Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QFPCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST

B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI ********************** NGUYN HOI NAM NGHIÊN CứU ứng dụng kỹ thuật qf-pcr trong chẩn đoán trớc sinh một số hội chứng lệch bội nhiễm sắc thể LUN VN THC S Y HC H NI - 2011 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI ********************** NGUYN HOI NAM NGHIÊN CứU ứng dụng kỹ thuật qf-pcr trong chẩn đoán trớc sinh một số hội chứng lệch bội nhiễm sắc thể Chuyờn ngnh : Húa sinh Y hc Mó s : 60.72.04 LUN VN THC S Y HC Hng dn khoa hc: TS . HONG TH NGC LAN H NI - 2011  Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Hoàng Thị Ngọc Lan người thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. TS. Trần Vân Khánh – Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn. PGS.TS. Tạ Thành Văn –Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein– Cán bộ giảng dạy bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi nhiều kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài. Tiếp theo tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứ u. Các thầy cô bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập. Các thầy cô bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Các anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại Trung tâm. Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghi ệp đã giành cho tôi sự ủng hộ nhiệt tình, chia sẻ với tôi những lúc thành công cũng như khó khăn. Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng của bố mẹ . Sự yêu thương, động viên từ những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 10 năm 2011 Nguyễn Hoài Nam  LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST” là đề tài do bản thân tôi thực hiện. Các số liệu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố. Tác giả Nguyễn Hoài Nam  DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFP Alfa feto-protein AF Amniotic fluid BP Base pair ΒhCG Beta_human chronic gonadotropin CVS Chrionic villus sample DNA Deoxyribonucleic acid DTBS Dị tật bẩm sinh FISH Fluorescent in situ hybridization NST Nhiễm sắc thể PAPP-A Pregnancy – associated plasma protein A PCR Polymerase chain reaction PGD Preimplantation Genetic Diagnosis PUBS Percutaneous umbilical blood sampling QF-PCR Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SRT Short tandem repeat Taq Theramus aquaticus TOP Termination of pregnancy uE 3 Unconjugated Estriol- Estriol không liên hợp  MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường số lượng nhiễm sắc thể X,Y 3 1.1.1. Hội chứng Down (Trisomy 21) 3 1.1.2. Hội chứng Patau (Trisomy 13) 4 1.1.3. Hội chứng Edwards (Trisomy 18) 5 1.1.4. Hội chứng Klinefelter (XXY) 6 1.1.5. Hội chứng XYY 6 1.1.6. Hội chứng Trisomy X (Hội chứng siêu nữ) 6 1.1.7. Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner) 7 1.2. Một số phương pháp sàng lọc trước sinh 8 1.2.1. Siêu âm thai: 8 1.2.2. Test sàng lọc bộ ba (triple test : AFP, βhCG,uE 3 ) 10 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH 12 1.3.1. Lấy mẫu di truyền 12 1.3.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào 14 1.3.3. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tử . 15 1.3.4. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử: 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: 23 2.1.2. Địa điểm lấy mẫu: 23 2.1.3. Địa điểm phân tích mẫu: 23 2.2. Thời gian nghiên cứu 23 2.3. Phương tiện nghiên cứu 23 2.3.1. Dụng cụ: 23  2.3.2. Hóa chất: 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 24 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu: 24 2.4.2. Kỹ thuật sử dụng: 24 2.5. Xử lý và phân tích số liệu 30 2.6. Vấn đề đạo đức của đề tài 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1. Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32 3.2. Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33 3.3. Minh họa kết quả QF-PCR của một số trường hợp 38 3.3.1. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 12 38 3.3.2. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41 3.3.3. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43 3.3.4. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45 3.3.5. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47 3.3.6. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 49 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53 4.1. Quy trình áp dụng kỹ thuật QF – PCR: 53 4.2. Giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội 55 4.2.1. Trường hợp chẩn đoán khác nhau giữa Karyotyp và QF-PCR 55 4.2.2. Độ chính xác của QF-PCR trong chẩn đoán bất thường lệch bội NST 59 4.3. Số lượng marker cần sử dụ ng trong chẩn đoán các hội chứng lệch bội NST và việc sử dụng các extra marker. 60 4.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật QF – PCR 62 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC  DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Những dấu hiệu bất thường hay gặp trên siêu âm ba tháng giữa và các rối loạn NST tương ứng [19] 9 Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bất thường NST sử dụng QF – PCR [23] 20 Bảng 2.1: Các marker được sử dụng trong bộ kit Aneufast[12] 26 Bảng 2.2: Các marker được sử dụng trong từng lọ 28 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng 28 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR 29 Bảng 2.5. Hóa chất dùng cho 1 mẫu điện di 29 Bảng 2.6. Cách đọc kết quả tỉ lệ đỉnh [12] 30 Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32 Bảng 3.2. Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33 Bảng 3.3. Độ chính xác của kỹ thuật QF – PCR so với kỹ thuật di truyền tế bào 34 Bảng 3.4. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 21 35 Bảng 3.5. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 18 36 Bảng 3.6. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 13 37 Bảng 4.1. Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật QF – PCR [23] 60  DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Kết quả điện di huỳnh quang trên máy ABI 17 Hình 1.2. Hai alen đồng hợp tử 17 Hình 1.3. Hai alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1 18 Hình 1.4. 3 alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1:1 18 Hình 1.5. 3 alen dị hợp tử tỉ lệ 2:1 19 Hình 1.6. Ba alen đồng hợp tử 19 Hình 2.1. Kết quả đo nồng độ DNA bằng máy quang phổ Nanodrop 25 Hình 3.1. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 12 38 Hình 3.2. Kết quả Karyotyp bệnh nhân số 12 40 Hình 3.3. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41 Hình 3.4. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 21 42 Hình 3.5. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43 Hình 3.6. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 17 44 Hình 3.7. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45 Hình 3.8. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 11 46 Hình 3.9. Kế t quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47 Hình 3.10. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 13 48 Hình 3.11. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các marker thường dùng 49 Hình 3.12. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các extra marker trong lọ XY 50 Hình 3.13. Kết quả karyotyp của bệnh nhân số 27 52 Hình 4.1. Kết quả karyotyp mẫu bệnh nhân kết luận 46,XY 56 Hình 4.2. Kết quả QF-PCR của mẫu bệnh nhân karyotyp kết lu ận 46,XY 57 1  ĐẶT VẤN ĐỀ Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một trong những bất thường hay gặp ở thai nhi và trẻ sơ sinh, nhiều nghiên cứu thống kê đã xác định DTBS là một trong những nguyên nhân chính gây nên tử vong và bệnh tật của trẻ trong những năm đầu tiên của cuộc sống. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 3 - 4% tổng số trẻ được sinh ra bao gồm cả trẻ sống và trẻ chết lúc sinh [34]. Theo nghiên cứu của Phan Thị Hoan (2001) ở nhóm dân cư thuộc 4 tỉnh đồng bằng Sông Hồng cho thấy tỷ lệ DTBS chiếm 1,96% dân số điều tra [6]. Một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường gặp như: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwarrd và một số hội chứng bất thường NST giới như: Klinefelter, Tuner. Đa số trẻ sinh ra mắc những hội chứng này đều ảnh hưởng tới khả năng sống và sự hòa nhập cộng đồng. Hiện nay việc điều trị các bệnh di truyền còn gặp nhiều khó khăn, vì vậy phòng và hạn chế bệnh di truyền cho trẻ sinh ra là việc cấp thiết nhằm giảm bớt gánh nặng về kinh tế cũng như tâm lý cho gia đình và xã hội. Việc chẩn đ oán sớm các DTBS thời kỳ phôi thai là cần thiết để có các biện pháp xử lý phù hợp. Gần đây người ta phát hiện ra các trình tự lặp ngắn STR (short tandem repeat) có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên NST số 13, 18, 21, X, Y. Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di. Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường các NST nên phương pháp này có th ể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST một cách nhanh chóng và chính xác mà không cần phải nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật QF – PCR (quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại các STR. Đây là [...]... "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST" với 2 mục tiêu sau: 1 Ứng dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST 2 Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST 3   CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường số lượng... X,Y Trong thực tế lâm sàng, bất thường NST gặp ở 50% các trường hợp gây sẩy thai, 10% các trường hợp đẻ sống Trong đó các bất thường thường gặp và gây ảnh hưởng tới khả năng hòa nhập cộng đồng và trí tuệ của trẻ là các hội chứng Down, Patau, Edward, hội chứng Kilinefelter, hội chứng Tuner và hội chứng trisomy X 1.1.1 Hội chứng Down (Trisomy 21) [7][10] Là một trong những hội chứng rối loạn NST dạng lệch. .. đỉnh, số alen sẽ được xác định Do bất thường số alen tương ứng với các NST nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán bất thường NST 1 cách nhanh chóng và chính xác 1.3.4.2 Độ chính xác của kỹ thuật: Kết quả một số nghiên cứu ở bảng 1.2 cho thấy, 22504 mẫu ối đã được chẩn đoán xác định bằng karyotype được sử dụng để tiến hành kỹ thuật QFPCR Tỷ lệ phát hiện bất thường số lượng NST ở các NST lựa... 1.3.4 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử: Năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật QF – PCR (Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) để xác định bất thường số lượng NST Từ năm 1998 đến năm 2001 một số phòng thí nghiệm ở Anh và Châu Âu đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh bất thường số lượng NST 1.3.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật QF... nghén) 1.3.4.3 Vai trò của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh: Một số tác giả đề xuất QF - PCR phải được sử dụng như là xét nghiệm bổ sung cho xét nghiệm tế bào quy ước hoặc có thể trở thành một phương pháp lựa chọn trong chẩn đoán trước sinh trong tương lai đối với các bất thường NST trên các tế bào phôi phân lập từ máu mẹ Ưu điểm của kỹ thuật là cho kết quả nhanh trong khi chờ đợi kết quả... bào trước sinh sau khi sàng lọc dương tính đối với hội chứng Down bằng kỹ thuật QF - PCR Nhóm tác giả đưa ra những thuận lợi của kỹ thuật này rõ ràng vượt trội so với những nhược điểm Việc sử dụng kỹ thuật QF - PCR dẫn đến câu trả lời nhanh hơn, giá thành hạ hơn và cơn co thắt tử cung ít hơn so với kỹ thuật di truyền tế bào quy ước và là một kỹ thuật có độ chính xác cao trong chẩn đoán hay kiểm soát hội. .. và NST hiệu quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác Hiện nay ở Việt Nam, tại một số trung tâm lớn đã triển khai áp dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền Tuy nhiên chưa có đề tài nào đánh giá độ chính xác của kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh và chuẩn hóa quy trình để áp dụng vào điều kiện Việt Nam Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên. .. Trisomy 13 không sống được lâu, 90% bệnh nhân bị chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chu sinh 5   1.1.3 Hội chứng Edwards (Trisomy 18) [7] Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh ứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Đây là hội chứng do rối loạn NST ứng thứ 2 sau hội chứng Down Trẻ Trisomy 18 được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượng trung bình khoảng 2kg), trong khi thai... kỹ thuật FISH (Fluorescent in situ hybridization) đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới để xác định những bất thường NST, đặc biệt là những rối loạn nhỏ Đây là một kỹ thuật đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì nó có thể thực hiện trên nhân tế bào gian kì, không cần thời gian nuôi cấy, vì vậy cho kết quả sau một thời gian ngắn (24 - 48h), đáp ứng được yêu cầu cấp thiết của chẩn đoán trước. .. 29 marker trong đó: - 7 marker chẩn đoán cho NST 21: D21S1414, D21S1411, D21S1446, D21S1437, D21S1008, D21S1412, D21S1435 - 7 marker chẩn đoán cho NST 18: D18S391, D18S390, D18S535, D18S386, D18S858, D18S499, D18S1002 - 6 marker chẩn đoán cho NST 13: D13S631, D13S634, D13S258, D13S258, D13S305, D13S628, D13S742 - 9 marker chẩn đoán cho NST giới Trong đó có marker SRY chẩn đoán riêng cho NST Y, marker . thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST& quot; với 2 mục tiêu sau: 1. Ứng dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST. 2. Đánh. 1.1.4. Hội chứng Klinefelter (XXY) 6 1.1.5. Hội chứng XYY 6 1.1.6. Hội chứng Trisomy X (Hội chứng siêu nữ) 6 1.1.7. Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner) 7 1.2. Một số phương pháp sàng lọc trước. như: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwarrd và một số hội chứng bất thường NST giới như: Klinefelter, Tuner. Đa số trẻ sinh ra mắc những hội chứng này đều ảnh hưởng tới khả năng sống