB hay Columbia broth, cho vi khuẩn hiếu khí ¦ Để cấy kỵ khí, thêm vào môi trường chất khử Thioglycollate, L-cysteine ¦ Để kháng đông, tốt dùng Sodium Polyanethol Sulfonate (SPS), dùng citrate hay heparin Theo dõi cấy máu ¦ Chai cấy máu ủ tủ ấm 35oC hay 37oC theo dõi ngày 5-7 ngày xem có dấu hiệu có vi khuẩn mọc hay không môi trường cấy máu lỏng, là: (1) có hạt đóng mặt hồng cầu, (2) đục hay có màng, (3) tiêu huyết, (4) đông huyết tương, (5) có gas, (6) có hạt trắng lớp hồng cầu hay mặt lớp hồng cầu ¦ Nếu chai cấy máu có phase trước ủ ngày sau quan sát mặt thạch phase đặc xem có khúm vi khuẩn mọc hay không? khúm vi khuẩn mọc phase đặc, tráng phase lỏng lên phase đặc Có số vi khuẩn dễ bò ly giải sau mọc môi trường lỏng S pneumoniae, hay khó mọc thành khúm phase đặc Streptococci, nên làm cấy truyền mù lên mặt thạch (thạch máu hay thạch nâu, sau ủ tủ ấm CO2 hay bình nến) sau ủ chai cấy máu qua đêm sau 24 ¦ Bất lúc phát có dấu hiệu vi khuẩn mọc (trên phase đặc thấy có khúm vi khuẩn mọc, hay phase lỏng thấy có dấu hiệu vi khuẩn mọc kể trên) hay nghi ngờ vi khuẩn mọc, tiến hành cấy phân lập ngay, tốt thạch bổ dưỡng 15 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác thạch nâu có bổ sung XV (CAXV = Chocolate Agar Isovitex), cấy thạch máu (BA) hay thạch nâu (CA), đồng thời làm phết nhuộm Gram khảo sát trực tiếp Nếu kết nhuộm Gram thấy có vi khuẩn, làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu Nếu phase đặc có vi khuẩn mọc tiến hành đònh danh làm kháng sinh đồ ¦ Sau ngày theo dõi chai cấy máu, phải cấy truyền mù lần để chắn vi khuẩn mọc chai cấy máu trước trả lời cấy máu âm tính Các vi khuẩn hay vi nấm thường tác nhân nhiễm trùng huyết hay nhiễm nấm huyết ¦ ¦ Gram (-) Ư Staphylococcus aureus Ư Escherichia Coli Ư S epidermidis Ư Klebsiella spp Ư S pyogenes (nhóm A) Ư Enterobacter spp Ư S agalactiae (nhóm B) Ư Proteus spp Ư Streptococci tiêu huyết a Ư Samonella typhi Ư Samonella (ngoài S typhi) Ư Streptococcus pneumoniae Ư Pseudomonas aeruginosa Ư E faecalis (nhóm D) Ư Neisseria meningitidis Ư Listeria monocytogenes Ư Haemophilus influenzae Ư Clostridium perfringens Ư Bacteroides fragilis Ư Peptococcus spp Ư Brucella spp Ư Peptostreptococcus spp Ư Pseudomonas pseudomallei Ư Candida albicans nấm men (viridans) khác Gram (+) nấm men Vấn đề vi khuẩn ngoại nhiễm ¦ Các vi khuẩn ngoại nhiễm Từ da: Ư Ư Propionobacterium acnes, Ư Diphtheroides Từ môi trường xung quanh: Staphylococcus epidermidis, 16 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Ư Clostridium spp., Ư Acinetobacter spp., Ư Bacillus spp - phẩm khác bệnh nhân - - cấy máu cho thấy vi khuẩn: - Vi khuẩn mọc nhanh (trong vòng 48 giờ) Loại trừ ngoại nhiễm kết ¦ Cùng phân lập từ bệnh Các dòng vi khuẩn có type sinh học đề kháng với kháng Cùng phân lập từ hai chai cấy sinh cấy từ hai chai cấy máu máu cấy từ bệnh nhân khác bệnh nhân Trả lời kết cấy máu dương tính Tất vi khuẩn mọc chai cấy máu phải trả lời cho Bác só điều trò Tham khảo với Bác só lâm sàng để rút kinh nghiệm trường hợp ngoại nhiễm Các vi khuẩn nghi ngoại nhiễm, không cần thiết phải làm kháng sinh đồ thông báo cho Bác só biết nghi ngờ Phải thường xuyên thông báo cho bác só lâm sàng biết kết tạm thời thấy có dấu hiệu vi khuẩn mọc phiếu trả lời kết tạm thời Câu hỏi ôn tập Hãy cho biết bệnh nhân cần phải cấy máu? Cấy máu cho bệnh nhân vào thời điểm tốt nhất? Cần phải cấy lần? Thể tích máu cấy tỷ lệ máu cấy so với môi trường cấy máu nên tốt? Môi trường cấy máu tốt nhất? Kháng đông tốt sao? Chai môi trường cấy máu thích hợp cho bệnh viện Việt Nam loại nào? Phân tích ưu khuyết điểm chai cấy máu này? Hãy cho biết cách theo dõi chai cấy máu phase phòng thí nghiệm? Dấu hiệu cho biết chai cấy máu dương tính (có vi khuẩn mọc)? Thời gian theo dõi chai cấy máu trả lời kết cuối bao lâu? Hãy cho biết vi khuẩn thường gặp cấy máu dương tính? Làm nhận biết cấy máu dương tính thật hay ngoại nhiễm? 17 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác CẤY MÁU – Các câu hỏi thường gặp Trên thực tế, tỷ lệ cấy máu dương tính bệnh viện thấp, có phải đònh cấy máu rộng rãi không? ¦ Thật tỷ lệ cấy máu dương tính thấp bệnh viện đònh cấy máu rộng rãi mà lại lâm sàng nghó đến việc cho đònh cấy máu sớm từ đầu Lâm sàng cho cấy máu sau thất bại điều trò kháng sinh đònh cấy máu hẹp nầy làm cho tỷ lệ cấy máu dương tính bệnh viện thấp ¦ Cấy máu xét nghiệm vi sinh lâm sàng cần phải thực trước trường hợp bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ có du khuẩn huyết tạm thời (nhiễm trùng hô hấp cấp ), nhiễm trùng huyết, hay có nguy nhiễm trùng huyết (thương hàn, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng gan mật ) Cấy máu cần phải thực bệnh nhân có dấu hiệu nhiễm trùng mạch máu hay tim mạch (viêm valve tim cấp tính hay bán cấp, viêm nội mạc mạch máu ) Nói chung đònh cấy máu rộng rãi, gần đònh làm công thức bạch cầu trước bệnh nhân có dấu chứng nhiễm trùng Thời điểm tốt để cấy máu nào, nên cấy máu lần? ¦ Tốt cấy máu trước cho bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống Tuy nhiên phải đònh cấy máu trường hợp bệnh nhân dùng kháng sinh mà dấu hiệu nhiễm trùng tiến triển ¦ Thời điểm cấy máu tốt lúc bệnh nhân lên sốt hay lúc bệnh nhân rét run Có thể thực hai lần cấy máu cách vò trí lấy máu khác (lần đầu lấy máu tay mặt, lần sau lấy máu tay trái chẳng hạn ) Nên lấy thể tích máu để cấy? ¦ Thể tích máu cấy 1/10 hay tối đa 1/5 thể tích môi trường cấy máu ¦ Người lớn, lần cấy, lấy 5-10ml máu cho vào chai 50ml môi trường Trẻ từ 1ml đến 3ml cho chai 30 đến 50ml môi trường Phương tiện thích hợp cho bệnh viện để cấy máu? ¦ Phương tiện cấy máu thích hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm lâm sàng chai cấy máu phase công ty Nam Khoa sản xuất Chai cấy máu có đủ ưu điểm môi trường cấy máu lý tưởng, phương pháp cấy máu giường thuận tiện, phương pháp theo dõi để phát vi khuẩn tiện lợi 18 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Qui trình theo dõi cấy máu thực nào? Bao lâu sau lâm sàng có kết cấy máu? ¦ Để theo dõi cấy máu, cần phải ủ chai cấy máu tủ ấm 35-37oC liên tục 5-7 ngày Sau ngày đầu, phải cấy mù lên hộp thạch CA để phát vi khuẩn mọc nhanh khó thành khúm mặt thạch nghiêng chai cấy máu phase, ngày sau tráng phase lỏng lên phase đặc để cấy vi khuẩn mọc phase đặc lên mặt nghiêng Bất lúc phát vi khuẩn mọc phase lỏng hay phase đặc phải tiến hành đònh danh kháng sinh đồ Ngày theo dõi cuối cùng, phải cấy mù lần lên thạch CA để đảm bảo vi khuẩn mọc trước trả lời kết cấy máu âm tính ¦ Một qui trình cấy máu theo dõi cấy máu để trả lời kết cho lâm sàng tối đa ngày Nhiều trường hợp vi khuẩn mọc nhanh, ta có kết vòng 48 Vì cấy máu cần phải có thời gian nên lúc phát có vi khuẩn mọc chai cấy máu phải trả lời kết tạm thời cho lâm sàng trước cho kết chung Làm nhận biết chai cấy máu dương tính ngoại nhiễm ¦ Một kết cấy máu dương tính ngoai nhiễm nhận biết khi: (1) Các vi khuẩn phân lập vi khuẩn hoại sinh Bacillus subtilis, Bacillus cereus ; (2) Vi khuẩn cấy hai chai cấy máu bệnh nhân thời điểm hay hai thời điểm cách 30’ đến 1giờ lại có kết khác ¦ Một kết cấy máu chắn dương tính thật khi: (1) Vi khuẩn cấy vi khuẩn chắn gây bệnh, hoại sinh như: S typhi, S pneumoniae, N meningitidis ; (2) Vi khuẩn mọc nhanh, 24 sau cấy; (3) Vi khuẩn cấy hai chai cấy máu bệnh nhân cho kết giống nhau; (4) Vi khuẩn từ cấy máu giống hệt vi khuẩn phân lập từ nhiễm trùng khác nguồn gốc gây du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết 19 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sản phẩm liên quan: Chai cấy máu HAI PHASE Mô tả ¦ Chai cấy máu HAI PHASE (BIPHASIC) sản phẩm từ đề tài nghiên cứu cấp TS BS Phạm Hùng Vân Sản phẩm nầy dùng lần (disposable), không dùng lại Cấu tạo (xem hình dưới) gồm thành phần sau: Chai nhựa polystyrene Nút cao su để chọc kim cấy máu qua, làm cao su trung tính Nắp vặn nhựa màu đỏ để mở nắp chai cấy máu cấy truyền có dấu hiệu vi khuẩn mọc phase lỏng hay bề mặt phase đặc Nắp che nhựa màu xanh để bảo vệ phần nút cao su Phase đặc mặt môi trường BHI agar (Difco, Biorad hay Merck) Phase lỏng BHI lỏng (Difco, Biorad hay Merck) có SPS (Sigma) Vách ngăn phase đặc phase lỏng ¦ Chai cấy máu bọc màng co, có ghi lot ngày sản xuất Khi chưa dùng, bảo quản tối, nhiệt độ phòng thí nghiệm, có hạn dùng nă m kể từ ngày sản xuất Nếu bảo quản tủ lạnh, SPS bò kết tủa lại, kết tủa nầy tan sau ủ tủ ấm vài Cách cấy máu ¦ Xé rách màng co, rút nắp che khỏi nắp vặn (không vặn nắp) ¦ Sát trùng mặt nút cao su nắp vặn cồn 70% chờ khô ¦ Chọc kim cấy qua nút cao su, bơm 3-10ml máu vào phase lỏng ¦ Đậy nắp che lại Lắc để trộn, tráng qua mặt môi trường phase đặc Ủ 35-37oC Các ưu điểm chai cấy máu hai phase ¦ ¦ Tránh ngoại nhiễm nhờ: · Không cần mở nút chai cấy máu · Cấy truyền chai cấy máu kín từ phase lỏng qua phase đặc Môi trường cấy máu lý tưởng vì: · Chế từ môi trường BHI Difco, Biorad hay Merck · Có SPS với công dụng 20 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác ¦ - Kháng đông, nhờ vi khuẩn không bò bẫy cục máu đông - Ức chế thực bào - Ức chế bổ thể - Ức chế tác động kháng sinh Aminoglycosides Tách rời phase đặc khỏi phase lỏng để: · Nếu máu có chất ức chế vi khuẩn (kháng sinh), chất ức chế từ máu hòa vào phase lỏng sẽ không thấm qua phase đặc Nhờ vi khuẩn không mọc phase lỏng mọc phase đặc · ¦ Làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính Tiết kiệm thời gian, làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu dương tính cách dùng phase lỏng làm huyền dòch vi khuẩn trải lên mặt thạch Mueller Hinton để làm kháng sinh đồ, đọc kết sau 6-8 ủ 95% trường hợp có kết phù hợp với phương pháp chuẩn Nắp che Nút cao su Nút cao su Phase đặc Chai nhựa Phase lỏng Hình 1: Cấu tạo chai cấy máu hai phase 21 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Một số điểm cần cân nhắc để lựa chọn chai cấy máu phase có mặt thò trường việt nam Chai cấy máu phase sản xuất nước Công ty sản xuất đạt ISO 9001:2000, WHO-GMP/GLP (UKASS) Kháng đông SPS Sigma (Mỹ) Môi trường BHI Merck (Đức), hay Biorad (Mỹ) Thể tích môi trường 50ml tương thích để cấy máu cho người lớn (5ml máu) hay nít (1-3ml) Chai nhựa suốt, dễ phát khúm vi khuẩn mọc Tách rời phase đặc khỏi phase lỏng nên khúm vi khuẩn dễ mọc dễ tách rời Dễ thao tác thí nghiệm nhẹ, miệng chai rộng dễ cho vòng cấy vào bên để lấy dòch cấy khúm vi khuẩn Các vi khuẩn khó mọc H influenzae hay S pneumoniae mọc dễ dàng Chai cấy máu phase Ấn Độ (Hi-Media) Không kháng đông SPS Sigma (Mỹ) Môi trường BHI HiMedia (Ấn Độ), xa chất lượng so với BHI Merck hay Biorad Thể tích môi trường