ung dung ky thuat pcr trong chan doan vi khuan lao

Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây nên. Bệnh lao tồn tại cùng loài người hơn sáu ngàn năm. Trên thế giới, không một quốc gia nào, một dân tộc nào mà không có người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao và chết vì lao. Ngày nay, bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIVAIDS, nó trở thành một trong những căn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người. Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 13 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, bệnh lao vẫn là một bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số người mắc lao cao nhất thế giới. Hàng năm ước tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc và khoảng 7400 bệnh nhân laoHIV. Để bệnh lao dần được kiểm soát điều quan trọng là phát hiện được nhiều nhất số người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm.. Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét nghiệm đờm (nhuộm ZiehlNeelsen), xét nghiệm hình ảnh (Xquang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không cao. Kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng phát triển sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn. Một trong những phương pháp có hiệu quả để chấn đoán bệnh lao tốt hơn so với các phương pháp trên là chẩn đoán vi khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CNSH & KTMT

BỘ MÔN : SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH LAO

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO 2

1.1.Giới thiệu về vi khuẩn lao 2

1.2 Hình thể, cấu tạo và kích thước 2

1.3.Phân loại 3

1.4 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao 4

1.4.1 Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài 4

1.4.2 Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxi 4

1.4.3 Vi khuẩn lao sinh sản chậm 5

1.4.4 Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hóa khác nhau ở tổn thương 5

1.4.5 Các chất độc liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao 5

1.5 Sức đề kháng của vi khuẩn 5

PHẦN 2 BỆNH LAO 6

2.1.Đặc điểm của bệnh lao 6

2.2.Triệu chứng của bệnh lao 7

2.3 Phương thức lây truyền 7

PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP PCR 8

3.1.Khái niệm 8

3.2 Nguyên tắc của phương pháp PCR 8

3.3.Thưc nghiệm 8

3.4.5 Số lượng của chu kì phản ứng PCR 12

3.5 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 12

3.6 Ưu điểm và hạn chế của phản ứng PCR 13

3.6.1 Ưu điểm 13

3.6.2 Hạn chế 13

3.7 Ứng dụng của phương pháp PCR 15

PHẦN 4 CHUẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BẰNG PCR 16

KẾT LUẬN 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

DANH MỤC BẢNG

trang

DANH MỤC HÌNH

trang

Hình 1 Vi khuẩn mycobarterium tuberculosis 2

Hình 2 Vách tế bào vi khuẩn lao 3

Hình 3.thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao 6

Hình 4 Nguyên tắc của phương pháp PCR 9

Hình 5 Máy nhân gen PCR 12

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây

nên Bệnh lao tồn tại cùng loài người hơn sáu ngàn năm Trên thế giới, không một quốcgia nào, một dân tộc nào mà không có người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao vàchết vì lao

Ngày nay, bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS, nó trở thành một trong nhữngcăn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩnchính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗinăm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển

Ở Việt Nam, bệnh lao vẫn là một bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ

12 trong số 22 nước có số người mắc lao cao nhất thế giới Hàng năm ước tính có thêm180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc vàkhoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV

Để bệnh lao dần được kiểm soát điều quan trọng là phát hiện được nhiều nhất sốngười mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xétnghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứngtuberculin hay soi phế quản Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặthạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác khôngcao

Kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng phát triển sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vikhuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn Một trong những phương pháp có hiệu quả đểchấn đoán bệnh lao tốt hơn so với các phương pháp trên là chẩn đoán vi khuẩn lao bằng

kỹ thuật PCR

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẦN LAO

1.1 Giới thiệu về vi khuẩn lao

Mycobacterium tuberculosis là một loài vi khuẩn gây bệnh trong chi Mycobacterium, thuộc họ Mycobacteriaceae, bộ Actinomycetes và là tác nhân gây bệnh

của hầu hết các ca bệnh lao Lần đầu được phát hiện ra vào năm 1882 bởi Robert Koch.Với thành công này, ông đã nhận được giải thưởng của Nobel về vi sinh vật học và y họcnăm 1905

Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩnyếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự nhiên, chỉ

có thể phát triển trong sinh vật ký chủ

Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của nó: nóvẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được phân loại là "trựckhuẩn kháng acid"

Hình 1 Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis

1.2 Hình thể, cấu tạo và kích thước

Tế bào vi khuẩn lao có hình que, thẳng hoặc hơi cong, mảnh, nhỏ, chiều dài từ 3µmđến 5µm, rộng 0,3µm – 0,5µm Vi khuẩn không có lông, nha bào và vỏ

Vi khuẩn có hai đầu tròn, thân có hạt, đứng thành từng đám lớn rất khó phân biệttừng con vi khuẩn

Cấu tạo vi khuẩn lao gồm:

- Lipit (lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, các chất lipit có mối liên hệ chặt chẽvới cấu trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid Đây là đặc điểm cấu tạo củatrực khuẩn lao khác với các vi khuẩn khác Lớp sáp đã được phân tích có nhiều yếu tố, cóyếu tố gây bệnh tích, có yếu tố chỉ mang tính kháng nguyên

- Các thành phần khác như protein, polysaccharide Vi khuẩn có nhiều yếu tố sợi ởvách và chất nguyên sinh gây bệnh

Hình 2 Vách tế bào vi khuẩn lao

1.3 Phân loại

Gây bệnh lao người M.tuberculois (Trực khuẩn lao người), M.bovis (Trực khuẩn

lao bò), M.avium (Trực khuẩn lao chim) Chúng được phân biệt bởi các tính chất sau:

Bảng 1 Tính chất của các vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn lao

Vi khuẩn Hình thái

khuẩn lạc

Nhiệt độ phát triển thích hợp

Thời gian mọc khuẩn lạc

Khả năng gây bệnh

trong

37 oC 30 ngày Lao bò

Lao chuột

1.4 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao

1.4.1 Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài

Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3 – 4 tháng Trong phòng thí nghiệmngười ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm Trong đờm của bệnh nhân lao ởphòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực Dưới ánh nắng mặttrời vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở

800C; với cồn 900 vi khuẩn tồn tại được ba phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chỉ sốngđược một phút

1.4.2 Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxy

Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, vì vậy giải thích tại sao lao phổi là thể bệnhgặp nhiều nhất và số lượng vi khuẩn nhiều nhất trong các hang lao có phế quản thông

1.4.3 Vi khuẩn lao sinh sản chậm

Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, nhưng có khi hàngtháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn thương rất lâu, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thểtái lại.

Ngoài ra còn có hình thức sinh sản giống nấm: 2 vi khuẩn tạo ra cầu khuẩn để tạo vikhuẩn mới

1.4.4 Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hoá khác nhau ở tổn thương

Có những quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm ngoài tế bào, có những quần thể

vi khuẩn phát triển chậm, từng đợt, có những vi khuẩn nằm trong tế bào Những quần thể

vi khuẩn này chịu tác dụng khác nhau tuỳ từng thuốc chống lao

1.4.5 Các chất liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao

Mặc dù đã biết vi khuẩn lao hàng trăm năm, nhưng tính chất gây độc của M.

tuberculosis còn nhiều điều chưa được sáng tỏ, chúng không có các độc tố chủ yếu gây

bệnh như nhiều vi khuẩn khác Nhiều chất từ M tuberculosis đã được chứng minh là

tham gia vào độc tính vi khuẩn, nhưng không thật sự có yếu tố nào là chủ yếu hay quyếtđịnh

1.5 Sức đề kháng của vi khuẩn

Vi khuẩn có sức đề kháng tương đối mạnh với các nhân tố lý hoá học

- Ở bệnh phẩm đờm tồn tại nhiều ngày, nếu ở nơi tối ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫnsống và còn độc lực, ở trong thực phẩm sữa sống được nhiều tuần

- Ở nhiệt độ 42°C: Vi khuẩn ngừng phát triển nếu ở nhiệt độ 80°C/10 phút: vi khuẩn

bị chết

- Cồn 90° С tồn tại được 3 phút, acid phenic 5% sau 1 phút bị tiêu diệt

- Vi khuẩn kháng với nhiều loại thuốc chống lao và ngày càng tăng lên

PHẦN 2 BỆNH LAO

2.1 Đặc điểm của bệnh lao

Bệnh lao phổi là một bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn lao (Mycobacterium

tuberculosis) Ngoài ra còn phân lập được một số Mycobacteria khác như M bovis…

Lao phổi là bệnh lao thường gặp nhất, chiếm tới 80% trong tổng số bệnh lao Lao phổi làthể lao gây lây nhiễm cho người khác

Bệnh rất dễ lây từ người sang người do lây bằng đường hô hấp Khả năng lây mạnhtrong thời gian chưa được điều trị Cứ 1 người bị lao phổi có ho khạc ra vi khuẩn có thểlây cho 10-15 người khác, nhất là trong các quần thể dân cư nhỏ như gia đình, lớp học, trước khi người bệnh được điều trị Khi đã được điều trị bằng thuốc chống lao, khả nănglây bệnh rất thấp

Bệnh lao là một bệnh xã hội: Nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao có ở mọi nơi trênthế giới Bệnh lao tăng hay giảm phụ thuộc vào nền kinh tế xã hội, chế độ xã hội, mứcsống, các hiện tượng xã hội như thiên tai, chiến tranh, những nước có nhiều người nhiễmHIV…

Hình 3 Thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao caoBệnh lao là một bệnh diễn biến qua 2 giai đoạn:

 Giai đoạn lao nhiễm: Là lần đầu tiên vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếutheo đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang Sau khoảng 3 tuầnđến một tháng, dưới tác động của vi khuẩn lao, cơ thể có sự chuyển biến về mặt sinh học,hình thành dị ứng và miễn dịch đối với vi khuẩn lao, người bị lây ở trong tình trạng nhiễmlao.

 Giai đoạn lao bệnh: Còn gọi là lao thứ phát sau lao sơ nhiễm Đa số người bị lâytrong tình trạng nhiễm lao mà không trở thành lao bệnh Chỉ có khoảng 10% số lao nhiễmchuyển thành lao bệnh Bệnh lao chỉ xảy ra khi có sự mất thăng bằng giữa khả năng gâybệnh của vi khuẩn lao và sức đề kháng của cơ thể

2.2 Triệu chứng của bệnh lao

- Ho dai dẳng từ 3 tuần trở lên

- Ho ra máu

- Đau ngực, khó thở

- Sốt nhẹ về chiều, đổ mồ hôi ban đêm

- Mệt mỏi, chán ăn, sụt cân

- Gầy ốm

- Nổi hạch vùng cổ

2.3 Phương thức lây truyền

Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất Người bị lao phổi có

vi trùng lao trong đàm khi ho khạc, hắt hơi, … sẽ tạo ra các hạt nhỏ có chứa vi trùng lao.Người khác hít những hạt này vào phổi sẽ bị nhiễm lao Vi trùng lao vào cơ thể bằng cáchtheo không khí vào trong phổi, sau đó tiếp tục gây bệnh tại phổi hoặc đến gây bệnh ởnhững cơ quan khác hoặc theo đường máu, đường bạch huyết hoặc đường phế quản

PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP PCR

3.1 Khái niệm chung:

Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp- polymerase Chain Reaction) là phươngpháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cầnmột khối lượng mẫu ban đầu hạn chế

3.2 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạchkhuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn,

có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dàimồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đócủa các DNA polymerase Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sungvới hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều

đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu vềtrình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sensprimer) và một mồi ngược (anti sens primer) Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi”

và “ngược” so với chiều phiên mã của gen

 Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp( thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắtcặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40OC – 70OC, tùythuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây -1 phút Đây là giai đoạn lai( hybridization)

 Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72OC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn

là polymerase chiu nhiệt hoạt đông tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc vào đọ dài của

trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút đây là giai đoạntổng hơp hay kéo dài ( elongation).

Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làmtăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tínhtoán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mấu ban đầu

Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau:

3.4.1 DNA khuôn (template)

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuậtchuẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm ( 1micro gam xuống còn 100 ng)với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu banđầu còn hạn chế được các khuếch đại “ ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mongmuốn Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả nhữngmẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu đểlâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc , móng tay của người đã chết…

3.4.2 Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase1 Vì đây làenzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải them enzyme mớivào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lại thấpkhiến sự khuếch đại ký sinh rất cao,…) Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặclớn cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi

khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus Emzyme này – Taq polymerase – không bị

phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng, vikhuẩn này chịu được nhiệt độ từ 50OC -80OC và sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 70OC Taq

DNA polymerase là enzyme đơn phân, có khối lượng phân tử 90 kDa Bản thân enzymechịu được nhiệt, xúc tác tái bản DNA ở 74OC và thậm chí vẫn duy trì khả ăng hoạt độngchức năng sau khi ủ ở 95OC

Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiềuchức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.

VenTM DNA polymerase, cô lập từ Thermococcus litoralis - một vi khuẩn cổ tìm

thấy ở đáy đại dương ở nhiệt độ 98OC Enzyme này có tính chịu nhiệt cao hơn Taq DNApolymerase, có khả năng nhân bản những sản phẩm có kích thước lên đến 13kb Tínhtrung thực trong nhân bản của VenTM DNA polymerase cao do enzyme có them hoạt

tính sửa sai 3’5’ exonuclease Pfu DNA polymerase cô lập từ vi khuẩn cổ đại dương

Pyroccus furiosus hay Ultma DNA polymerase ( từ Thermotoga maritima) cũng có tính

trung thực cao nhờ hoạt tính tương tự

Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt

động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++ ; nhưng với

sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++ , Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.

Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA

3.4.3 Mồi và nhiệt độ lai

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệuquả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủmột số nguyên tắc:

- Trình tự của mồi được chọn sau cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sunggiữa các phần khác nhau của một mồi

- Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide củacác mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng vớicác trình tự lặp lại trên gen

Nồng độ ion Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặchiệu của quá trình PCR Không có một quy luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối ưuphải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nhưng thông thường, nồng

đô Mg qua thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản còn nồng độ quá cao sẽ tạo sản phẩmkhông đặc hiệu

3.4.5 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

- Không quá 40 chu kỳ

- Khuếch đại giảm do:

+ Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng