ung dung ky thuat pcr trong chan doan vi khuan lao

Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây nên. Bệnh lao tồn tại cùng loài người hơn sáu ngàn năm. Trên thế giới, không một quốc gia nào, một dân tộc nào mà không có người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao và chết vì lao. Ngày nay, bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIVAIDS, nó trở thành một trong những căn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người. Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 13 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, bệnh lao vẫn là một bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số người mắc lao cao nhất thế giới. Hàng năm ước tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc và khoảng 7400 bệnh nhân laoHIV. Để bệnh lao dần được kiểm soát điều quan trọng là phát hiện được nhiều nhất số người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm.. Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét nghiệm đờm (nhuộm ZiehlNeelsen), xét nghiệm hình ảnh (Xquang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không cao. Kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng phát triển sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn. Một trong những phương pháp có hiệu quả để chấn đoán bệnh lao tốt hơn so với các phương pháp trên là chẩn đoán vi khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR

Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CNSH & KTMT BỘ MÔN : SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH LAO (MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS) GVHD: LẠI ĐÌNH BIÊN LỚP:13CDSH TỔ: 15 SVTH: 1.Nguyễn Thị Trúc Lan 2.Võ Thị Hồng Nhung Nguyễn Lê Anh Thư 4.Nguyễn Thị Thúy Vi Biện Như Phương Nam Lê Lý Bảo Trân MSSV 3008130050 3008130064 3008130118 3008130080 3008130122 3008140443 TP.HCM, 30/10 / 2015 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO .2 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên 1.1.Giới thiệu vi khuẩn lao 1.2 Hình thể, cấu tạo kích thước 1.3.Phân loại .3 1.4 Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn lao 1.4.1 Vi khuẩn lao có khả tồn lâu môi trường bên .4 1.4.2 Vi khuẩn lao loại vi khuẩn hiếu khí đòi hỏi mức độ cao oxi 1.4.3 Vi khuẩn lao sinh sản chậm 1.4.4 Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hóa khác tổn thương 1.4.5 Các chất độc liên quan đến tính độc vi khuẩn lao 1.5 Sức đề kháng vi khuẩn .5 PHẦN BỆNH LAO 2.1.Đặc điểm bệnh lao .6 2.2.Triệu chứng bệnh lao 2.3 Phương thức lây truyền .7 PHẦN PHƯƠNG PHÁP PCR .8 3.1.Khái niệm 3.2 Nguyên tắc phương pháp PCR 3.3.Thưc nghiệm .8 3.4.Các điều kiện phản ứng PCR 10 3.4.1.DNA khuôn (templat) 10 3.4.2.Enzyme 10 3.4.3 Mồi nhiệt độ lai 11 3.4.4 Các thành phần khác phản ứng PCR 11 3.4.5 Số lượng chu kì phản ứng PCR .12 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên 3.5 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR 12 3.6 Ưu điểm hạn chế phản ứng PCR 13 3.6.1 Ưu điểm 13 3.6.2 Hạn chế 13 3.7 Ứng dụng phương pháp PCR .15 PHẦN CHUẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BẰNG PCR 16 KẾT LUẬN 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên DANH MỤC BẢNG trang Bảng Tính chất vi khuẩn thuộc trực khuẩn lao Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên DANH MỤC HÌNH trang Hình Vi khuẩn mycobarterium tuberculosis Hình Vách tế bào vi khuẩn lao Hình 3.thống kê quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao Hình Nguyên tắc phương pháp PCR .9 Hình Máy nhân gen PCR .12 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên ĐẶT VẤN ĐỀ Lao bệnh nhiễm khuẩn vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây nên Bệnh lao tồn loài người sáu ngàn năm Trên giới, không quốc gia nào, dân tộc mà người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao chết lao Ngày nay, bệnh lao trở lại với đại dịch HIV/AIDS, trở thành nguyên gây bệnh gây tử vong lớn người Hiện lao bệnh nhiễm khuẩn thường gặp nhất, ảnh hưởng đến tỉ người tức 1/3 dân số, với triệu ca năm, gây triệu người tử vong, hầu hết nước phát triển Ở Việt Nam, bệnh lao bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ 12 số 22 nước có số người mắc lao cao giới Hàng năm ước tính có thêm 180.000 bệnh nhân lao, có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV Để bệnh lao dần kiểm soát điều quan trọng phát nhiều số người mắc lao cộng đồng điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm Hiện nay, vi khuẩn lao phát nhiều phương pháp khác xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản Tuy nhiên, phương pháp tồn số mặt hạn chế tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết có độ xác không cao Kỹ thuật sinh học phân tử ngày phát triển giúp cho trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng hiệu Một phương pháp có hiệu để chấn đoán bệnh lao tốt so với phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao kỹ thuật PCR Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN TỔNG QUAN VỀ VI KHUẦN LAO 1.1 Giới thiệu vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis loài vi khuẩn gây bệnh chi Mycobacterium, thuộc họ Mycobacteriaceae, Actinomycetes tác nhân gây bệnh hầu hết ca bệnh lao Lần đầu phát vào năm 1882 Robert Koch Với thành công này, ông nhận giải thưởng Nobel vi sinh vật học y học năm 1905 Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, chịu đựng chất sát khuẩn yếu sống sót trạng thái khô nhiều tuần điều kiện tự nhiên, phát triển sinh vật ký chủ Trực khuẩn lao xác định kính hiển vi đặc tính nhuộm nó: giữ màu nhuộm sau bị xử lý với dung dịch acid, phân loại "trực khuẩn kháng acid" 1.2 Hình Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis Hình thể, cấu tạo kích thước Tế bào vi khuẩn lao có hình que, thẳng cong, mảnh, nhỏ, chiều dài từ 3µm đến 5µm, rộng 0,3µm – 0,5µm Vi khuẩn lông, nha bào vỏ Vi khuẩn có hai đầu tròn, thân có hạt, đứng thành đám lớn khó phân biệt vi khuẩn Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) - GVHD: Lại Đình Biên Cấu tạo vi khuẩn lao gồm: Lipit (lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, chất lipit có mối liên hệ chặt chẽ với cấu trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid Đây đặc điểm cấu tạo trực khuẩn lao khác với vi khuẩn khác Lớp sáp phân tích có nhiều yếu tố, có yếu - tố gây bệnh tích, có yếu tố mang tính kháng nguyên Các thành phần khác protein, polysaccharide Vi khuẩn có nhiều yếu tố sợi vách chất nguyên sinh gây bệnh 1.3 Hình Vách tế bào vi khuẩn lao Phân loại Gây bệnh lao người M.tuberculois (Trực khuẩn lao người), M.bovis (Trực khuẩn lao bò), M.avium (Trực khuẩn lao chim) Chúng phân biệt tính chất sau: Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Bảng Tính chất vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn lao Vi khuẩn M.tuberculois M.bovis Hình thái Nhiệt độ Thời gian Khả khuẩn lạc phát triển mọc khuẩn gây bệnh thích hợp lạc Xù xì, màu kem 37 oC 30 ngày Lao người Xù xì, mỏng, 37 oC 30 ngày Lao bò 10 ngày Lao chim M.avium Màu hồng 37 oC M.mioroti Màu trắng 37 oC Lao người Lao chuột 1.4 Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn lao 1.4.1 Vi khuẩn lao có khả tồn lâu môi trường bên Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tồn – tháng Trong phòng thí nghiệm người ta bảo quản vi khuẩn nhiều năm Trong đờm bệnh nhân lao phòng tối, ẩm sau tháng vi khuẩn tồn giữ độc lực Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn bị chết sau 1,5 Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển chết sau 10 phút 800C; với cồn 900 vi khuẩn tồn ba phút, acid phenic 5% vi khuẩn sống phút 1.4.2 Vi khuẩn lao loại vi khuẩn hiếu khí đòi hỏi mức độ cao oxy Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, giải thích lao phổi thể bệnh gặp nhiều số lượng vi khuẩn nhiều hang lao có phế quản thông 1.4.3 Vi khuẩn lao sinh sản chậm Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 10 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, có hàng tháng, chí “nằm vùng” tổn thương lâu, gặp điều kiện thuận lợi chúng tái lại Ngoài có hình thức sinh sản giống nấm: vi khuẩn tạo cầu khuẩn để tạo vi khuẩn 1.4.4 Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hoá khác tổn thương Có quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm tế bào, có quần thể vi khuẩn phát triển chậm, đợt, có vi khuẩn nằm tế bào Những quần thể vi khuẩn chịu tác dụng khác tuỳ thuốc chống lao 1.4.5 Các chất liên quan đến tính độc vi khuẩn lao Mặc dù biết vi khuẩn lao hàng trăm năm, tính chất gây độc M tuberculosis nhiều điều chưa sáng tỏ, chúng độc tố chủ yếu gây bệnh nhiều vi khuẩn khác Nhiều chất từ M tuberculosis chứng minh tham gia vào độc tính vi khuẩn, không thật có yếu tố chủ yếu hay định 1.5 Sức đề kháng vi khuẩn Vi khuẩn có sức đề kháng tương đối mạnh với nhân tố lý hoá học - Ở bệnh phẩm đờm tồn nhiều ngày, nơi tối ẩm sau tháng vi khuẩn sống - độc lực, thực phẩm sữa sống nhiều tuần Ở nhiệt độ 42°C: Vi khuẩn ngừng phát triển nhiệt độ 80°C/10 phút: vi khuẩn bị - chết Cồn 90° С tồn phút, acid phenic 5% sau phút bị tiêu diệt Vi khuẩn kháng với nhiều loại thuốc chống lao ngày tăng lên Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 11 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN BỆNH LAO 2.1 Đặc điểm bệnh lao Bệnh lao phổi bệnh truyền nhiễm, vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) Ngoài phân lập số Mycobacteria khác M bovis… Lao phổi bệnh lao thường gặp nhất, chiếm tới 80% tổng số bệnh lao Lao phổi thể lao gây lây nhiễm cho người khác Bệnh dễ lây từ người sang người lây đường hô hấp Khả lây mạnh thời gian chưa điều trị Cứ người bị lao phổi có ho khạc vi khuẩn lây cho 10-15 người khác, quần thể dân cư nhỏ gia đình, lớp học, trước người bệnh điều trị Khi điều trị thuốc chống lao, khả lây bệnh thấp Bệnh lao bệnh xã hội: Nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao có nơi giới Bệnh lao tăng hay giảm phụ thuộc vào kinh tế xã hội, chế độ xã hội, mức sống, tượng xã hội thiên tai, chiến tranh, nước có nhiều người nhiễm HIV… Hình Thống kê quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao Bệnh lao bệnh diễn biến qua giai đoạn: Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 12 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) • GVHD: Lại Đình Biên Giai đoạn lao nhiễm: Là lần vi khuẩn lao xâm nhập vào thể chủ yếu theo đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang Sau khoảng tuần đến tháng, tác động vi khuẩn lao, thể có chuyển biến mặt sinh học, hình thành dị ứng miễn dịch vi khuẩn lao, người bị lây tình trạng nhiễm lao • Giai đoạn lao bệnh: Còn gọi lao thứ phát sau lao sơ nhiễm Đa số người bị lây tình trạng nhiễm lao mà không trở thành lao bệnh Chỉ có khoảng 10% số lao nhiễm chuyển thành lao bệnh Bệnh lao xảy có thăng khả gây 2.2 - bệnh vi khuẩn lao sức đề kháng thể Triệu chứng bệnh lao Ho dai dẳng từ tuần trở lên Ho máu Đau ngực, khó thở Sốt nhẹ chiều, đổ mồ hôi ban đêm Mệt mỏi, chán ăn, sụt cân Gầy ốm Nổi hạch vùng cổ 2.3 Phương thức lây truyền Vi khuẩn lao vào thể qua đường hô hấp phổ biến Người bị lao phổi có vi trùng lao đàm ho khạc, hắt hơi, … tạo hạt nhỏ có chứa vi trùng lao Người khác hít hạt vào phổi bị nhiễm lao Vi trùng lao vào thể cách theo không khí vào phổi, sau tiếp tục gây bệnh phổi đến gây bệnh quan khác theo đường máu, đường bạch huyết đường phế quản Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 13 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN PHƯƠNG PHÁP PCR 3.1 Khái niệm chung: Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp- polymerase Chain Reaction) phương pháp in vitro để nhân nhanh đoạn DNA đó, có độ nhạy cao, mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế 3.2 Nguyên tắc phương pháp PCR Tất DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa vào đặc tính DNA polymerase Thật vậy, ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA, ta tổng hợp đoạn DNA nằm hai mồi Điều có nghĩa để khuếch đại trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu trình tự đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt; mồi gồm mồi xuôi (sens primer) mồi ngược (anti sens primer) Từ “xuôi” “ngược” phải hiểu “xuôi” “ngược” so với chiều phiên mã gen 3.3 Thực nghiệm Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước:  Bước 1: Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94- 95OC vòng 30 giây – phút Đây giai đoạn biến tính ( denaturation)  Bước 2: Nhiệt độ hạ thấp( thấp Tm mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn; thực nghiệm, nhiệt độ dao động khoảng 40 OC – 70OC, tùy thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây -1 phút Đây giai đoạn lai  ( hybridization) Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72OC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn polymerase chiu nhiệt hoạt đông tổng hợp tốt Thời gian tùy thuộc vào đọ dài Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 14 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút giai đoạn tổng hơp hay kéo dài ( elongation) Một chu kỳ bao gồm bước lặp lặp lại nhiều lần, lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ khuếch đại 106 so với lượng mấu ban đầu Hình 4: Nguyên tắc phương pháp PCR 3.4 Các điều kiện phản ứng PCR Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 15 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có thành phần sau: - DNA khuôn Mồi DNA polymerase Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP ) Dung dịch đệm (buffer) 3.4.1 DNA khuôn (template) Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh nhiều kỹ thuật chuẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm ( 1micro gam xuống 100 ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu hạn chế khuếch đại “ ký sinh” tạo sản phẩm phụ không mong muốn Một ưu điểm lớn khác phương pháp PCR cho phép khuếch đại mẫu DNA không bảo quản tốt, bị phân hủy phần vết máu để lâu ngày, tinh dịch khô, hóa thạch, tóc , móng tay người chết… 3.4.2 Enzyme Enzyme sử dụng đoạn Klenow DNA polymerase1 Vì enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp hiệu thấp ( phải them enzyme vào phản ứng sau lần biến tính enzyme cũ bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lại thấp khiến khuếch đại ký sinh cao,…) Phương pháp PCR chuyển sang bước ngoặc lớn với phát DNA polymerase chịu nhiệt tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus Emzyme – Taq polymerase – không bị phá hủy nhiệt độ biến tính xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối trình phản ứng, vi khuẩn chịu nhiệt độ từ 50 OC -80OC sinh trưởng tối ưu nhiệt độ 70 OC Taq DNA polymerase enzyme đơn phân, có khối lượng phân tử 90 kDa Bản thân enzyme chịu nhiệt, xúc tác tái DNA 74 OC chí trì khả ăng hoạt động chức sau ủ 95OC Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đưa thị trường với nhiều chức chuyên biệt hay hoàn thiện Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 16 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên VenTM DNA polymerase, cô lập từ Thermococcus litoralis - vi khuẩn cổ tìm thấy đáy đại dương nhiệt độ 98 OC Enzyme có tính chịu nhiệt cao Taq DNA polymerase, có khả nhân sản phẩm có kích thước lên đến 13kb Tính trung thực nhân VenTM DNA polymerase cao enzyme có them hoạt tính sửa sai 3’5’ exonuclease Pfu DNA polymerase cô lập từ vi khuẩn cổ đại dương Pyroccus furiosus hay Ultma DNA polymerase ( từ Thermotoga maritima) có tính trung thực cao nhờ hoạt tính tương tự Tth polymerase, enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả hoạt động enzyme phiên mã ngược có mặt RNA khuôn ion Mn ++ ; với diện DNA khuôn ion Mg++ , Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA Enzyme cho phép khuếch đại mẫu RNA thông qua hình thành cDNA 3.4.3 Mồi nhiệt độ lai Mồi tiêu quan trọng để đạt khuếch đại đặc trưng có hiệu cao Việc chọn mồi giai đoạn định phương pháp PCR, phải tuân thủ số nguyên tắc: - Trình tự mồi chọn sau cho có bắt cặp bổ sung mồi “ xuôi” mồi “ ngược”, cấu trúc “kẹp tóc” bắt cặp bổ sung - phần khác mồi Tm mồi xuôi mồi ngược không cách biệt xa Thành phần nucleotide - mồi cân tránh cặp GC lặp lặp lại nhiều lần Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại gen 3.4.4 Các thành phần khác phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thường sử dụng nồng độ 20-200 micro mol / loại nucleotide Nông độ cao dễ dẫn đến khuếch đại “ký sinh” Sự cân thành phần nucleotide lại làm tăng lỗi chép polymerase Nồng độ ion Mg++ nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu tính đặc hiệu trình PCR Không có quy luật chung cho vấn đề Nồng độ tối ưu phải xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nhưng thông thường, nồng Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 17 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên đô Mg qua thấp làm giảm hiệu nhân nồng độ cao tạo sản phẩm không đặc hiệu 3.4.5 Số lượng chu kỳ phản ứng PCR Không 40 chu kỳ Khuếch đại giảm do: + Sự phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng + Xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng + Các vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà tái bắt cặp - 3.5 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR Hình Máy nhân gen PCR Phản ứng PCR thực máy chu trình nhiệt Đây máy đun nóng làm nguội ống phản ứng nhiệt độ xác cho phản ứng Để ngăn ngừa bay hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy máy PCR đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng ít, người ta cho lớp dầu lên mặt hỗn hợp phản ứng Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác, tránh tối đa bốc nước Có thể tiến hành PCR mô tế bào Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên thí nghiệm nghiên cứu cần tiến hành loại Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 18 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Ống nghiệm dùng nghiên cứu phải kiểu đặc tính truyền nhiệt ống nhiệt độ tiếp xúc ống phận tỏa nhiệt thiết bị có ảnh hưởng đến trình khuếch đại 3.6 Ưu điểm hạn chế kỹ thuất PCR 3.6.1 Ưu điểm • Thời gian thực cực nhanh: cần để khuếch đại trình tự DNA quan tâm, so với phương pháp tạo dòng kỹ thuậ tái tổ hợp DNA phải tuần lâu • Đơn giản tốn :Nó thực ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu sử dụng đồng thời • Độ tin mẫu không cần cao: PCR thực với mẫu nucleic acid thô • PCR giúp phân biệt gen đột biến đoạn, them đoạn hay đột biến điểm • Dùng để định lương so sánh cách cho tiến hành khuếch đại đồng thời trình tự đích trình tự chứng có nồng độ biết Nhờ ưu trên, PCR hấp dẫn nhà nghiên cứu từ lúc đời việc khuếch đại trình tự nucleic acid đặc hiệu chẩn đoán phân tử 3.6.2 Hạn chế - Sự ngoại nhiễm vấn đề lớn đặt PCR, gắn liền với khả khuếch đại phương pháp Vấn đề đặc biệt cấp thiết ứng dụng chẩn đoán, dự phòng hậu nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn thường sản phẩm khuếch đại lần thao tác trước Có thể khắc phục phần vấn đề số biện pháp sau:  Các công đoạn thao tác khác thiết lập phản ứng PCR phân tích sản phẩm khuếch đại phải tiến hành địa điểm cách xa  Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng ( micropipette) không sử dụng vào thao tác khác Đầu típ sử dụng với micropipette pahir có lớp lọc tránh nhiễm đầu micropipette phân tử khuếch đại hút dung dịch phản ứng  Dùng tia tử ngoại để loại bỏ phân tử lại từ lần khuếch đại trước Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 19 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên  Tất thành phần phản ứng chia thành lượng nhỏ, tính toán sau cho đủ với 1, thao tác Ngoài ra, hang sản xuất tung thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ hoàn toàn ngoại nhiễm - Sự nhân không đặc hiệu: xảy mồi bắt cặp không đặc hiệu với trình tự khác với trình tự đích.Một số phương pháp sử dụng để hạn chế vấn đề này:  Phương pháp “ hot start” với đặc điểm chủ yếu tránh tiếp xúc thành phần quan trọng phản ứng trước trình tự đích biến tính hoàn toàn  Phương pháp nested PCR ( PCR “tổ” ) sử dụng them cặp mồi thứ hai thiết kế để bắt cặp sản phẩm nhân từ cặp mồi thứ Phương pháp tăng độ nhạy độ đặc hiệu đồng thời làm tăng khả ngoại nhiễm phản ứng - Các sai sót gây Taq polymerase: chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao ( 10-4, nghĩa 10000 nucleotide enzyme gắn sai nucleotide) Đặc tính không quan trọng ta cần xem xét kích thướt hay có mặt sản phẩm khuếch đại có ý nghĩa lớn cần xác định xác trình tự nucleotide DNA Ta loại bỏ hoàn toàn sai sót mà giảm bớt 3.7 Ứng dụng phương pháp PCR • • Việc sản xuất mẫu dò dùng phương pháp lai phân tử Khuếch đại số lượng RNA thông qua kỹ thuật RT-PCR ( phiên mã ngược tạo cDNA từ RNA- khuếch đại cDNA) • Định lượng so sánh sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác Ngoài ra, phương pháp ngày ứng dụng vào nhiều phương pháp khác( xác định trình tự nucleic acid, tạo đột biến định hướng…) Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 20 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BẰNG PCR Bệnh lao ngày gia tăng xuất vi khuẩn lao kháng thuốc Số người bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc kháng đa thuốc 50 triệu người toàn cầu Bệnh lao kháng đa thuốc điều trị tốn tiền gấp trăm lần có tỷ lệ lành bệnh thấp Vì vậy, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có ý nghĩa quan trọng sức khỏe cộng đồng Chẩn đoán bệnh lao có nhiều phương pháp khác khám lâm sàng, chụp X quang phổi, tìm BK đờm, Trong đó, kỹ thuật PCR kỹ thuật sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm khuẩn, bao gồm bệnh lao, phương pháp đại có độ nhạy độ xác cao Phương pháp thực kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Lấy mẫu máu vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch chống đông tụ EDTA phân tích mẫu Toàn mẫu tube trải dung dịch FicolHypaque ly tâm 400 vòng 30 phút nhiệt độ phòng Phần kết tủa rửa lần với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl) Tế bào, 106, ly tâm 9000 vòng 15 phút, ủ 100 µl buffer phân giải (50mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet P-40) có chứa 100µg enzyme proteinase K ml 56 oC 3h sau nâng nhiệt độ biến tính 95oC 10 phút Tất mẫu phân tích với cặp primer (PCO4-GH20) khuếch đại vùng gene β-globin, với biến đổi sau: phản ứng PCR thực với thể tích cuối 25 µl chứa 1.5 mM MgCl2 12.5 µl dung dịch dung giải mẫu Tiến trình cho phép định lượng toàn DNA tế bào có mặt tác nhân ức chế Taq polymerase Sự khuếch đại tiến hành mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi động nóng Phản ứng phát vùng 123-bp từ trình tự chèn IS 6110 phức hợp chuyên biệt M tuberculosis PCR thực chu kỳ nhiệt DNA ( PerkinElmer Cetus, Norwalk, Conn) Phản ứng khuếch đại thực với thể tích 25 µl Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 21 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, primers (1mM loại), 100000 PBMC Sau hỗn hợp phản ứng đạt 82oC, 0.625 unit Taq pol thêm vào Sau mẫu biến tính 94oC khoảng phút, thực 30 chu kỳ khuếch đại với quy trình sau: biến tính 94oC phút, bắt cặp 68oC phút, kéo dài với mồi 72oC phút Thời gian kéo dài tăng thêm 5s với chu kỳ Sau khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng điện di ethidium bromidecó chứa 2% gel agarose quan sát tia UV DNA chuyển qua màng nylon alkaline blotting Lai phân tử thực 53 SSPE (0.75 M NaCl, 50 mM sodium phosphate [pH 7.7], mM EDTA)- dung dịch 13 Denhardt’s- 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)–10% dextran sulfate 55oC để qua đêm với mẫu dò đánh dấu 32P Sự bắt cặp đặc hiệu mẫu dò khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm sử dụng phản ứng lai Sau đó, màng lai rửa 2x SSPE- 0.1 % SDS 55 oC đưa vào máy … Có chứa màng hình khuếch đại khoảng đến 24h -70 oC Mẫu dương tính nhìn thấy kỹ thuật phóng xạ tự ghi Trong tất trường hợp, kết đạt từ mẫu nhân giống hoàn toàn Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 22 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên KẾT LUẬN Với tác động ngày tăng bệnh lao xuất chủng Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có ý nghĩa quan trọng sức khỏe cộng đồng Ở nước phát triển, tác động cao bệnh lao không liên quan đến bệnh AIDS tình trạng vô gia cư mà liên quan đến tuổi dân số Mặc dù phổi quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, dạng bệnh bị nhiễm phải hay bệnh phổi thường xuyên, phát đến khoảng 77% bệnh nhân bị nhiễm HIV 24% bệnh nhân không nhiễm HIV Do ưu điểm tuyệt đối nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán bệnh virus, vi khuẩn, bệnh ký sinh trùng cho kết xác Việc sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis nhanh xác so với phương pháp khác đưa hướng điều trị bệnh thích hợp góp phần làm giảm lây lan vi khuẩn lao Phát điều trị sớm giảm tỉ lệ tử vong nước Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 23 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục http://textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html http://jcm.asm.org/content/36/10/3094.full http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC228836/ http://www.dieutri.vn/benhhoclao/17-3-2013/S3619/Dac-diem-cua-benh-lao.htm Sinh viên thực hiện: Tổ 15 Trang 24 [...]... tháng, dưới tác động của vi khuẩn lao, cơ thể có sự chuyển biến về mặt sinh học, hình thành dị ứng và miễn dịch đối với vi khuẩn lao, người bị lây ở trong tình trạng nhiễm lao • Giai đoạn lao bệnh: Còn gọi là lao thứ phát sau lao sơ nhiễm Đa số người bị lây trong tình trạng nhiễm lao mà không trở thành lao bệnh Chỉ có khoảng 10% số lao nhiễm chuyển thành lao bệnh Bệnh lao chỉ xảy ra khi có sự mất thăng... Tổ 15 Trang 20 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN 4 CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BẰNG PCR Bệnh lao ngày càng gia tăng và sự xuất hiện của các vi khuẩn lao kháng thuốc Số người bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc và kháng đa thuốc là hơn 50 triệu người trên toàn cầu Bệnh lao kháng đa thuốc điều trị tốn tiền... Bệnh lao phổi là một bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) Ngoài ra còn phân lập được một số Mycobacteria khác như M bovis… Lao phổi là bệnh lao thường gặp nhất, chiếm tới 80% trong tổng số bệnh lao Lao phổi là thể lao gây lây nhiễm cho người khác Bệnh rất dễ lây từ người sang người do lây bằng đường hô hấp Khả năng lây mạnh trong thời gian chưa được điều trị Cứ 1 người bị lao. .. mắc lao cao Bệnh lao là một bệnh diễn biến qua 2 giai đoạn: Sinh vi n thực hiện: Tổ 15 Trang 12 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) • GVHD: Lại Đình Biên Giai đoạn lao nhiễm: Là lần đầu tiên vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếu theo đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương vi m phế nang Sau khoảng 3 tuần đến một tháng, dưới tác động của vi. .. 42°C: Vi khuẩn ngừng phát triển nếu ở nhiệt độ 80°C/10 phút: vi khuẩn bị - chết Cồn 90° С tồn tại được 3 phút, acid phenic 5% sau 1 phút bị tiêu diệt Vi khuẩn kháng với nhiều loại thuốc chống lao và ngày càng tăng lên Sinh vi n thực hiện: Tổ 15 Trang 11 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên PHẦN 2 BỆNH LAO 2.1 Đặc điểm của bệnh lao. .. đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác Vi c sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis sẽ nhanh và chính xác hơn so với các phương pháp khác đưa ra hướng điều trị bệnh thích hợp góp phần làm giảm sự lây lan của vi khuẩn lao Phát... của vi khuẩn lao và sức đề kháng của cơ thể Triệu chứng của bệnh lao Ho dai dẳng từ 3 tuần trở lên Ho ra máu Đau ngực, khó thở Sốt nhẹ về chiều, đổ mồ hôi ban đêm Mệt mỏi, chán ăn, sụt cân Gầy ốm Nổi hạch vùng cổ 2.3 Phương thức lây truyền Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất Người bị lao phổi có vi trùng lao trong đàm khi ho khạc, hắt hơi, … sẽ tạo ra các hạt nhỏ có chứa vi trùng... các hạt nhỏ có chứa vi trùng lao Người khác hít những hạt này vào phổi sẽ bị nhiễm lao Vi trùng lao vào cơ thể bằng cách theo không khí vào trong phổi, sau đó tiếp tục gây bệnh tại phổi hoặc đến gây bệnh ở những cơ quan khác hoặc theo đường máu, đường bạch huyết hoặc đường phế quản Sinh vi n thực hiện: Tổ 15 Trang 13 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)... ban đầu Hình 4: Nguyên tắc của phương pháp PCR 3.4 Các điều kiện của phản ứng PCR Sinh vi n thực hiện: Tổ 15 Trang 15 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau: - DNA khuôn Mồi DNA polymerase Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP ) Dung dịch đệm (buffer) 3.4.1 DNA khuôn (template)... dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) GVHD: Lại Đình Biên Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, nhưng có khi hàng tháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn thương rất lâu, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể tái lại Ngoài ra còn có hình thức sinh sản giống nấm: 2 vi khuẩn tạo ra cầu khuẩn để tạo vi khuẩn mới 1.4.4 Vi khuẩn lao có nhiều quần