Khảo sát giá trị multiplex real time PCR trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

“KHẢO SÁT GIÁ TRỊ Multiplex Real Time PCR TRONG CHẨN ĐOÁN NHIỄM KHUẨN HUYẾT” BCV: BS Nguyễn Thị Hằng BỆNH VIỆN PHÁPLOGO VIỆT ĐẶT VẤN ĐỀ NKH bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, gây vi khuẩn lưu hành máu Có tỷ lệ tử vong cao Việc chẩn đoán sớm xác tác nhân gây bệnh giúp điều trị nhanh chóng thích hợp, giúp giảm chi phí điều trị tỷ lệ tử vong ĐẶT VẤN ĐỀ Thời gian chờ đợi kết CẤY MÁU Thể tích máu Sử dụng kháng sinh trước lấy mẫu Độ nhạy thấp  NKH cần thiết chẩn đoán sớm  “Tiêu chuẩn vàng" chẩn đoán NKH cấy máu  Các hạn chế cấy máu ĐẶT VẤN ĐỀ Đã có nhiều nghiên cứu giới cho thấy:  Tỷ lệ phát vi khuẩn kỹ thuật PCR cao  Vai trò tích cực PCR chẩn đoán điều trị NKH ĐỘ NHẠY CAO HẠN CHẾ SỬ DỤNG KHÁNG SINH PHỔ RỘNG TRẢ KẾT QUẢ SỚM HẠN CHẾ NHẬP VIỆN VÀO ICU GIẢM CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ PCR ÂM TÍNH GIẢ DO KIT GIẢM TỈ LỆ TỬ VONG MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  Xác định tỉ lệ dương tính vi sinh vật định danh kỹ thuật MRT- PCR bệnh nhân chẩn đoán NKH  Đánh giá giá trị xét nghiệm định danh vi sinh vật kỹ thuật MRT-PCR bệnh nhân chẩn đoán NKH cách so sánh với kỹ thuật cấy máu cổ điển ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NC  91 trường hợp bệnh nhân người lớn khoa cấp cứu khoa hồi sức tích cực, bệnh viện FVTP Hồ Chí Minh từ 5/2015 đến 3/2016  Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang  Tìm tác nhân gây NKH song song phương pháp CM MRT-PRC CHẨN ĐOÁN NHK CẤY MÁU BD (Becton Dickinson) 10-32ml CHAI CẤY MÁU 5ml ỐNG MÁU 1ml BACTE C 9050 ÂM Ủ QUA ĐÊM (1224H) DƯƠNG ĐỊNH DANH VI SINH VẬT (VITEK 2) MRTPCR (CFX) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phổ vi sinh vật kit MRT-PCR nghiên cứu bao gồm vi khuẩn sau:  Các vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, baumanii, Pseudomonas Salmonella sp, aeruginosa, Haemophilus Acinetobacter influenzae, Moracella Cataralis  Các vi khuẩn Gram dương: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus Pyogenes, Streptococcus agalactiae PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Ly giải chiết tách DNA máy Kingfisher mL  Phản ứng MRT-PCR với máy CFX 96 Real-time System Thành phần phản ứng PCR: 10 µl Master Mix Qiagen; 0,1 µl mồi R; 0,1 µl mồi F; 0,05 µl taqman probe; nước khử ion 4,75 µl; µl DNA 10-20 ng/µl chiết tách  Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 95oC/ 15 phút; {95oC/ 30 giây, 60oC/ 60 giây} x 40 chu kỳ KẾT QUẢ: TỈ LỆ DƯƠNG TÍNH   Tỉ lệ dương tính cấy máu cao tỉ lệ dương tính PCR/ống máu (p=0,0002) Tỉ lệ dương tính cấy máu tỉ lệ dương tính PCR/chai cấy không khác có ý nghĩa (p=0.5519) SO SÁNH TỈ LỆ DƯƠNG TÍNH Tỉ lệ dương tính cấy máu MRT_PCR 80 70 % dương tính 60 Cấy máu 50 40 PCR/ống máu 30 20 PCR/ chai cấy 10 Mancini Ephraim Nora S Westh H Guido M Bloos F Leonella Lodes U Tomasz Chúng N [6] L [2] [7] [9] [3] [1] P [4] [5] G [8]   Tỉ lệ PCR/ống máu dương tính mức trung gian Các tác giả khác không thực PCR/chai cấy 10 VI SINH VẬT GÂY NKH Chai cấy Vi khuẩn PCR/ống máu PCR/chai cấy số lượng % số lượng % số lượng % Escherichia coli 21 47,7 12 45,5 20 48,8 Klebsiella pneumoniae 11,4 18,2 12,2 Salmonella sp 6,8 4,5 7,3 Acinetobacter baumanii 2,3 0,0 2,4 Burkhoderia pseudomallei 2,3 0,0 0,0 Staphylococcus aureus 6,8 13,6 12,2 Staphylococcus epidermidis 2,3 0,0 2,4 Staphylococcus caprae 2,3 0,0 0,0 Staphylococcus capitis 2,3 0,0 0,0 Streptococcus pneumoniae 4,5 4,5 4,9 Streptococcus anginosus 4,5 0,0 0,0 Streptococcus group A 2,3 0,0 2,4 Streptococcus group B 2,3 4,5 2,4 Enterococcus faecium 0,0 0,0 4,9 Candida albican 2,3 0,0 0,0 Tổng 44 100 22 100 41 100 11 VI SINH VẬT GÂY NKH     E coli chiếm tỉ lệ cao (47.7%) K pneumoniae (11,4%) S.aureus (6,8%) Salm sp (6,8%) Các vi khuẩn khác chiếm tỉ lệ thấp 12 TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR/ống máu 23 ca (25,6%) không tương hợp (CM+/PCR-)  ca vi sinh vật gây bệnh tìm thấy CM chưa thiết kế mồi cho PCR (S capitis, S caprae, Strep anginosus, B pseudomallei, C albican)  17 ca CM dương với chủng vi khuẩn có phổ kit PCR 13 TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR/chai cấy 12/91 (13,2%) ca không tương hợp CM PCR/chai cấy:  ca CM+/PCR-, có ca vi sinh vật tìm thấy CM chưa có phổ kit PCR ca lại có PCR/chai cấy âm, PCR/ống máu cho kết dương tính vi sinh vật giống kết CM  CM-/PCR+, có ca PCR+ với loại vi khuẩn (K pneumoniae S aureus), ca S aureus ca E faecalis Tất bệnh nhân dùng kháng sinh trước cấy máu 14 TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR 100 90 14,4 3,0 10 7,0 6,7 4,4 8,8 25,6 80 70 47,2 Tỉ lệ % 60 50 71,7 71 77,7 Cấy+/PCR- 52,2 Cấy-/PCR- 40 30 39,6 20 10 Cấy-/PCR+ 10,9 15 Cấy+/PCR+ 22,2 8,6 Westh H [9] Nora Schaub [7] Leonella Pasqualini [4] Chúng PCR/ống máu Chúng PCR/chai cấy Tỉ lệ % tương hợp cấy máu PCR   Chúng có tỉ lệ cấy+/PCR+ cao tỉ lệ cấy+/PCR- trường hợp làm PCR/ống máu, kết (25,6%) cao tác giả khác (p=0.0036) 15 TƯƠNG HỢP GIỮA CẤY MÁU VÀ PCR 100 90 17,4 15 13,2 13,7 25,6 80 Không tương hợp Tỉ lệ % 70 60 50 40 82,6 85 86,8 86,3 74,4 Tương hợp 30 20 10 Westh H [9] Nora Schaub [7] Leonella Pasqualini [4] Chúng PCR/ống máu Chúng PCR/chai cấy Tương hợp cấy máu PCR  Tỉ lệ tương hợp chung cấy máu PCR không khác có ý nghĩa so với tác giả khác 16 THỜI GIAN TRẢ KẾT QUẢ Phương pháp định danh Thời gian trả kết (giờ) CM dương: trả kết nhuộm Gram 23 CM dương: trả kết định danh 45 CM âm: trả kết sau ngày 120 PCR/ống máu PCR/chai cấy ủ qua đêm (12-24 giờ) 22 17 KẾT LUẬN Tỷ lệ dương tính CM tỷ lệ dương tính PCR/chai cấy ủ qua đêm (từ 12-24 giờ) không khác có ý nghĩa (p=0,5519) Kỹ thuật MRT-PCR/chai máu làm tăng tỷ lệ dương tính so với MRT-PCR/ống máu có ý nghĩa thống kê (p= 0,0004) PCR/chai cấy có tỷ lệ tương hợp với CM cao tỷ lệ tương hợp PCR/ống máu với CM có nghĩa thống kê (p= 0,0351) Thời gian trả kết MRT-PCR ngắn nhiều so với CM (p=0,0024) Lượng máu lấy để làm MRT-PCR nhỏ so với lượng máu lấy để CM 18 Xxi 19 ... tính vi sinh vật định danh kỹ thuật MRT- PCR bệnh nhân chẩn đoán NKH  Đánh giá giá trị xét nghiệm định danh vi sinh vật kỹ thuật MRT -PCR bệnh nhân chẩn đoán NKH cách so sánh với kỹ thuật cấy máu... thiết chẩn đoán sớm  “Tiêu chuẩn vàng" chẩn đoán NKH cấy máu  Các hạn chế cấy máu ĐẶT VẤN ĐỀ Đã có nhiều nghiên cứu giới cho thấy:  Tỷ lệ phát vi khuẩn kỹ thuật PCR cao  Vai trò tích cực PCR chẩn. .. NKH bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, gây vi khuẩn lưu hành máu Có tỷ lệ tử vong cao Việc chẩn đoán sớm xác tác nhân gây bệnh giúp điều trị nhanh chóng thích hợp, giúp giảm chi phí điều trị tỷ lệ