NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH ĐẬU GÀ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU GÀ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA THÚ Y  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH ĐẬU GÀ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU GÀ Người hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN THỊ LAN Người thực hiện : LƯƠNG THU HƯỜNG Lớp : TYB K55 Mã sinh viên : 554679 HÀ NỘI - 2014 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tôi đã được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo trong khoa Thú y đã giúp tôi có những kiến thức cơ bản của nghề nghiệp, cũng như tư cách, đạo đức của người làm kỹ thuật, của một bác sĩ thú y. Nhân dịp này cho phép tôi được gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất tới: PGS.TS Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Các chị trên phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú Y – Học viện Nông Ngiệp Việt Nam. Cùng toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ công nhân viên bộ môn Bệnh lý thú y và toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Thú Y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Sự động viên và tạo điều kiện tốt nhất của gia đình, bạn bè đã góp phần giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của tất cả mọi người. Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014 Sinh viên Lương Thu Hường Học viện Nông nghiệp Việt Nam i Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 MỤC LỤC Học viện Nông nghiệp Việt Nam ii Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Quy trình chạy mẫu bằng máy chuyển đúc mẫu tự động Bảng 3.2.Thành phần và thể tích mỗi phản ứng PCR gồm: Bảng 3.3. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt Bảng 4.1. Tình hình chăn nuôi gà chung tại xã Xuân Thu – Sóc Sơn Bảng 4.2. Tỷ lệ mắc bệnh đậu gà theo lứa tuổi tại xã Xuân Thu – Sóc Sơn – Hà Nội STT 31 Lứa tuổi 31 Số gà được theo dõi Số con mắc 31 Tỷ lệ mắc (%) Bảng 4.3. Triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc bệnh đậu Bảng 4.4. Bệnh tích đại thể của gà nghi mắc đậu giai đoạn 2 - 3 tháng tuổi Học viện Nông nghiệp Việt Nam iii Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lớp vỏ virus 6 Hình 1.2. Cấu trúc virus 6 Hình 1.3. Bệnh đậu ở thể niêm mạc (Dinev, 2011) 13 Hình 1.4. Màng giả giống như bã đậu dính vào niêm mạc thanh quản và thực quản (tập ảnh màu về bệnh gia súc của Nhật Bản ) 13 Hình 1.5. Mô hình các bước của phản ứng PCR ( Lê Thanh Hòa, 2002) 22 Hình 4.1. Gà ủ rũ 36 Hình 4.2. Viêm mắt, chảy nước mắt 36 Hình 4.3. Nốt đậu ở mào, tích, xung quanh mắt 36 Hình 4.4. Gà khó thở 36 Hình 4.5. Con ngươi phồng to 36 Hình 4.6. Sưng đầu 36 Hình 4.7. Niêm mạc miệng phủ màng giả, có dịch nhày 40 Hình 4.8. Khí quản xuất huyết 40 Hình 4.9. Thận sưng 40 Hình 4.10. Lách nhạt màu 40 Hình 4.11. Phổi sưng 40 Hình 4.12. Tim nhão, cơ tim nhạt màu 40 Hình 4.13. Lớp tế bào bị thoái hóa trong mụn đậu gà (HE. 10x) 45 Hình 4.14. Lớp vẩy sừng hóa của mụn đậu gà (HE. 10x) 45 Hình 4.15. Phổi sung huyết trong bệnh đậu gà (HE. 10x) 45 Hình 4.16. Sung huyết lớp hạ bì trong bệnh đậu gà (HE. 20x) 45 Hình 4.17. Thể bao hàm trong mụn đậu gà 45 (HE. 20x) 45 Hình 4.18. Thể bao hàm trong mụn đậu gà (HE. 40x) 45 Hình 4.19 . Kết quả phản ứng PCR 47 Hình 4.20. Nghiền mẫu tươi dùng tách DNA 50 Hình 4.21. Chuẩn bị thạch Agarose 50 Hình 4.22. Tách chiết DNA 50 Hình 4.23. Chạy PCR trên máy PCR 50 Hình 4.24. Chạy điện di 50 Hình 4.25. Chụp ảnh gel điện di 50 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PCR : Polymerase Chain Reaction ELISA : Enzyme linked immuno sorbent assay DNA : Acid Deoxyribo Nucleic Nhuộm HE : Haematoxilin và Eosin TBE buffer : Tris boric acid EDTA TAE : Tris acid axetic EDTA Học viện Nông nghiệp Việt Nam iv Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 AVP : Variola avium pox FPV : Fowpox virus TCID50 : 50 % tissue culture infective dose (Liều gây nhiễm 50 % tế bào) CAM : Chorioallantoic membrane (màng nhung niệu) CPE : Cytophathic Effect (bệnh tích tế bào) Học viện Nông nghiệp Việt Nam v Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 .ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi của nước ta có những bước phát triển đáng kể và đang chuyển dịch theo hướng công nghiệp hóa, ngày càng chuyên sâu góp phần nâng cao thu nhập, đời sống người nông dân và toàn xã hội. Đặc biệt ngành chăn nuôi gà ngày càng phát triển mạnh với quy mô lớn . Tuy nhiên, cùng với sự phát triển thì tình hình dịch bệnh cũng diễn biến phức tạp. Trong đó, bệnh đậu gà là một trong những bệnh truyền nhiễm nan giải tuy không gây chết ồ ạt trong một thời gian ngắn nhưng nó làm chết rải rác, kéo dài, gây tổn thất khá lớn cho đàn gà đặc biệt chăn nuôi gà công nghiệp. Bệnh gây ra bởi virut DNA thuộc nhóm Avipoxvirus, họ Poxviridae. Bệnh phân bố rộng khắp trên toàn thế giới, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế đối với các đàn gia cầm vì nó gây giảm sản lượng trứng đối với đàn gà đẻ, gây giảm sự tăng trưởng đối với gia cầm non và gây tỷ lệ chết đáng kể đối với tổng đàn (Isa và cộng sự, 2002; Ariyshi và cộng sự, 2003). Bệnh lây lan chậm với những đặc trưng của bệnh là hình thành những nốt đậu hoặc vẩy ở những vùng da không có lông (gọi là thể ngoài da) hoặc hoại tử fibrin và các bệnh tích tăng sinh ở lớp màng nhầy của đường hô hấp trên, miệng, thực quản (gọi là thể thực quản). Gia cầm bị bệnh đậu có thể bị ở thể ngoài da hoặc thể bạch hầu hoặc có thể bị cả hai thể cùng lúc. Đứng trước thực tế trên thì yêu cầu tìm hiểu về bệnh cũng như chẩn đoán chính xác để ngăn chặn hạn chế dịch bệnh xảy ra là vô cùng cần thiết. Trong các phương pháp chẩn đoán hiện nay thì PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ chính xác cao. Phương pháp này có thể chẩn đoán chính xác khi lượng virus trong con vật mắc bệnh rất nhỏ. Đây là ứng dụng to lớn của ngành công nghệ sinh học vào công tác chẩn đoán bệnh. Để khống chế, phòng và trị bệnh hiệu quả thì những kiến thức về đặc điểm bệnh lý cũng rất quan trọng. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh đậu gà và ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh đậu gà”. Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Xác định được biến đổi đại thể và vi thể của một số cơ quan, tổ chức của gà mắc bệnh đậu. - Thiết lập được quy trình chẩn đoán virus đậu bằng kỹ thuật PCR. Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH ĐẬU GÀ 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh đậu gà trên thế giới Đậu gà đã được phát hiện từ lâu trên nhiều loại gia cầm. Ban đầu thuật ngữ đậu gà bao gồm tất cả các bệnh đậu virus của chim, nhưng ngày nay tiêu chí được sử dụng cho các bệnh ở đàn gia cầm thương phẩm. Lúc đầu Woodruff và Goadpasture chứng minh rằng các tiểu phần virus trong thể ẩn là tác nhân gây bệnh đậu gà. Sau này người ta chứng minh rằng kháng huyết thanh kháng virus đậu gà hình thành sau miễn dịch hoặc sau khi khỏi bệnh đã ngưng kết một huyễn dịch các thể cơ bản của virus đậu gà. Mô tả về thể vùi tế bào trong bệnh đậu gia cầm. Năm 1873 đã phát hiện những tiểu thể nội bào trong tế bào biểu bì của nốt đậu người mà Michaelis coi đó là những thể vùi đặc hiệu của bệnh đậu và mô tả kỹ tiểu thể nội bào trong bệnh đậu gà mà ngày nay được gọi là thể bao hàm Bollinger để ghi nhớ công người phát hiện. Năm 1887 lần đầu tiên người ta thấy virus đậu gà bằng kính hiển vi quang học. Năm 1904 khám phá ra các tiểu thể nhỏ (0,25 m) nằm rải rác trong nguyên sinh chất tế bào bong kết lại thành đám gọi là tiểu thể bao hàm Bollinger, sự phát hiện này dẫn đến hàng loạt những nghiên cứu về bản chất của chúng và rất nhiều công trình nghiên cứu gần đây bằng phương pháp tổ chức học, nghiên cứu trên kính hiển vi quang học… và ngày nay người ta đã xác định rõ bản chất sinh học của thể vùi tế bào này. Năm 1906 mô tả tiểu thể nội bào của bệnh đậu mùa trên tiêu bản phết. Năm 1923 đã tiến hành tiêm chủng vacxin phòng bệnh đậu gà từ chủng giảm độc lực (chủng virus II ở Đức). Năm 1925 đã nhân giống virus vacxin trên tế bào nuôi. Theo Woodruff và Goodpasture đã sử dụng phôi gà để nuôi cấy virus đậu, cấy virus đậu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy virus vào màng niệu đạo của phôi trứng. Từ năm 1929- 1931, Woodruff và Goodpasture chứng minh virus trong các thể vùi là nguyên nhân gây ra bệnh. Năm 1932 đã xác định khả năng gây nhiễm của chất qua lọc và ly tâm tiểu thể nội bào của virus đậu. Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thu Hường TYB – K55 Năm 1954 mô tả bệnh giống như bệnh đậu ở muỗi. Năm 1962 Bigelli mô tả bệnh đậu ở cá. Năm 1963 nghiên cứu về siêu cấu trúc của virus đậu bằng phương pháp nhuộm âm bản và soi kính hiển vi điện tử. Các nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus đậu nói chung và đậu gà nói riêng, về cơ chế sinh bệnh, về chẩn đoán bệnh và về vacxin phòng bệnh của nhiều tác giả đã làm sáng tỏ về bệnh đậu. Bệnh xảy ra nhiều nơi trên thế giới, gây thiệt hại đáng kể (Isa và cộng sự, 2002; Tripathy & Reed, 2003; Pledger, 2005). Trong hơn 40 năm nay thiêt hại do bệnh đã giảm rất nhiều do hiệu quả của việc phòng bệnh bằng vaccine, ở các nước chăn nuôi gia cầm tiên tiến hầu như không còn thấy bệnh đậu. Bệnh xảy ra nhiều ở các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới hơn các nước vùng ôn đới và hàn đới (Beytut & Haligur, 2007). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh đậu trong nước Ở Việt Nam có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh đậu gà đặc biệt là công trình nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Như Thanh trong việc nghiên cứu ra vacxin nhược độc đậu gà chủng C cho việc phòng bệnh có hiệu quả. Năm 1975. Kết quả bước đầu nghiên cứu vacxin nhược độc đậu gà chế từ chủng C” đăng trong tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp Năm 1976. Kết quả bước đầu nghiên cứu vacxin nhược độc đậu gà chế từ chủng C” đăng trong tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp Năm 1978. Kết quả bước đầu nghiên cứu vacxin nhược độc đậu gà chế từ chủng C - Bảo quản và thực nghiệm trong sản xuất đăng trong tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp . Năm 1979. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử sự nhân lên của virus nhược độc đậu gà chủng C trong nuôi cấy tế bào đăng trong tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp Năm 1980. Xác định hiệu giá virus trong hỗn dịch tế bào nuôi phôi gà sau khi gây nhiễm virus đậu gà đăng trong tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp. Học viện Nông nghiệp Việt Nam 4 [...]... Bệnh lý và phòng thí nghiệm trung tâm – Khoa Thú y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu: 07/2014 – 11/2014 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra tình hình bệnh đậu gà trên địa bàn xã Xuân Thu - Nghiên cứu một số biểu hiện triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc bệnh đậu - Nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý đại thể của gà nghi mắc bệnh đậu - Nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý vi thể trên gà nghi... bồ câu, đậu vịt và đậu chim hoàng yến Chim hoàng yến rất mẫn cảm với đậu hoàng yến nhưng đề kháng cao với đậu gà, đậu gà tây và đậu bồ câu.Virus đậu bồ câu gây bệnh nhẹ cho gà và gà tây nhưng rất độc với gà bồ câu Vịt không mẫn cảm với virus đậu gà nhưng mẫn cảm với virus đậu gà tây, do đó có thể sử dụng đặc tính này để phân biệt 2 chủng virus với nhau Bệnh đậu gà không lây sang người và động vật có... Năm 1981 Nghiên cứu một số đặc tính của virus nhược độc đậu gà trên môi trường nuôi tế bào Báo cáo Khoa học kỹ thuật nông nghiêp Nhà xuất bản Nông nghiệp Và một vài công trình nghiên cứu khác Xí nghiệp thuốc thú y trung ương cũng đã nghiên cứu thành công sản xuất vắcxin nhược độc đông khô phòng bệnh đậu gà bằng công nghệ nuôi cấy tế bào Đây là một bệnh lây lan chậm với những đặc trưng của bệnh là hình... cầm và trong môi trường Sự nhân lên của virus đậu gia cầm xuất hiện tương tự như trong biểu mô của gà, trong tế bào biểu mô của màng nhung niệu của phôi gà đang phát triển và ở tế bào da của phôi Tuy nhiên sự khác nhau trên các tế bào vật chủ và các chủng virus có thể tác động đến thời gian nhân lên của virus Sự tổng hợp sinh học của virus đậu gà trong biểu mô bao gồm 2 pha khác nhau: sự đáp ứng của. .. vacxin Tất cả gà trong đàn phải được chủng đậu trong cùng một ngày Nếu bệnh đậu lần đầu tiên xuất hiện trong đàn, số lượng gà bị bệnh ít những gà còn lại phải được chủng vacxin Vacxin đậu gà : thường chủng cho gà 4 tuần tuổi và nếu gà đẻ cần chủng trước khi đẻ 1 – 2 tháng, hàng năm tái chủng, không được dùng vacxin cho gà đang đẻ Với gà tây dùng lần đầu lúc 2 – 3 tháng tuổi, tái chủng vào thời gan nghỉ... sau 4- 14 ngày gây nhiễm và ở tế bào biểu mô lưới miền tủy tuyến ức sau 4- 10 ngày - Trên phôi gà: phôi gà sạch bệnh thường được dùng để phân lập và nuôi cấy virus đậu gà bằng cách tiêm vào màng nhung niệu của phôi thai gà ấp 10 – 12 ngày Dùi một lỗ ở buồng hơi và một lỗ tiêm cách xa thai và mạch máu, lỗ thứ 2 này rất nông không xuyên qua niệu mô, nhỏ một giọt nước sinh lý vào lỗ tiêm, dùng một quả bóng... chủ đặc trưng bởi tăng sinh tế bào trong suốt 72h đầu tiên và sự tổng hợp của virus gây bệnh từ 72 – 96h sau khi nhiễm bệnh Sự nhân lên của DNA virus trong biểu bì bắt đầu giữa 12 và 24 h sau khi nhiễm bệnh và tiếp theo là sự xuất hiện của virus gây bệnh sau đó Sự tăng sinh của biểu mô kéo dài từ 36 – 48h sau nhiễm bệnh và kết thúc với một sự tăng số lượng tế bào lên 2,5 lần trong 72h sau nhiễm bệnh. .. sung thêm Vitamin đặc biệt Vitamin-A + Nếu bệnh nặng cần dùng kháng sinh phòng vi khuẩn bội phát + Đốt chất thải của gà, độn chuồng, độn ổ đẻ + Phun sát trùng thường xuyên trong thời gian gà bị bệnh + Chủng đậu cho các đàn chưa mắc bệnh ở khu vực xung quanh đàn gà bị bệnh 2.9 KỸ THUẬT PCR ( Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuât PCR được Kary mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985 Kỹ thuật này tiếp... nhiều bệnh hỗn hợp, các đoạn với kích thước khác nhau có thể được khuếch đại trong phản ứng PCR đơn có sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu Thí dụ thể bạch hầu của bệnh đậu gà và bệnh viêm thanh quản truyền nhiễm cũng có các triệu chứng lâm sàng giống nhau và đều gây bệnh tích ở khí quản Dùng các đoạn mồi đặc hiệu virus có thể phát hiện được các bệnh này 2.7 PHÒNG BỆNH 2.7.1 Phòng bệnh bằng vacxin  Cơ sở của. .. đổi bệnh lý vi thể trên gà nghi mắc bệnh đậu - Chẩn đoán gà nghi mắc bệnh đậu bằng phương pháp PCR 3.4 NGUYÊN LIỆU 3.4.1 Mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm được dùng trong nghiên cứu là: tổ chức da vùng có chứa mụn đậu, khí quản, gan, thận, tim, phổi, lách của gà nghi mắc bệnh đậu Mẫu được bảo quản ở - 800C 3.4.2 Hóa chất, môi trường, mồi cần thiết - Hóa chất thông thường trong phòng thí nghiệm: nước cất, formol . trọng. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh đậu gà và ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh đậu gà”. Học viện Nông nghiệp Việt. Tình hình nghiên cứu bệnh đậu trong nước Ở Việt Nam có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh đậu gà đặc biệt là công trình nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Như Thanh trong việc nghiên cứu ra vacxin. NAM KHOA THÚ Y  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH ĐẬU GÀ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU GÀ Người hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN THỊ LAN Người