bội NST và việc sử dụng các extra marker.
Bảng 4.1. Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật QF – PCR [23]
Nghiên cứu Số ca phân tích NST/Số marker
Số ca phát hiện Trisomy/số ca Trisomy thực tế Verna và cộng sự (1998) 2139 21/2 - 3 32/33 21/4 15/15 13/2 1/1 Pertl và cộng sự (1999) 247 18/3 4/5 21/2 - 4 189/189 13/2 - 4 32/32 Mann và cộng sự (2003) 5090 18/ 2 - 4 75/75 21/4 11/11 13/4 6/6 18/4 6/6 Quaife và cộng sự (2004) 1115 XY/4 13/13 Theo bảng trên, trong nghiên cứu của Verna và cộng sự (1998)[31] khi
khảo sát 2139 trường hợp có sử dụng 2 – 3 marker để chẩn đoán Trisomy 21 thì phát hiện được 32/33 trường hợp. Tương tự như vậy, Pertl và cộng sự
(1999)[26] khi nghiên cứu 247 trường hợp sử dụng 3 marker để chẩn đoán Trisomy 18 chỉ phát hiện 4/5 trường hợp. Như vậy, nếu chỉ sử dụng 2 – 3 marker vẫn chưa phát hiện hết các trường hợp lệch bội NST.
Đến nghiên cứu của Mann và cộng sự (2003), với cỡ mẫu 5090 và sử
100%. Năm 2004, khi khảo sát 1115 trường hợp, Quaife sử 4 marker để phát hiện các lệch bội NST và kết quả là không trường hợp nào chẩn đoán sai [27].
Nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng bộ kit của hãng AneufastTM cũng dùng 4 marker để chẩn đoán các lệch bội NST 21, 18, 13 và tỷ lệ chẩn đoán đúng mà chúng tôi thu được cũng là 100%, tương tự như các nghiên cứu nói trên.
Trường hợp trisomy 4 NST 13, 18, 21, X, việc chẩn đoán lệch bội ở
các NST thường không mấy khó khăn, nhưng để phát hiện lệch bội trên NST giới dạng XXX việc dùng 5 marker là chưa đủ vì thực chất chỉ có 3 marker có khả năng chẩn đoán được XXX là X22, DXYS218, HPRT , kết quả: chỉ xuất hiện 2 đỉnh có tỷ lệ 2:1 ở marker X22, do vậy chúng tôi phải sử dụng các extra marker đểđưa ra kết luận cuối cùng. Điều này cũng là 1 hạn chế của bộ
kit vì nếu số lượng marker giúp cho chẩn đoán XXX là 4 marker thì sẽ không phải chạy thêm các extra marker. Ngoài ra trong trường hợp có chẩn đoán khác nhau giữa QF-PCR và karyotyp chúng ta cũng nhận thấy chỉ có 1 marker chẩn đoán cho nhánh ngắn của NST X như vậy là không đủ để có thể
phát hiện những đột biến mất đoạn. Bộ kit Chromoquant mới nhất đã tăng số
marker chẩn đoán cho NST giới là 6 marker tuy nhiên cũng chỉ có 1 marker có thể chẩn đoán cho nhánh ngắn của NST X. Chúng tôi hi vọng trong tương lai có bộ kit mới sử dụng 6 marker cho NST giới và có 2 marker chẩn đoán cho nhánh ngắn NST X.
Trong bộ kit của hãng AneufastTM ngoài các marker thường dùng còn có thêm các extra marker tương ứng với từng NST khác nhau. Các extra marker thường được sử dụng trong các trường hợp sau:
- Các marker giúp chẩn đoán cho cùng 1 NST đều chỉ có 1 đỉnh duy nhất. - Các marker giúp chẩn đoán cho cùng 1 NST chỉ có 1 marker có tỷ lệ
bất thường.
- Một số marker không có tín hiệu hoặc tín hiệu thấp làm cho không đủ điều kiện kết luận.
4.4. Một sốưu điểm và hạn chế của kỹ thuật QF – PCR:
¾ Ưu điểm:
- Cho phép rút gọn thời gian của một xét nghiệm xuống còn khoảng 5 h sau khi lấy mẫu. Đồng thời có thể xác định nhiều hội chứng liên quan đến bất thường NST thường gặp.
- Phương pháp này không đòi hỏi nuôi cấy tế bào nên không cần mẫu tươi hay vô khuẩn, thậm chí có thể phân tích đối với các mẫu DNA đã bị đứt gãy như các mẫu máu khô, DNA nằm ngoài tế bào…
- Giá thành xét nghiệm thấp hơn phương pháp FISH đang được áp dụng, điều này giúp đáp ứng nhu cầu xét nghiệm sàng lọc hội chứng bất thường số lượng NST của đại đa số thai phụ có nguy cơ cao sinh con dị tật,
đặc biệt là trong điều kiện kinh tế còn chậm phát triển như nước ta.
- Ngoài ra, do đặc điểm về quy trình của phương pháp này nên có thể
triển khai trên quy mô lớn, với số lượng mẫu nhiều mà không cần nhiều nhân lực. Đây là một hạn chế rất khó khắc phục của của phương pháp chẩn đoán các hội chứng lệch bội NST theo phương pháp di truyền tế bào truyền thống.
¾ Hạn chế:
- Không phát hiện được các trường hợp bất thường cấu trúc NST. - Không phát hiện được thể khảm.
- Kết quả sẽ bị sai lệch nếu mẫu dịch ối lẫn tế bào máu mẹ.
- Không thể cùng một lúc khảo sát được 23 cặp NST như phương pháp di truyền tế bào.
- Không phải cơ sở y tế nào cũng trang bị được máy PCR và máy điện di mao quản.
KẾT LUẬN
1. Ứng dụng thành công kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số
lệch bội NST tại Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội .
2. Giá trị của kỹ thuật QF – PCR trong chẩn đoán lệch bội NST thai:
Sử dụng kỹ thuật QF – PCR cho kết quả chẩn đoán tương đương như
sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào với độ chính xác là 100% đối với các hội chứng bất thường về số lượng NST: phát hiện được 16 mẫu Trisomy 21; 8 mẫu Trisomy 18; 2 mẫu Trisomy 13; 1 mẫu monosomy X và 1 mẫu trisomi 4 NST 21,13,18, X.
Cùng với siêu âm, karyotyp phát hiện được 1 mẫu có mất đoạn nhánh ngắn NST X.
KIẾN NGHỊ
1. Với rất nhiều ưu điểm, kỹ thuật QF – PCR nên được triển khai tại các cơ sở nghiên cứu cũng như các bệnh viện, góp phần chẩn đoán trước sinh sớm và chính xác, góp phần giảm tỷ lệ sinh con dị tật, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.
2. Tiếp tục nghiên cứu đồng thời khắc phục các hạn chế còn tồn tại, để
kỹ thuật QF – PCR có thểứng dụng ngày càng rộng rãi và dễ dàng hơn trong chẩn đoán trước sinh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Duy Bắc và cộng sự (2010), “Nghiên cứu áp dụng kĩ thuật QF- PCR trong chẩn đoán một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể”, Hội nghị sinh học phân tử và hóa sinh toàn quốc lần thứ 2, tr. 160-165.
2. Trần Danh Cường (2006), “Một số nhận xét về dấu hiệu gợi ý của siêu âm ở những trường hợp thai nhi có bất thường nhiễm sắc thể”, Hội nghị
khoa học chuyên đề chẩn đoán trước sinh, Sở y tế Hà Nội.
3. Trần Danh Cường (2009),“Một số nhận xét về kết quả chọc hút nược ối trong chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Phụ sản trung ương”, Hội nghi sản khoa Việt Pháp, tr. 287-331.
4. Phan Trường Duyệt (2007), “Kỹ thuật siêu âm và ứng dụng trong sản khoa”, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 12-18, 31-34.
5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), “Sinh học phân tử”, Nhà xuất bản giáo dục 2002, tr. 153- 159.
6. Phan Thị Hoan (2001), “Nghiên cứu tần suất và tính chất di truyền của một số dị tật bẩm sinh ở một số nhóm dân cư miền bắc Việt Nam”, Luận án tiến sỹ Y học, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
7. Phạm Thành Hồ (2001), “Di truyền học”, Nhà xuất bản giáo dục.
8. Hoàng Thị Ngọc Lan, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2007) “Sàng lọc thai hội chứng Down bằng định lượng AFP, βhCG ở huyết thanh mẹ” Tạp chí nghiên cứu y học số 1–2007.
9. Hoàng Thu Lan (2004), “Hoàn chỉnh kĩ thuật lai tại chỗ huỳnh quang và bước đầu ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down”, Luận văn thạc sĩ y học , Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
10. Nguyễn Văn Rực (2004), “Nghiên cứu đặc điểm Karyotyp, kiểu hình của trẻ Down và Karyotyp của bố mẹ”, Luận án tiến sỹ y học, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.
11. Đỗ Thị Thanh Thủy (2005), “Khảo sát giá trị trung vị của alpha- fetoprotein (AFP) trong huyết thanh của thai phụở 3 tháng giữa thai kỳ”.
TIẾNG ANH
12. Aneufast user's manual revised july 2007, “Multiplex QF-PCR kit for rapid diagnosis of trisomi 21, 13, 18 and sex chromosomes aneuploidies”.
13. Aiken D.A., Newby D. (2000), “Placental synthesis of oestriol in Down syndrome pregnancies”, Placenta 2000 Mar-Apr, UK; 21(2-3), pp.263-267. 14. Cuckle H.S., Canick J.A., Kellner L.H. (1999) “On behalf of the
Collaborative Study group. Collaborative study of maternal urine β-core hCG screening for Down’ syndrome” Prenatal Diagnosis, 19, pp.911-917. 15. Daniel G., Finning K. et al (2009), “Non invasive prenatal diagnosis of
fetal blood group phenotypes: prenatal diagnosis, Vol 29, pp.101-107. 16. DRG instruments GmbH Germany: Estriol. ELISA test for the
Quantitative determination of free estriol in Human Serum or Plasma. Cat No 55 040.
17. Elisabeth S.B. (1994), “Characterization of extra structurally abnormal chromosome by in situ hybridization”, Stockholm 1994.
18. Fariana A., Leshane E.S.et al (2003), “Evaluation of cell-free fetal DNA as a second-trimester maternal serum marker of Down syndrome pregnancy”, Clin Chem, Vol. 49, pp.239-242.
19. Gravholt H. C., Fedder J. et al (2000), “Occurrence of gonadoblastoma in females with Turner syndrome and Y chromosome material; a population study”, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol.85(9), pp.3199-3202.
20. Hamerton J.L. (1971), “Human cytogenetics”, New York and London, Academic Press, Vol 2.
21. Hewitt SC., Koarach KS. (2002), “Estrogen veceptors: structure, mechanisms and function”, Review in Endocrin & metabolic disorders, Vol.3, pp.192-200.
22. Hirschhorn K. (1993), “Chromosome identification”, Annual review of medicine , Vol 24, pp.67-74.
23. Human Reproduction Update, Vol.10, (2004),“The introduction of QF – PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration”, pp. 541 – 548.
24. Jeffrey A., Kuller., M.D., Nancy C.et al(1996) “Prenantal diagnosis and Reproductive genetics” Chapter 4,pp. 11, 12, 15, 18, 19.
25. Leung W.C., Lau J.K. et al(2009), “Guideline for Amniocentesis and Chorionic Villus Sampling(CVS)” The HongKong college of obstetricians and gynaecologists, A Foundation college of Hong Kong Academy of medicine, pp.1-8
26. Pertl B., Kopp S., Kroisel P.M., Tului L., Brambati B. and Adinolfi M. (1999a) “Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples”, J MedGenet 36, pp.300-303.
27. Quaife R., Wong L.F., Tan S.Y., Chua W.Y., Lim S.S., Hammersley C.J.N., Lee H.L. and Yeo H.L. (2004) “QF-PCR based prenatal detection of aneuploidy in a southeast Asian population”, Prenat Diagn 24, pp. 407-413.
28. Svetlana D.P. et al (1999), “Constitutional von Hippel-Lindau (VHL) gene deletions detected in VHL families by Flurescence in situ hybridization”, Cancer Research 59 ,pp. 5560-5564.
29. Zoltan Papp (1990) “Obstetric Genetics”. Akademiai kiado Budpest Chapter 20,pp. 21, 60.
30. Valdehi J., Kalol K.R., Kiran K. (2002), “Prenatal detection of aneuploidies using fluorescence in situ hybridization for the most common reciprocal translocation t(11;22)” , Mol Hum Reprod.1999, pp.682-690.
31. Verma L., Macdonald F., Leedham P., Dhanjal S. and Hulten M. (1998) Rapid and simple DNA diagnosis of Down syndrome. Lancet 352, pp. 9-12.
32. Yan J., Guilbault E., Masse J.et al (2000), “Optimization of the flurescence in situ hybridization (FISH) tech for high detection efficiency of very small proportions target interphase nucleic”, Clin Genet 2000, pp. 309-318.
33. Wolff D.J., Dyke D.L.V et al (2010), “Laboratory guideline for Turner syndrome”, Genetics in Medecine, American collage of Medical Gentics, pp.52-55.
34. WHO (2003) “The development of registries to support birth defect research” Report of a WHO Registry Meeting on Craniofacial Anomalies.
PHỤ LỤC
Kỹ thuật chọc hút nước ối
¾ Quy trình chọc hút nước ối
- Phỏng vấn làm hồ sơ
- Làm xét nghiệm cần thiết
- Tư vấn cho cả 2 vợ chồng về lợi ích cũng như các tai biến khi chọc ối - Hướng dẫn 2 vợ chồng ký chấp nhận tất cả các rủi ro của chọc hút ối
¾ Chỉđịnh chọc hút ối
- Tuổi mẹ cao (> 35 hoặc 38)
- Test sàng lọc dương tính (>1/250)
- Có bất thường hình thái phát hiện trên siêu âm - Tăng khoảng sáng sau gáy (>3,0mm)
- Tiền sửđẻ con mắc hội chứng Down hay con chết do một số bệnh lý di truyền khác
- Có thể phối hợp nhiều chỉ định trên một bệnh nhân
¾ Tuổi thai có thể thực hiện chọc hút ối
Chọc hút nước ối trong chẩn đoán trước sinh có thểđược làm vào 3 thời kỳ: - Chọc hút nước ối sớm được thực hiện vào tuổi thai: 13-15 tuần
- Chọc hút nước ối kinh điển được thực hiện vào tuổi thai: 16-20 tuần,
đây là thời kỳ lý tưởng cho việc thực hiện kỹ thuật cũng như trong việc nuôi cấy tế bào ối, tỷ lệ biến chứng cho mẹ và thai cũng thấp nhất. - Chọc hút nước ối muộn được làm vào tuổi thai sau tuần 20. Đây là thời kỳ
mà việc chọc hút nước ối được làm ngay sau khi siêu âm phát hiện các bất thường về hình thái thai nhi, tuy nhiên tuổi thai càng lớn thì việc nuôi cấy tế bào ối càng khó khăn, tỷ lệ nuôi cấy thất bại sẽ cao hơn.
¾ Kỹ thuật tiến hành chọc hút ối:
- Chọc hút ối phải được tiến hành trong bệnh viện và chỗ dành riêng cho việc tiến hành thủ thuật, trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.
- Sản phụ phải được làm các xét nghiệm về máu và nước tiểu.
- Hẹn ngày giờ đến Trung tâm Chẩn đoán trước sinh để làm các thủ tục cần thiết để tiến hành thủ thuật.
¾ Chuẩn bị người làm:
Chuẩn bị tương tự như làm một cuộc phẫu thuật có rửa tay, mặc áo môt, đi găng vô trùng.
Thiết bị:
- Phòng chọc ối là phòng thủ thuật (phòng riêng càng tốt). - Máy siêu âm có đầu dò thành bụng.
- Chất sát trùng thành bụng trong phẫu thuật. - Săng vô trùng.
- Túi ni lông vô trùng để bảo vệđầu dò. - Gel siêu âm
- Túi đựng bệnh phẩm.
- Hai bơm tiêm sử dụng 1 lần: 5ml, 20ml
- Kim chọc ối (có thể là kim chọc dò tủy sống), kích cỡ 20 Gauge: 0,8mm đường kính và chiều dài 9cm, hoặc kim chọc ối riêng để chọc
ối: 0,8mm đường kính và chiều dài 9,12,15 cm. - Lọđựng nước ối có ghi tên tuổi bệnh nhân.
¾ Chọn vị trí chọc kim trên thành bụng và tiến hành thủ thuật
- Sử dụng kim chọc hút nước ối loại 20 Gauge (đường kính 0,8mm, dài 9cm). - Vị trí chọc kim trên thành bụng nên chọn về gần đường trắng giữa dưới
rốn và tránh vị trí rau bám. - Không nên chọc qua bánh rau.
- Không nên chọc kim ra 2 bên thành tử cung để tránh gây tổn thương bó mạch tử cung.
- Không nên chọc kim thấp về phía xương mu tránh chọc qua bàng quang của mẹ.
- Gây tê tại chỗ bằng lidocaine
- Siêu âm trước khi chọc ối để xác định thai còn sống, xác định vị trí bánh rau và khẳng định chắc chắn kim đã chọc vào buồng ối.
- Sau khi xác định được kim đã nằm trong buồng ối, tiến hành lắp bơm tiêm vào và hút nước ối.
- Lượng nước ối được lấy theo tuổi thai: 1ml/1 tuần tuổi thai cho tuổi thai dưới 15 tuần, Còn trung bình lấy 20ml.
- Nước ối được đựng vào ống đặc biệt sau đó gửi đến phòng thí nghiệm
để nuôi cấy.
DANH SÁCH BỆNH NHÂN LÀM QF-PCR 1. TẠ THÙY CH 2. HOÀNG THU H 3. CHU THỊ D 4. BÙI THỊ M 5. NGUYỄN THỊ NGH 6. NGUYỄN THANH PH 7. TRẦN NAM D 8. TRIỆU NHƯ QU 9. VŨ THỊ NG 10. HOÀNG THỊ HOÀI PH 11. VŨ THỊ TR 12. VŨ THỊ THANH H 13. NGUYỄN THỊ V 14. NGUYỄN THỊ PH 15. NGUYỄN THỊ THU H 16. PHAN THANH H 17. TRẦN LAN H 18.TRỊNH HỒNG NH 19. TRƯƠNG THỊ NGỌC L 20. NGUYỄN THỊ H 21. VŨ THỊ L 22. KHỔNG THỊ L 23. ĐINH THỊ THU H 24. LÊ THỊ VÂN A 25. ĐỖ THỊ TH 26. BÙI THỊ LỆ H 27. NGUYỄN MINH H 28. HOÀNG THỊ MINH H 29. PHẠM THANH H 30. NGUYỄN THỊ H 31. HỒ PHƯƠNG TH
XÁC NHẬN CỦA BỘ MÔN XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN