áp dụng kỹ thuật pcr trong chẩn đoán nhiễm chlamydia trachomatis đường sinh dục tiết niệu

bộ y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Tên đề tài áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis đờng sinh dục tiết niệu Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Hậu Khang Cơ quan chủ trì: Trờng Đại học Y Hà Nội Cấp quản lý: Bộ Y Tế Hà Nội 2008 1 Tóm tắt các thông tin về đề tài 1. Tên đề tài: áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis đờng sinh dục tiết niệu. 2. Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Hậu Khang 3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Y Hà Nội 4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y Tế 5. Th ký đề tài: ThS. Phạm Đăng Bảng 6. Những ngời tham gia: - TS. Lê Thị Phơng Viện Da liễu Quốc gia - ThS. Lê Văn Hng Trờng ĐH Y Hà Nội - BS. Lê Huyền My Viện Da liễu Quốc gia - CN. Ninh Thị Dần Viện Da liễu Quốc gia - ThS. Phạm Đăng Bảng 7. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 9/2006 đến tháng 9/2008 2 Mục lục Nội dung Trang Những chữ viết tắt 3 Đặt vấn đề 4 Chơng I. Tổng quan 6 1. Tình hình nhiễm C.trachomatis 6 2. Vi khuẩn C.trachomatis 9 Chơng II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 25 1. Đối tợng nghiên cứu 25 2. Phơng pháp nghiên cứu 26 Chơng III. Kết quả nghiên cứu 33 1. Đặc điểm của các bệnh nhân nghiên cứu 33 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR 38 3. So sánh PCR với xét nghiệm miễn dịch sắc ký 41 4. Mô tả một số yếu tố nguy cơ liên quan tới nhiễm C.trachomatis 42 Chơng IV. Bàn luận 62 1. Nhận xét chung về các bệnh nhân nghiên cứu 62 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR 66 3. So sánh PCR với xét nghiệm miễn dịch sắc ký 68 4. Các yếu tố nguy cơ liên quan tới nhiễm C.trachomatis 70 Kết luận 78 Kiến nghị 80 Tài liệu tham khảo Phụ lục 3 Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t BLTQ§TD: BÖnh l©y truyÒn qua ®−êng t×nh dôc CDC: Center for Diseases Control and Prevention (USA) CT: Chlamydia trachomatis DNA: Deoxyribonucleic Acid PCR: Polymerase chain reaction (Ph¶n øng chuçi men) RNA: Ribonucleic Acid WHO: World Health Organisation (Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi) 4 Đặt vấn đề Số bệnh nhân mắc các bệnh lây truyền qua đờng tình dục (BLTQĐTD) trên thế giới ngày càng tăng lên cùng với sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS. Theo ớc tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), mỗi ngày trên phạm vi toàn cầu có khoảng 1 triệu trờng hợp mới mắc các BLTQĐTD [73], trong đó Chlamydia trachomatis (CT) là một trong các nguyên nhân thờng gặp nhất gây tiết dịch niệu đạo ở nam và tiết dịch âm đạo ở nữ. Một số nghiên cứu cho thấy nhiễm CT chiếm tới 30-35% số bệnh nhân mắc các BLTQĐTD [27, 68]. Nhiễm CT có thể dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng, đặc biệt là ở phụ nữ nhiễm CT có thể gây nên viêm nhiễm vùng tiểu khung và đe doạ tới sức khoẻ sinh sản [57]. Do là vi khuẩn ký sinh nội bào nên trớc đây chỉ có biện pháp nuôi cấy trên môi trờng tế bào để chẩn đoán CT. Đây là một phơng pháp chẩn đoán phức tạp, đắt tiền, độ đặc hiệu đạt gần 100% nhng độ nhạy không cao, chỉ đạt khoảng 70-80% [8, 33]. Một số kỹ thuật xác định kháng nguyên nh miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, hoá mô miễn dịch mà một số tác giả nớc ngoài thực hiện để chẩn đoán nhiễm CT cũng có độ nhạy không cao và hay gây ra dơng tính giả [7]. Polymerase Chain Reaction (PCR) một kỹ thuật mới có thể dùng để chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn nói chung và các bệnh lây truyền qua đờng tình dục nói riêng. Các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao trong chẩn đoán nhiễm CT (độ nhạy và độ đặc hiệu đều trên 90%) [27, 34, 39, 50]. Ngoài bệnh phẩm là dịch niệu đạo hay cổ tử cung, PCR còn có thể phát hiện đợc CT trong nớc tiểu. Phơng pháp này cho phép sàng lọc nhiễm CT bằng cách bệnh nhân tự lấy nớc tiểu và gửi đến phòng xét nghiệm (còn gọi là biện pháp lấy bệnh phẩm không xâm nhập) [17]. Tuy nhiên, độ nhạy khi xét nghiệm bệnh phẩm bằng nớc tiểu thấp hơn nhiều so với bệnh phẩm là dịch tiết niệu đạo/cổ tử cung [1]. Một u điểm khác của PCR là có thể 5 phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong một lần làm phản ứng [39, 50]. Cũng nh tình hình chung trên thế giới, số bệnh nhân mắc các BLTQĐTD ở Việt Nam ngày càng tăng. Trớc đây cha có một nghiên cứu quy mô lớn nào đợc tiến hành để xác định tỷ lệ nhiễm CT và các yếu tố liên quan tại các cơ sở y tế Việt Nam. Một trong các lý do cho hạn chế này là cha có một phơng pháp chẩn đoán CT độ tin cậy cao. Việc áp dụng PCR vào chẩn đoán nhiễm CT sẽ giúp pháp hiện và điều trị bệnh sớm, tránh biến chứng. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu sau: 1. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR trong chẩn đoán nhiễm C.trachomatis đờng sinh dục tiết niệu. 2. Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm nhiễm C.trachomatis đờng sinh dục tiết niệu của PCR trên cơ sở so sánh với kỹ thuật miễn dịch sắc ký. 3. Xác định các yếu tố nguy cơ nhiễm C.trachomatis đờng sinh dục tiết niệu để đề xuất các chỉ định xét nghiệm bằng PCR. 6 chơng I Tổng quan 1. Tình hình nhiễm C.trachomatis 1.1. Tình hình nhiễm C.trachomatis trên thế giới Theo ớc tính của WHO, mỗi năm trên thế giới có tới 370 triệu trờng hợp mới mắc các BLTQĐTD (khoảng 1 triệu trờng hợp mỗi ngày), trong đó có khoảng 89 triệu trờng hợp nhiễm CT [73]. Đặc biệt là tỷ lệ nhiễm CT trong các bệnh nhân mắc các BLTQĐTD có xu hớng tăng lên trong thời gian gần đây. Thống kê cho thấy tỷ lệ mắc CT ở Mỹ tăng từ 289,4/100.000 dân năm 2002 lên 347,8/100.000 dân năm 2006; con số này ở phụ nữ lần lợt là 445,0/100.000 dân và 515,8/100.000 dân, cao hơn so với số liệu ở nam giới là 126,8/100.000 dân và 173,0/100.000 dân. Trong khi đó tỷ lệ nhiễm lậu cầu có xu hớng giảm nhẹ, từ 122,0/100.000 dân năm 2002 lên 120,9/100.000 dân năm 2006 [11]. Nh vậy nhiễm CT ngày càng trở thành một vấn đề y tế và xã hội lớn. ở Mỹ, năm 2006 có gần 980.000 ca nhiễm CT đợc báo cáo, tuy nhiên các chuyên gia nhận định rằng mỗi năm tại nớc Mỹ có khoảng 2,8 triệu ca do đa số các ca bệnh không đợc báo cáo [11]. Tỷ lệ nhiễm CT trong đối tợng nam thanh niên 18 26 tuổi ở Thuỵ Sỹ là 1,2%; trong đó tỷ lệ ở thành thị cao hơn hơn ở nông thôn (2,9% so với 0,5%) [5]. Một nghiên cứu tại Nhật Bản cho thấy tỷ lệ nhiễm CT ở gái mại dâm là 13%, còn ở đối tợng nguy cơ thấp là 3% [32]. Trong đối tợng mại dâm 7 ở San Francisco, bao gồm cả nam, nữ, nữ chuyển giới, tỷ lệ nhiễm CT là 6,8% [16]. Tại Philipin, bằng PCR, ngời ta xác định tỷ lệ nhiễm CT ở các phụ nữ đến khám thai là 6,3%, còn ở đối tợng gái mại dâm tỷ lệ này dao động từ 17,9% đến 32% tuỳ từng thời điểm [64]. ở vùng Đông Nam của Nigeria, tỷ lệ nhiễm CT ở bệnh nhân đến phòng khám các BLTQĐTD là 25% ở nam và 36,1% ở nữ giới [56]. Nh vậy có thể thấy rằng tình hình nhiễm CT nặng nề hơn ở các nớc đang phát triển và đặc biệt là ở đối tợng có nguy cơ cao nh gái mại dâm. Đối tợng gái mại dâm đợc đặc biệt quan tâm vì đây là đối tợng có nguy cơ cao và là nguồn lây bệnh vào cộng đồng. So với nam giới thì phụ nữ là đối tợng bị ảnh hởng nhiều hơn bởi CT. Hầu hết các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm CT ở nữ giới cao hơn nam giới. Năm 2006, tỷ lệ nhiễm CT ở nữ giới tại Mỹ là 515,8/100.000 dân còn nam giới là 173/100.000 dân [11]. Tình hình nhiễm CT ở đối tợng phụ nữ có thai cũng đợc quan tâm vì có thể gây ra các biến chứng sản khoa và gây nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh [57]. Tình hình nhiễm CT ở đối tợng thanh thiếu niên cũng đợc quan tâm rất nhiều vì đây là nhóm đối tợng có quan hệ tình dục mạnh, trong độ tuổi sinh đẻ nên nhiễm CT và các biến chứng của nó rất nguy hiểm, không chỉ ảnh hởng đến bản thân bệnh nhân, mà còn ảnh hởng đến bạn tình và con cái của họ. Nhiều nớc đã có chiến lợc sàng lọc CT cùng với lậu cầu ở đối tợng phụ nữ dới 25 tuổi bằng phơng pháp lấy bệnh phẩm không xâm nhập [35, 52]. Tuy nhiên vấn đề sàng lọc CT ở nam giới hoặc phụ nữ trên 25 tuổi, phụ nữ có thai còn nhiều tranh cãi, cần phải cân nhắc thêm giữa hiệu quả và chi phí [51, 69]. 8 1.2. Tình hình nhiễm C.trachomatis ở Việt Nam Nhiễm CT gần đây đã trở thành vấn đề thời sự và đợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên ở Việt Nam còn có ít các nghiên cứu về CT một cách hệ thống. Viện Da liễu Quốc gia đã có thống kê về tình hình nhiễm CT trên toàn quốc từ năm 1996, nhng số liệu thống kê không đồng đều thờng xuyên từ các tỉnh và trong các năm. Theo thống kê trong giai đoạn 1996 đến 2000 có 14.800 ca nhiễm CT, trong giai đoạn 5 năm tiếp theo có 13.757 ca. Năm 2007, số nhiễm CT theo báo cáo là 2.414 ca ở nam giới và 3.473 ca ở nữ giới. Tuy nhiên các con số trên đây chỉ phản ánh một phần nhỏ tình hình bệnh nhân nhiễm CT tại Việt Nam do tại Việt Nam vẫn tồn tại song song hai hệ thống báo cáo số liệu theo hội chứng và theo căn nguyên. Mặt khác, đa số bệnh nhân không đợc báo cáo do đến điều trị tại các phòng mạch t hay tự mua thuốc điều trị. Mặc dù có hạn chế nh vậy nhng ta cũng có thể nhận thấy là trong các năm gần đây số lợng bệnh nhân nhiễm CT ngày càng nhiều, có thể do một phần là có sự tiến bộ của các phơng tiện chẩn đoán bệnh. Các nghiên cứu trớc đây tại Viện Da liễu Quốc gia cho thấy tỷ lệ nhiễm CT trong số các bệnh nhân tiết dịch niệu đạo và âm đạo là khoảng 10%. Theo Diệp Xuân Thanh, tỷ lệ nhiễm CT trên bệnh nhân mắc BLTQĐTD khám tại Viện Da liễu Quốc gia trong hai năm từ 1997-1998 là 10,98%, trong đó nam giới chiếm 64%, và nữ giới chiếm 36% tổng số bệnh nhân [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Huyền năm 2000 cho thấy tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo là 10,5% [2]. Năm 2001 Nguyễn Thị Ngọc Yến thấy tỷ lệ nhiễm CT trong số bệnh nhân 9 BLTQĐTD tại viện Da liễu Quốc gia là 9,5%, và số bệnh nhân là nữ cao hơn nam 2 lần [4]. Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu trên đều dựa vào kỹ thuật miễn dịch sắc ký, có độ nhạy không cao. Do đó, trớc đây đa số các bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đều đợc điều trị CT theo đúng phác đồ của WHO mà không cần xét nghiệm. Hiện nay, Viện Da liễu đã triển khai kỹ thuật PCR trong chẩn đoán các BLTQĐTD, trong đó có CT. Đây sẽ là một phơng pháp hữu hiệu trong chẩn đoán CT, sẽ góp phần vào chẩn đoán chính xác bệnh, đa ra đợc tỷ lệ mắc bệnh thực sự, xác định các yếu tố nguy cơ cao của bệnh. 2. Vi khuẩn C.trachomatis 2.1. Lịch sử bệnh do Chlamydia [24, 65] Bệnh do CT gây ra đợc biết đến sớm nhất là bệnh mắt hột, đợc mô tả trong các ghi chép từ thời Hy Lạp, Ai Cập, Trung Quốc cổ đại. Tuy nhiên đến tận năm 1907, Halberstaedter và Von Prowazek phát hiện và mô tả những hạt vùi trong tế bào kết mạc bệnh nhân đau mắt hột. Các tác giả này đặt tên chúng là Chlamydozoa. Năm 1945 Moskowsky gọi các vật thể này là Mygagawanlla, Chlamydozoom mắt và sinh dục. Cùng với các phát hiện tơng tự, năm 1950 Zhdanov và Konerblit gọi chúng là Rickettsia formis, còn Levaditi lại đặt tên chúng là Rakeria. Đến năm 1970 hội nghị quốc tế về mắt hột ở Mỹ mới thống nhất gọi nhóm vi sinh vật này là Chlamydia theo nghĩa tiếng la tinh là: áo choàng, do khi quan sát trên kính hiển vi điện tử, thể vùi do Chlamydia bao quanh nhân tế bào giống nh chiếc áo choàng. [...]... bệnh của C .trachomatis 2.3.1 Đờng lây truyền CT lây nhiễm từ ngời bệnh sang ngời lành theo hai con đờng chính là: + Lây truyền qua sinh hoạt tình dục với ngời bị bệnh + Lây từ mẹ sang con trong quá trình sinh đẻ Ngoài ra CT cũng có thể lây qua tiếp xúc của bộ phận sinh dục với dịch tiết đờng sinh dục của ngời bị bệnh 2.3.2 Biểu hiện lâm sàng tại đờng sinh dục, tiết niệu ở nam giới - Viêm niệu đạo: CT... đờng tiết niệu sinh dục, C.pneumoniae gây viêm phổi Bằng phơng pháp miễn dịch huỳnh quang tìm kháng nguyên vỏ, ngời ta đã chia CT thành 15 loại là: L1, L2, L3 gây bệnh hột xoài (Nicola - Favre) A, B, B1, C gây bệnh bệnh mắt hột Đã có những báo cáo loại B1 và C gây bệnh ở đờng sinh dục tiết niệu D, E, F, G, H, I, J, K gây viêm đờng niệu dục tiết niệu ở ngời lớn, viêm kết mạc và viêm phổi ở trẻ sơ sinh. .. thấy có 17% dơng tính với CT bằng phơng pháp PCR- EIA Nghiên cứu này cũng đa ra khuyến cáo phải áp dụng phơng pháp sàng lọc CT ở phụ nữ để làm giảm tỷ lệ lu hành [28] Theo Kouri, tỷ lệ nhiễm CT trong nhóm phụ nữ Cu ba nhiễm HIV là 10% so với 6,6% ở phụ nữ HIV âm tính [36] - Viêm niệu đạo: biểu hiện các triệu chứng: Tiết dịch niệu đạo, tiết dịch âm đạo Miệng niệu đạo đỏ, phù nề Rối loạn tiểu tiện: đái... pháp rất nhạy cảm trong việc chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng Có rất nhiều phơng pháp khuếch đại DNA nhng hay sử dụng nhất là phơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR là sự tổng hợp DNA ngoài cơ thể nhng chỉ tổng hợp đoạn DNA mà ta quan tâm, đó là đoạn DNA giới hạn giữa hai mồi (primers) Từ một vài đoạn DNA đích có trong bệnh phẩm ta thu đợc một lợng lớn DNA và dễ dàng phát hiện bằng các kỹ thuật. .. vô sinh 2.3.3 Biểu hiện lâm sàng ngoài đờng sinh dục - Viêm quanh gan (hội chứng Fitz-Hugh-Curtis) [49]: Viêm quanh gan là một trong những biểu hiện của hội chứng FitzHugh-Curtis, thờng xuất hiện sau các bệnh nhiễm khuẩn đờng sinh dục, hay gặp ở phụ nữ trẻ và sau khi bị nhiễm khuẩn sinh dục Bệnh có thể xảy ra sau hoặc cùng lúc với viêm vòi trứng Bệnh có thể gặp ở phụ nữ trẻ đang tuổi hoạt động tình dục. .. phơng pháp xét nghiệm CT bao gồm: 2.4.1 Xét nghiệm không đặc hiệu: + LEA (leukocyte esterase assay): Là xét nghiệm không đặc hiệu có thể chẩn đoán viêm niệu đạo nhng không xác định đợc căn nguyên gây viêm, độ nhạy thấp Xét nghiệm này phát hiện enzym leukocyte esterase do bạch cầu sinh ra trong nớc tiểu của bệnh nhân nhân có viêm đờng sinh dục tiết niệu Các tác giả đều thống nhất là phơng pháp này chỉ... tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán CT, và đợc dùng trong y pháp Tuy nhiên độ nhậy của kỹ thuật nuôi cấy chỉ đạt 70 - 80% Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy cần dây chuyền vận chuyển bệnh phẩm lạnh để giữ vi khuẩn còn sống cho tới khi tiến hành nuôi cấy, phòng xét nghiệm cần nhiều trang thiết bị đắt tiền, kết quả chỉ có sớm nhất sau 3-7 ngày Do đó phơng pháp nuôi cấy phân lập chủ yếu đợc dùng trong nghiên cứu...10 2.2 Đặc điểm sinh học của C .trachomatis [24, 65] Chlamydia là loại vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, có chứa đồng thời hai loại acid nucleic: DNA, RNA Chlamydia có thành tế bào, màng tế bào tơng tự nh các vi khuẩn Gram âm khác, tuy nhiên do Chlamydia ký sinh bên trong tế bào nên không phát hiện đợc bằng phơng pháp nhuộm Gram Chu kỳ phát triển của Chlamydia qua hai hình thái: -... của DNA - polymerase Kỹ thuật PCR cho phép nhân lên bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào với tốc độ nhanh hơn rất nhiều lần so với sự nhân lên của 24 chúng ở trong tế bào Chỉ trong vòng 2 4 giờ, số lợng bản sao có thể tăng lên gấp hàng trăm triệu đến hàng tỷ lần Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về những u điểm của kỹ thuật này, với độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán rất cao, thậm chí... chuẩn vàng trong chẩn đoán Các tác giả đều thấy PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hẳn EIA 25 Chơng iI Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 1 Đối tợng nghiên cứu 1.1 Đối tợng Các bệnh nhân đến khám tại phòng khám Viện Da liễu từ tháng 8/2006 đến tháng 11/2006 có biểu hiện tiết dịch niệu đạo hoặc tiết dịch âm đạo, rối loạn tiểu tiện 1.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân + Nam, nữ có quan hệ tình dục + Có trong số . của PCR trong chẩn đoán nhiễm C .trachomatis đờng sinh dục tiết niệu. 2. Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm nhiễm C .trachomatis đờng sinh dục tiết niệu của PCR trên cơ sở so sánh với kỹ thuật. Tóm tắt các thông tin về đề tài 1. Tên đề tài: áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis đờng sinh dục tiết niệu. 2. Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Hậu Khang 3 nghiên cứu đề tài cấp bộ Tên đề tài áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis đờng sinh dục tiết niệu Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Hậu