Ứng Dụng PCR realtime PCR Trong Chuẩn Đoán Nhiễm Trùng

PCR & REALTIME PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN NHIỄM TRÙNG Phạm Thái Bình NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT PCR Khái niệm PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) thử nghiệm nhân đoạn DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Lòch sử phát minh PCR Tám năm sau (1993), Kary Mullis nhận ½ giải Nobel hóa học Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Nguyên tắc PCR Giai đoạn biến tính: nhiệt độ đưa lên 94oC, liên kết hydro mạch đôi DNA bò đi, nhờ DNA đích bò biến tính thành mạch đơn Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ hạ xuống 55-65oC, đoạn mồi (primer) tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích Giai đoạn kéo dài : nhiệt độ đưa lên 72oC, Tag polymerase kéo dNTP lại đầu 3’ đoạn mồi bắt cặp đầu 5’ sợi DNA đích tổng hợp mạch bổ sung Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Nguyên tắc PCR Qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục n lần từ DNA đích nhân 2n YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT PCR DNA đích Đoạn gen đặc hiệu cho HBV dài khoảng 190bp DNA đích đoạn DNA có trình tự đặc hiệu với tác nhân nhiễm trùng Trình tự DNA đặc hiệu có gen tác nhân nhiễm trùng mà tác nhân nhiễm trùng khác từ thể vật chủ Bộ gen M tuberculosis gồm khoảng 4000 gen Trong có gen IS6110 nằm rãi rác nhiều nơi gen đặc hiệu cho M tuberculosis Đoạn gen chuyên biệt cho IS6110 có độ dài khoảng 249bp DNA đích có vai trò làm khuôn để tổng hợp sợi DNA bổ sung Lượng DNA đích cho thể tích phản ứng: – Plasmide: 1pg → 10ng – Genome: 50 → 500ng PCR mix Thành phần PCR mix: – Moài – Taq polymerase – dNTP – MgCl2 – PCR buffer Mồi (primer) ð Mồi đoạn oligonucleotide dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổ sung với hai đầu trình tự DNA đích ð Mồi phải đặc hiệu, đặc trưng cho trình tự DNA đích, mồi bám vào vò trí đònh gen ð Để mồi bắt cặp cách hoàn toàn đặc hiệu sợi khuôn trình tự DNA đích: – Nhiệt độ bắt cặp (Ta) phải tối ưu thường Ta thấp nhiệt độ chảy (Tm) mồi khoảng 5-10oC – Tm mồi xuôi mồi ngược không khác biệt lớn – Tm mồi phụ thuộc vào chiều dài mồi tỷ lệ G C thành phần moài: Tm (oC) = (A+T) + (C+G) – Tránh trình tự bổ sung môi xuôi mồi ngược – Nucleotide (3 nucleotide nhiều hơn) đầu 3’ mồi nên G C polymer hóa tốt – Khoảng cách tối ưu mồi bám vào DNA khuôn 150-500bp Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Phương pháp PCR Sinh học phân tử NXB Giáo dục Tr 190-198 PCR Guidelines and Optimization www.stratagene.com Mồi (primer) ð Mồi thiết kế phần mềm chuyên dụng (Primer Premier) dựa trên: – Trình tự DNA đích – Thông số lựa chọn: chiều dài mồi, Ta mồi, chiều dài sản phẩm khuếch đại ð Nồng độ mồi cho thể tích phản ứng: – Mồi xuôi (forward primer): 10 → 50pm – Mỗi ngược (reverse primer):10 → 50pm Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Taq polymerase ð DNA Polymerase xúc tác cho tổng hợp DNA theo chiều từ 5’-3’ ð DNA Polymerase nhận diện nucleotide đầu 3’của mồi bắt cặp với nucleotide sợi khuôn nên trượt sợi khuôn để tổng hợp sợi bổ sung ð Tag DNA polymerase (Taq polymerase) enzyme polymerase chòu nhiệt , lần tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (phân lập từ bùn đất suối nước nóng Mỹ) ð Nồng độ Taq polymerase cho thể tích phản ứng từ 1.25 → 2.5 UI (tùy vào nhà sản xuất) Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học dNTP dNTP (Deoxyribonucleotide triphosphate) gồm 04 loại: – dATP (Deoxyadenosine triphosphate) – dCTP (Deoxycytidine triphosphate) – dGTP (Deoxyguanosine triphosphate) – dTTP (Deoxythymidine triphosphate) Nguyên liệu để tổng hợp sợi bổ sung Nồng độ dNTP tối ưu cho thể tích phản ứng 200µM/loại Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Mg2+ Mg2+ (MgCl2 MgSO4) có vai trò cofactor cho hoạt động DNA polymerase Nồng độ Mg2+ yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR tùy thuộc vào phản ứng (loại Taq polymerase, loại DNA đích, thành phần buffer…) – Nồng độ Mg2+ cao: làm xuất sản phẩm PCR không đặc hiệu – Nồng độ Mg2+ thấp làm giảm lượng sản phẩm PCR Nồng độ Mg2+ từ 1.5 → 5mM Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Phương pháp PCR Sinh học phân tử NXB Giáo duïc Tr 190-198 PCR Guidelines and Optimization www.stratagene.com PCR buffer (dung dòch đệm) Thành phần PCR buffer 10X: – Tris HCl 100mM (pH 8.3) – KCl 500mM Phaïm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Số chu kỳ PCR Trên thực tế số lượng chu kỳ cho phản ứng PCR không nên 40 chu kỳ Nguyên nhân giai đoạn đầu số lượng tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng DNA đích ban đầu số hiệu khuếch đại giảm: – Sự phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng – Sự xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng – Các vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với Số chu kỳ phản ứng PCR tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Phương pháp PCR Sinh học phân tử NXB Giáo dục Tr 190-198 Thiết bò PCR Máy luân nhiệt (máy chu kỳ nhiệt, máy PCR) máy tạo chu kỳ nhiệt với buồng ủ nhiệt có nhiệt độ lên xuống xác đồng , tốc độ gia giảm nhiệt cực nhanh theo chu kỳ MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP PCR đơn mồi (monoplex PCR) PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn DNA đích từ vi sinh vật muốn phát Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học PCR đa mồi (multiplex PCR) PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích từ nhiều vi sinh vật khác muốn phát đồng thời Multiplex PCR: – Thiết kế cặp mồi có Ta lên DNA đích đồng thời mồi phải không bắt cặp với – Độ nhạy phat tác nhân đích không bò giảm mà phải tương đương với PCR đơn mồi Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 10 Quy trình kỹ thuật Realtime PCR Ly trích DNA từ bệnh phẩm Bệnh phẩm DNA cho vào Realtime PCR mix chạy chương trình chu kỳ nhiệt Phân tích kết Biểu đồ khuếch đại Realtime PCR Giai đoạn ủ Giai đoạn lũy thừa DNA đích nhân thành số lượng chưa đủ để máy ghi nhận cường độ huỳnh quang phát Cường độ huỳnh quang tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt Giai đoạn bình nguyên Cường độ huỳnh quang đạt cân Đường biểu diễn khuếch đại Trung bình cộng cường độ huỳnh quang chu kỳ tất mẫu (mẫu thử & mẫu chuẩn) Cường độ huỳnh quang Đường (base line) Chu kỳ (base cycle) Một số chu kỳ nhiệt ban đầu, thường 10 chu kỳ nhiệt Chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Trò số xác đònh số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diễn khuếch đại Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 23 Chu kỳ ngưỡng Realtime PCR Chu kỳ ngưỡng ống phản ứng khác số lượng DNA đích ban đầu có ống phản ứng khác • Ct thấp: số lượng DNA đích ban đầu nhiều • Ct cao: số lượng DNA đích ban đầu Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Kết Realtime PCR Đường khuếch đại mẫu chuẩn Đường khuếch đại chứng nội Đường khuếch đại mẫu thử Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 24 Kết Realtime PCR Đường khuếch đại mẫu thử Đường khuếch đại mẫu chuẩn Đường khuếch đại chứng nội Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Biểu đồ đường chuẩn Realtime PCR Chu kỳ ngưỡng Y = Ct Đường chuẩn (standard curve) biểu thò mối quan hệ chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA ban đầu có mẫu chuẩn Số lượng DNA đích ban đầu có mẫu xác đònh công thức: X=log10Sq với Sq = 10[(Ct-intercept)/slope] Hệ số tương quan (R2) đánh giá mức độ xác thao tác pha loãng mẫu chuẩn Chấp nhận: R2 ≥ 0.99 Intercept (int): trung bình cộng cường độ huỳnh quang tất mẫu giai đoạn bình nguyên Số lượng DNA đích ban đầu có mẫu X=log10Sq Hiệu PCR (PCR efficiency) E% = (10-1/slope – 1) × 100% Chấp nhận: 90 → 105% E% < 90%: mồi không nhạy, pha loãng mẫu bò thiếu E% >105%: mồi không đặc hiệu, pha loãng mẫu bò dư slope (độ dốc đường chuẩn): cách biệt chu kỳ ngưỡng mẫu chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng 1/10 = 10-1/slope Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 25 Đònh lượng Realtime PCR Lấy 100µL huyết tách chiết 50µL dòch ly trích Dòch ly trích pha loãng 1/5 lấy 5µL dòch để thực Realtime PCR Dựa vào giá trò biểu đồ: • Y = Ct • Y – int = 37.763 ⇒ int = Y - 37.763 ⇒ int = Ct - 37.763 Với công thức: Sq = 10[(Ct-int)/slope] • Ct - int = Ct – (Ct – 37.763)= 37.763 • slope = |-3.380|= 3.380 ⇒ Sq = 10 (37.763/3.380) = 1011.172 # 1011 Hàm lượng virus có mẫu thử: • X = log101011 = 11 copies/phản ứng Lượng DNA ban ủau 1mL huyeỏt thanh: Laỏy 100àL huyeỏt thanh: ì 10 Tửứ 50àL dũch ly trớch pha loaừng 1/5 có 250µL dòch pha loãng Trong 250µL dòch pha loaừng laỏy 5àL laứm thửỷ nghieọm: ì 50 Lượng DNA: 11× 50 ×10 = 5500 copies/mL = 5.5 log Sự khác biệt kết đònh lượng hai lần thử xem có ý nghóa ≥100 lần 2log10 Vì đònh lượng xây dựng đường chuẩn theo hệ số pha loãng 1/10 nên sai số chấp nhận độ pha loãng kết xem khác biệt cách độ pha loãng Realtime PCR không nên trả kết số copies xác mà kết log10 ỨNG DỤNG PCR & REALTIME PCR CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN NHIỄM TRÙNG 26 Độ đặc hiệu PCR Nuôi cấy PCR Đònh danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học biểu từ kiểu gen Phạm Hùng Vân 2009 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán tác nhân nhiễm trùng Bài giảng vi sinh Xác đònh dựa vào kích thước đoạn gen hay trình tự đặc hiệu đoạn gen PCR nuôi cấy phân tử khuếch đại đoạn gen nên có độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy Áp dụng chẩn đoán tác nhân nhiễm trùng Phát đònh lượng tác nhân virus mà phương pháp vi sinh truyền thống thực để có biện pháp: – Theo dõi (chẩn đoán sớm sốt xuất huyết Dengue virus) – Điều trò (viêm gan B, viêm gan C) – Theo dõi hiệu điều trò (viêm gan B, viêm gan C, HIV/AIDS) – Phòng ngừa (H5N1, SARS) Phát đònh lượng tác nhân vi khuẩn mà phương pháp vi sinh truyền thống không kòp thời, không nhạy (Lao, Chlamydia, lậu kinh niên) Phát đònh lượng tác nhân gây dòch không an toàn làm xét nghiệm với phương pháp vi sinh truyền thống phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng chưa có an toàn cấp :(H5N1, SARS, tác nhân khủng bố sinh học) Phạm Hùng Vân 2008 Các kiến thức PCR phát tác nhân vi sinh vật Bài giảng vi sinh 27 PCR & REALTIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN & ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN B Tình hình nhiễm HBV WHO 2006 28 Diễn tiến nhiễm HBV 90% Nhiễm HBV cấp tính Khi trưởng thành Tự khỏi 10% 10% Tự khỏi Khi sơ sinh Nhiễm HBV mạn tính Xơ gan ung thư gan Không có biến chứng nặng Cấu trúc HBV HBsAg (Hepatitis B surface antigen) kháng nguyên bề mặt HBeAg (Hepatitis B e antigen) dạng tiết HBcAg, không tham gia thành phần virion DNA polymerase HBcAg (Hepatitis B core antigen) kháng nguyên lõi Châu Hữu Hầu 2001 Tìm hiểu viêm gan virus B NXB Y học 29 Ý nghóa số dấu ấn xét nghiệm HBV Dấu ấn Ý nghóa HBsAg HBsAg (+) có nhiễm HBV Anti-HBs Anti-HBs (+) dấu bệnh cải thiện, có tác dụng chống tái nhiễm Nếu trường hợp chủng ngừa Anti-HBs (+) HBeAg HBeAg (+) có nhân HBV Anti-HBe Nếu Anti-HBe (+) HBeAg (-) phản ánh tình trạng nhân HBV giảm chấm dứt (chuyển đổi huyết HBe) Nếu Anti-HBe (+) viên gan mạn tính phản ánh tình trạng bệnh diễn tiến lâu ngày, có khả chuyển sang giai đoạn xơ gan ung thư gan HBV-DNA HBV–DNA (+) có diện nhân HBV ALT Alanine aminotransferase (SGOT): có viêm gan, tế bào gan bò tổn thương nên ALT tăng cao ALT viêm gan cấp tăng nhiều viêm gan mạn AST Aspartate aminotransferase (SGPT): tương tự ALT không đặc hiệu ALT bệnh lý khác (như viêm cơ…) làm AST tăng http://depts.washington.edu/hepstudy/ Ý nghóa khác biệt kết HBsAg HBV DNA HBsAg (+) HBV DNA (-) HBsAg (-) HBV DNA (+) Tình trạng người lành mang virus: hệ miễn dòch cân ưu làm kìm hãm không cho virus nhân thành virus hoàn chỉnh, nên (hoặc có ít) virus hoàn chỉnh máu • • Tình trạng thải virus nhanh sớm (viêm gan bạo phát) • Hình thành phức hợp miễn dòch làm nồng độ HBsAg thấp nên không phát Châu Hữu Hầu 2001 Tìm hiểu viêm gan virus B NXB Y học Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 30 Ý nghóa khác biệt kết HBsAg HBV DNA HBeAg (+) HBV DNA (-) • HBV bò ngăn chặn không nhân thời gian biến khỏi máu HBV-DNA sớm HBeAg HBeAg (-) HBV DNA (+) • Đột biến vùng precore nên không tổng hợp HBeAg • Có thể giai đoạn chuyển đổi huyết Tình trạng chuyển đổi huyết thanh: phản ánh mức độ nhân HBV bò ngăn chặn giảm dần Kết dấu ấn xét nghiệm HBV: • HBeAg (-) • Anti-Hbe (+) • HBV-DNA (±) Châu Hữu Hầu 2001 Tìm hiểu viêm gan virus B NXB Y học Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Xét nghiệm chẩn đoán HBV HBsAg (+) HBV-DNA (+) ALT (↑) qHBV-DNA (≥105) ALT (bình thường) Sinh thiết gan /fibroscan (bất thường) Điều trò Sau tháng qHBV-DNA (Không giảm 100 lần) Đột biến precore/ core promoter Đột biến kháng thuốc: • • Lamivudine Adefovir Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 31 Đột biến precore core promoter Đột biến precore: • G1896A Đột biến core promoter: • A1762T • G1766A Phải điều trò thuốc kháng virus suốt đời Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Phát đột biến precore core promoter kỹ thuật giải trình tự PCR khuếch đại đoạn đặc hiệu 250bp vùng gene core HBV Giải trình tự sản phẩm khuếch tìm đột biến precore/promoter: • • • G1896A A1762T G1764A Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 32 Đột biến kháng thuốc HBV V (valin), L (leucin), M (methionin), I (isoleucin), A (alanine), N (asparagine), T (threonine), S (serin) Mohanty SR et al (2006) Treatment of chronic hepatitis B Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 3: 446–458 doi:10.1038/ncpgasthep0550 Phát đột biến kháng thuốc kỹ thuật giải trình tự PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu 550bp vùng gen preS HBV Giải trình tự sản phẩm khuếch tìm đột biến kháng: • • • Lamivudine Adefovir Entecavir Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 33 PCR & REALTIME PCR TRONG CHẨN ĐOÁN & ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN C Tình hình nhiễm HCV WHO 1999 34 Diễn tiến nhiễm HCV Nhiễm HCV cấp tính 100% (100 λ) Mạn tính 85% (85 λ) Tự khỏi 15% (15 λ) Xơ gan 20% (17 λ) Ổn đònh 80% (68 λ) Phạm Hùng Vân 2009 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán tác nhân nhiễm trùng Bài giảng vi sinh Diễn tiến chậm 75% (13 λ) Ung thư gan Xơ gan tiến triển 25% (4 λ) Cấu trúc HCV HCV chưa nhìn thấy qua kính hiển vi nuôi cấy Cấu tạo virus giả đònh nhờ biết rõ cấu trúc gen 35 Ý nghóa số dấu ấn xét nghiệm HCV Anti-HCV kháng thể đặc hiệu với HCV Anti-HCV (+): – Đang bò nhiễm HCV – Đã bò nhiễm HCV (nhưng khỏi) Một người bò nhiễm HCV thường tạo miễn dòch bảo vệ chống lại virus Do xuất anti-HCV ý nghóa thể có miễn dòch bảo vệ loại trừ virus HCV-RNA RNA virus viêm gan C HCV-RNA (+): – Đang bò nhiễm HCV Xét nghiệm chẩn đoán HCV HCV RNA (+) qHCV RNA HCV genotype Điều trò đến tuần thứ 12 < 2log10 qHCV RNA Cân nhắc ngưng điều trò Tiếp tục điều trò đến tuần thứ 48 Genotype -1 ≥ 2log10 HCV-RNA (-) Không đáp ứng (+) HCV RNA Genotype non-1 (-) Tiếp tục điều trò đến tuần thứ 24 Tái phát HCV RNA (+) Đáp ứng HCV RNA (-) HCV RNA Sau tháng 36 Phân bố genotype HCV HCV phân thành 11 serotype Xác đònh genotype HCV kỹ thuật giải trình tự RT-PCR khuếch đại RNA 200bp vùng 5’NC đặc hiệu HCV Giải trình tự sản phẩm khuếch đại Đăng nhập vào NCBI BLAST Search Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y hoïc 37 ... 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học Kết Realtime PCR Đường khuếch đại mẫu chuẩn Đường khuếch đại chứng nội Đường khuếch đại mẫu thử Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, ... TIME PCR Khái niệm Realtime PCR Kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại DNA đích hiển thò chu kỳ nhiệt phản ứng Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 17 Thiết bò Realtime. .. phản ứng Thiết bò Realtime PCR: – IQ, My IQ, IQ5 (Biorad) Phạm Hùng Vân 2008 PCR Realtime PCR, vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học 18 Thiết bò Realtime dùng sợi quang học Thiết bò Realtime sử dụng