Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh leptospirosis ở lợn tại đắk lắk và bình định

Đặc biệt bệnh Leptospirosis một bệnh cũ nhưng mà mới cơ chế gây bệnh và sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể vật chủ của Leptospira đến nay vẫn chưa được làm rõ.. Một số ưu điểm của

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng thực tập tại Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y

miền Trung, dưới sự hướng dẫn của thầy TS Võ Thành Thìn và ThS Nguyễn

Thị Kim Cúc cùng các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y

miền Trung và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường đại học Nha Trang tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này

Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS Võ Thành Thìn - phó Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và ThS

Nguyễn Thị Kim Cúc – giảng viên Bộ môn công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ

Sinh học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình

Tôi cũng xin chân thành cản ơn ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua Cảm ơn cô Ths Khúc Thị An – Trưởng Bộ môn công nghệ sinh học,

đã giúp đỡ tôi hoàn thành một số giấy tờ của luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Trung Hiếu, các anh chị trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi hoàn thiện về một số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Trần Minh Tùng, Đoàn Văn Tiến và Lại Nhật Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, nhóm học tập “WAO”, cùng toàn thể bạn bè thân thiết đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu

Nha Trang, tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Võ Lê Chi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI NÓI ĐẦU 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ LEPTOSPIRA 3

1.1.1 Phân loại Leptospira 3

1.1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.1.2 Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên 3

1.1.2 Các đặc điểm sinh học của Leptospira 5

1.1.2.1 Đặc điểm cấu tạo 5

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của Leptospira 6

1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 6

1.1.2.4 Sức đề kháng của Leptospira 7

1.1.2.5 Một số yếu tố độc lực của Leptospira 7

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA LEPTOSPIRA 9

1.2.1 Vật mang mầm bệnh 9

1.2.2 Con đường lây nhiễm của bệnh Leptospirosis 10

1.2.3 Cơ chế sinh bệnh 12

1.2.4 Một số đặc điểm bệnh học và lâm sàn của bệnh Leptospirosis ở lợn và người 13

1.2.4.1 Bệnh Leptospirosis ở lợn 13

1.2.4.2 Bệnh Leptospirosis ở người 14

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH LEPTOSPIROSIS 15

1.3.1 Chẩn đoán vi khuẩn học 15

1.3.2 Chẩn đoán huyết thanh học 17

1.3.3 Sử dụng phương pháp sinh học phân tử 17

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM 18

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Thời gian cứu 19

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 19

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Vật liệu 19

2.2.2 Môi trường, hóa chất 19

2.2.3 Kháng nguyên chuẩn 20

2.2.4 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.3.2 Phương pháp phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm 23

2.3.2.1 Chiết tách DNA 24

2.3.2.2 Chuẩn hóa phản ứng PCR 27

2.3.2.3 Phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm 31

2.3.2.4 Phương pháp điện di 32

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 CHUẨN HÓA PHẢN ỨNG PCR 34

3.1.1 Xác nhận giá trị của phương pháp PCR 34

3.1.2 Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng 34

3.1.3 Kết quả xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR 36

3.2 KẾT QUẢ PCR TRÊN MẪU DNA 38

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 KẾT LUẬN 43

4.2 KIẾN NGHỊ 43

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số serogroup thường gặp của các loài Leptospira 3

Bảng 2.1 Danh sách các serovar Leptospira dùng trong chuẩn hóa PCR 20

Bảng 2.2 Kết quả thu mẫu bệnh phẩm thận lợn 23

Bảng 2.3 Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 30

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 30

Bảng 2.5 Bảng kết quả số liệu sau khi chạy PCR 33

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng PCR 35

Bảng 3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR 36

Bảng 1 Kết quả sử dụng hàm CHITEST xác định sự có nghĩa của kết quả thống kê 51

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Hình Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dưới kính hiển vi điện tử

6

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thực hiện để phát hiện bệnh Leptospirosis ở lợn 23

Hình 2.2 Nguyên lý phản ứng PCR 28

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31

Hình 3.1 Sản phẩm phản ứng PCR trên thạch agarose 34

Hình 3.2 Sản phẩm phản ứng PCR xác định giới hạn nồng độ DNA 35

Hình 3.3 Sản phẩm phản ứng PCR xác định tính đặc hiệu 37

Hình 3.4 Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại Buôn Hồ - Đắk Lắk 39

Hình 3.5 Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại Phù Cát – Bình Định 40

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

LPS : Lipopolysaccharide

MAT : Microscopic Agglutination Test

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

VNRT : Variable Number of Tandem Repeats

EMJH : Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IF : Immuno Fluorescence

PCR: Polymerase Chain Reaction

LỜI NÓI ĐẦU

Tình hình chăn nuôi gia súc năm 2011 và đầu năm 2012 tương đối ổn định, nhưng cũng đã đối mặt với nhiều dịnh bệnh cũ và mới như heo tai xanh, lở mồm

long móng, tiêu chảy ở đàn gia súc Đặc biệt bệnh Leptospirosis một bệnh cũ nhưng

mà mới (cơ chế gây bệnh và sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể vật chủ của

Leptospira đến nay vẫn chưa được làm rõ) Với nhiều chủng huyết thanh khác nhau, thì xoắn khuẩn Leptospira đã gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc, vật nuôi và kể cả

con người Ở mỗi loài gia súc khác nhau đều có thể mắc một hay nhiều serotype

khác nhau Leptospira gây bệnh trên động vật mà không biểu hiện triệu chứng lâm

sàng được gọi là động vật mang trùng Những động vật mang trùng, chúng không

thể hiện triệu chứng lâm sàng nhưng mang một lượng lớn Leptospira trong thận và

thải ra ngoài qua nước tiểu – đây là nguồn lây nhiễm mầm bệnh rất nguy hiểm cho người và động vật nuôi

Với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt hơi xuất chuồng ước tính đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], như vậy đàn lợn là nguồn cung cấp thịt chủ yếu nhất cho thị trường cả nước Nhưng trên lợn bệnh Leptospirosis đã tồn tại trên mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát được các nguồn lây nhiễm

Hơn nữa, cấu trúc phân tử cũng như cơ sở di truyền phân tử của Leptospira vẫn còn

trong quá trình nghiên cứu, thì bệnh Leptospirosis vẫn đang là một vấn đề nan giải Lợn là đông vật mang trùng serovar Ponoma, Tarassovi, nên rất dễ lây truyền Xoắn khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô

hấp, đường tiêu hóa Chỉ với một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào

cơ thể sẽ gây ra mẫm cảm

Động vật và người mắc bệnh Leptospirosis thường rất ít thể hiện triệu chứng

và triệu chứng có thể biểu hiện khác nhau ở từng cá thể Vì thế, việc chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết Một trong những phương pháp sử

dụng phổ biến là phát hiện kháng thể kháng Leptospira đặc hiệu trong huyết thanh

bằng phản ứng vi ngưng kết tan trên phiến kính (MAT – microscopic agglutination

test) Ngoài ra có thể phát hiện kháng thể bằng phản ứng ngăn trở gián tiếp hồng

cầu, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Leptospira có thể phân lập

trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm hoặc phát hiện bằng kính hiển vi nền đen, nhuộm miễn dịch Một số kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại khác cũng đã được ứng dụng để

chẩn đoán Leptospira như RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),

VNRT (Variable Number of Tandem Repeats), giải trình tự gen 16S Hiện nay, kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi

để chẩn đoán bệnh do Leptospira gây ra Một số ưu điểm của kỹ thuật PCR trong

chẩn đoán bệnh là PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cao, PCR chẳng những có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy

vi khuẩn, dễ thực hiện, nhanh cho kết quả Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng

Như vậy nhằm chuẩn hóa kỹ thuật PCR để phát hiện và thống kê tỷ lệ nhiễm

bệnh Leptospirosis ở lợn nên chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR

để chẩn đoán bệnh Leptospirosis ở lợn tại Đắk Lắk và Bình Định” với một số nội

dung sau:

- Chuẩn hóa phản ứng PCR để phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm

thận lợn

- Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh Leptospirosis

- Thống kê tỷ lệ nhiễm bệnh Leptospirosis ở lợn thịt trên địa bàn Đắk Lắk và

Bình Định

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ LEPTOSPIRA

1.1.1 Phân loại Leptospira

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Về phân loại khoa học Leptospira được xếp vào:

Giới:Monera

Ngành: Spirochaetes

Họ: Leptospiraceae

Giống: Leptospira [43]

Các loài gồm có L alexanderi, L biflexa, L broomii, L borgpetersenii,

L fainei, L inadai, L interrogans, L kirschneri, L licerasiae, L meyeri,

L weilii, L noguchii, L santarosai, L wolbachii, L kmetyi, L wolffii,

L genomospecies 1, L genomospecies 3, L genomospecies 4, L genomospecies 5 . Trong đó, loài L interrogans và L fiainei được xem là có động lực cao nhất

trên người và động vật [51], [45], [9]

1.1.1.2 Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên

Dựa vào cấu trúc đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên

bề mặt tế bào và cấu trúc di truyền của Leptospira, có hơn 260 serovar khác nhau đã

được xác định Các serovar này lại thuộc các serogroup khác nhau, trong đó có nhiều serovar gây bệnh cho vật nuôi [34]

Bảng 1.1 Một số serogroup thường gặp của các loài Leptospira [34]

1 L interrogans

Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman, Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Luoisiana, Mini, Sarmin, Panama, Cynopteri, Tarassovi, Ballum, Celledoni, Manhao, Shermani, Hurstbrige

2 L noguchii Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Tarassovi, Bataviae,

4 L meyeri Ranarum, Semaranga, Sejroe, Mini, Javanica

13 L alexanderi Manhao, Hebdomadis, Javanica, Mini

Các serovar gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ yếu gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona ở lợn [11], [15], [22], [26] Bên cạnh đấy, có rất nhiều serovar khác có thể gây bệnh ở vật nuôi như ở lợn là Grippotyphosa, Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae; ở bò là Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola; ở chó là Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Copenhageni; ở ngựa là Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Hardjo; ở cừu là Pomona và Hardjo (bảng 1.2) [47], [23], [34], [9]

Bảng 1.2 Một số serovar thường gặp gây bệnh ở vật nuôi [47], [23], [34], [9]

1 Bò Hardjo, Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe,

Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola

2 Lợn Bratislava, Australis, Pomona, Grippotyphosa,

Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae

3 Chó Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae,

Pomona, Copenhageni

Icterohaemorrhagiae, Hardjo

1.1.2 Các đặc điểm sinh học của Leptospira

1.1.2.1 Đặc điểm cấu tạo

Xoắn khuẩn Leptospira có cấu trúc màng tế bào 2 lớp Trong đó, lớp màng

cytoplasmic và peptidoglycan liên kết chặt chẽ với nhau và được che phủ bởi lớp màng bao gồm protein, lipid và LPS (lipoplysaccharide) [27] Lớp

lipopolysaccharide của Leptospira có thành phần tương đối giống ở vi khuẩn gram

âm tuy nhiên có độc tính thấp hơn [34] Genome của Leptospira có kích thước

khoảng 5000kb và chia thành 2 phần là 4400kb choromosome và 350kb chromosome; xoắn khuẩn có 2 hệ gene 16s và 23rRNA [25], [12] Một số gene của

Leptospira đã được dòng hóa và phân tích chức năng như gene quy định quá trình

tổng hợp acid amin, rRNA, protein ở ribosome, RNA-polymerase, DNA repair, heat shock protein, shingomyelinase, hemolysins, protein màng ngoài, quá trình sinh tổng hợp LPS [34], [9]

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của Leptospira

Leptospira có dạng hình xoắn khuẩn, đường kính khoảng 0,1µm, dài 6-20µm

biên độ xoắn khuẩn khoảng 0,1 – 0,15µm, chiều dài lượn sóng khoảng 0,5µm [23]

Hai đầu xoắn hoặc hình móc câu Leptospira có khả năng di động do cấu tạo ở mỗi

đầu có một nội roi (endoflagelle), được đính vào giữa màng ngoài và màng trong của vi khuẩn [20] Các phương pháp nhuộm cổ điển như phương pháp nhuộm

Gram không dùng được cho Leptospira mặc dù chúng có cấu trúc rất gần với vi khuẩn gram âm Có thể quan sát Leptospira dưới kính hiển vi quang học nền đen, hoặc nhuộm thấm bạc cổ điển như phương pháp Warthin – Starry

Hình 1.1 Hình Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dưới kính hiển vi điện tử

(Courtesy of Rod Weyant, Centers for Control and Prevention) [23]

1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Leptospira phát triển tốt trong môi trường đặc hiệu hiếu khí bắt buộc (có chứa

vitamin B2, B12, axit béo mạch dài, muối amonium), nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 28-300C Thời gian của một thế hệ từ 3-15 giờ, do đó cho thời gian nuôi cấy và phân lập đôi khi rất lâu, từ 2 đến 30 ngày Độ pH tối ưu cho sinh trưởng là từ 7,2

đến 7,6 [23] Có rất nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy Leptospira đã

được mô tả Tuy nhiên, sử dụng phổ biến nhất hiện nay là EMJH (Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris) với thành phần chính là acid oleic, albumin huyết thanh

bò và polysorbate (Tween 80) [34] Một vài chủng Leptospira cần bổ sung pyruvate hoặc huyết thanh thỏ và môi trường khi nuôi cấy Khi phân lập Leptospira từ mẫu

bệnh phẩm, có thể bổ sung kháng sinh vào môi trường như 5 – fluorouracil, gentamincin, nalidixic acid hoặc rifampicin [23]

vi khuẩn có khả năng tồn tại trong một thời gian dài có khi tới hàng năm [24]

Với ánh sáng: dưới ánh sáng chiếu trực tiếp, xoắn khuẩn chết trong vòng 30 phút đến 2 giờ, với tia tử ngoại phải sau 4 giờ xoắn khuẩn mới bị tiêu diệt hoàn toàn [15]

Với các chất kháng sinh: các xoắn khuẩn mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh như penicillin, amoxicillin, ampicillin

Với hoá chất và thuốc sát trùng: Leptospira bị tiêu diệt nhanh chóng bởi hoá

chất như: dung dịch xút 5%, cồn 20%, dung dịch phenol 0,5%, axit chlohydric 2%, crezyl 5%, formol 0,25%, axit phenic 5%

1.1.2.5 Một số yếu tố độc lực của Leptospira

Các chủng Leptospira có độc lực cao có khả năng đề kháng với bổ thể và bạch

cầu trung tính của hệ thống đáp ứng miễm dịch không đặc hiệu của vật chủ, chúng chỉ bị tiêu diệt nhanh bởi kháng thể đặc hiệu có trong máu [21]

Có rất nhiều yếu tố độc lực của Leptospira đã được xác định Theo Merien và cs., (1997), khả năng gây bệnh của Leptospira xâm nhiễm vào tế bào Vero và làm

giảm khả năng tiêu diệt tế bào lạ của đại thực bào liên quan mật thiết đến độc lực của chúng [38] Năm 2000, Merien và cs., đã tìm thấy một loại protein có trọng lượng phân tử là 36KDa (fibronectin binding protein) liên quan đến yếu tố độc lực

này Protein này chỉ được tìm thấy trên các chủng Leptospira có độc lực của serovar

Icterohaemorrhagiae và không có mặt ở các chủng không có độc lực và những chủng hoại sinh (saprophyte strain) [39]

LPS của Leptospira có thành phần hóa học và đặc tính kích thích miễn dịch

giống vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, độc tính của chúng trên thỏ, trên chuột, tương tác với tế bào lympho B yếu hơn so với LPS của vi khuẩn gram âm [46], [53]

Khả năng dung huyết của Leptospira có ở nhiều serovar khác nhau và có ít nhất 7 gene sphA-like được phát hiện ở các chủng Leptospira có độc lực, bao gồm

cả gene sphH [19]

Năm 2007, Ristow và cs., đã xác định được lipoprotein bề mặt Loa22 của

Leptospira Tác giả đã gây đột biến gene mã hóa cho Loa22 của chủng Leptospira

có độc lực, sau đó gây nhiễm cho chuột Kết quả cho thấy chủng Leptospira này bị

mất độc lực [48] Gầm đây, Murray và cs (2009), đã phát hiện gene hemO mã hóa

cho enzyme cũng có vai trò trong quá trình gây bệnh của Leptospira [41]

Protein bề mặt Lip32 của Leptospira có khả năng bám lên lamini, collagen và fibronectin của vật chủ [32], [29] LipL32 có tính bảo toàn cao ở các loài Leptospira

gây bệnh Cũng giống như protein giải phóng bề mặt (Lig – protein có khả năng bám lên fibronectin của vật chủ), LipL32 chỉ giải phóng mạnh trên bề mặt khi

Leptospira nhân lên trong cơ thể vật chủ, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo LipL32 chỉ được giải phóng rất ít – đây cũng là nguyên nhân giải thích tại sao Leptospira

thường mất khả năng gây bệnh mặc dù cấu trúc kháng nguyên không thay đổi khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo [37], [42]

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA LEPTOSPIRA

1.2.1 Vật mang mầm bệnh

Mầm bệnh Leptospira tồn tại trong cơ thể gia súc bệnh, và những động vật

mang trùng khác, đáng chú ý nhất là chuột (Mus musculus, Rattus norvegicus, và R.rattus) Chúng là những loài sống khá gần gũi với con người và có mặt ở khắp mọi nơi, từ các chuồng trại chăn nuôi gia súc cho đến cả nơi ở của người, đặc biệt là những nơi có điều kiện vệ sinh kém Chuột có thể lưu giữ một hoặc nhiều serovar

Leptospira khác nhau như Ballum, Icterohaemorrhagiae ở chuột nhắt và

Copenhageni ở chuột cống [14]

Các vật mang trùng gây bệnh chính đứng đầu là loài gặm nhấm, trong đó chuột

mà thận bị nhiễm trùng mãn tính và chuột thải mầm bệnh ra môi trường bằng nước tiểu Tất cả loài có vú khác, hoang dã cũng như vật nuôi, cũng có thể là vật mang

trùng Leptospira, đó là những vật mang trùng rất khác nhau Các động vật này cho

cư trú và dữ trự ở trong thận các chủng huyết thanh đặc biệt đáp ứng gây bệnh

Chúng ít nhạy cảm với Leptospira và có xu hướng không gây bệnh nên chỉ làm phát triển một thể mạn tính Trong chu kỳ của bệnh Leptospirosis, sự đào thải Leptospira

từ thận cũng là một yếu tố chủ chốt làm chúng tồn tại trong môi trường và làm ô nhiễm đất và nước Nước nhiễm trùng là một nguồn bệnh gián tiếp rất quan trọng cho người và động vật [23]

Thời gian mang xoắn khuẩn và bài xuất mầm bệnh ra ngoài tùy thuộc vào loài

vật mang trùng, mùa vụ, thói quen sinh hoạt và các Serovar Leptospira khác nhau

như: Trâu, bò 120 ngày, lợn 300 ngày và chó 700 ngày Mầm bệnh tồn tại lâu trong đất, nước, phân, rác, chất thải là nguy cơ gây bệnh, phát dịch bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi [8]

Các động vật bị nhiễm Leptospira đều có thể trở thành vật mang trùng ẩn tính, chúng ít mẫn cảm với Leptospira và lưu giữ mầm bệnh ở ống thận, cho phép Leptospira phát triển và sau đó đào thải ra môi trường qua nước tiểu [34]

Sự đào thải Leptospira từ thận là một trong những yếu tố quan trọng giúp

chúng tồn tại trong môi trường và làm ô nhiễm đất và nguồn nước, đây là nguồn truyền bệnh gián tiếp cho người và động vật

Leptospira có thể tồn tại trong nước, sông suối, những vùng đất kiềm [23],

trong ao hồ, sông ngòi và đầm lầy [30]

1.2.2 Con đường lây nhiễm của bệnh Leptospirosis

Từ các nguồn nhiễm khuẩn, xoắn khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể người và vật nuôi qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô hấp, đường tiêu hóa

(hình 1.2) Chỉ cần một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ gây được bệnh ở động vật mẫm cảm [23] Leptospira xâm nhập vào cơ thể chủ yếu

qua niêm mạc đường tiêu hóa, niêm mạc mắt và qua vùng da bị thương [15]

Leptospira cũng có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua vật chủ trung gian như các

loài hút máu (ve, mòng, đỉa…) hút máu gia súc bệnh truyền cho gia súc khỏe

Hình 1.2 Nguồn lây nhiễm mầm bệnh Leptospirosis [23]

Leptospira xâm nhập vào gia súc khỏe thông qua đường giao phối; Nếu con đực (hoặc cái) nhiễm Leptospira sẽ truyền trực tiếp mầm bệnh qua giao phối trực

tiếp hoặc thụ tinh nhân tạo Gia súc mẹ bị bệnh có thể truyền cho con qua nhau thai, sữa mẹ, làm gia súc mới sơ sinh đã bị mắc bệnh [28]

Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi Phần lớn, xảy ra do tính chất nghề nghiệp phải tiếp xúc thường xuyên như làm đồng án, nạo vét cầu cống, vệ sinh chuồng súc vật Tuy nhiên, cũng có những trường hợp dân thành phố cũng mắc bệnh do du lịch sinh thái

về các vùng nông thôn, tắm sông, suối, ao hồ, cắm trại Ở nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng như bộ đội, công nhân địa chất, lâm nghiệp, công nhân chăn nuôi và nông dân [55] Những người làm việc thường xuyên tiếp xúc với nguồn bệnh như: cán bộ thú y, công nhân Nông – Lâm trường, công nhân giết mổ,

chế biến thực phẩm…cũng rất dễ bị xoắn khuẩn Leptospira xâm nhập và gây bệnh

qua các vết xước ở những nơi tiếp xúc – được gọi là bệnh nghề nghiệp [8]

Các nguồn lây nhiễm bệnh Leptospirosis cho người và gia súc:

 Gia súc bị nhiễm bệnh do ăn, uống nguồn thức ăn nước uống có chứa mầm

bệnh được thải ra từ vật mang xoắn khuẩn Leptospira (chuột, gia súc bệnh) Hoặc do da, niêm mạc bị tổn thương tiếp xúc với xoắn khuẩn Leptospira

 Gia súc và người khi tiếp xúc với đồng cỏ, phương tiện vận chuyển có nhiễm

Leptospira được bài xuất ra từ vật mang trùng

 Gia súc non bị nhiễm do tiếp xúc với gia súc mẹ bị bệnh hoặc bú sữa của mẹ

bị bệnh Leptospira truyền qua

 Bệnh còn có thể truyền qua do thụ tinh nhân tạo hoặc giao phối trực tiếp

Chuột là ổ chứa mầm bệnh Leptospira và thải ra môi trường bên ngoài bằng mước

tiểu làm ô nhiễm nguồn thức ăn, nước uống Gia súc, động vật hoang dã và người

bị nhiễm bệnh do tiếp xúc với môi trường có nhiễm xoắn khuẩn Leptospira Động

vật và người mắc bệnh lại tiếp tục đào thải mầm bệnh ra môi trường xung quanh

làm lây bệnh cho các loài động vật mẫn cảm khác…Vòng truyền lây được tàng trữ

và khép kín, trong đó vật nguy hiểm nhất là chuột - loài mang trùng (Hình 1.2)

1.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Leptospira xâm nhập khi đạt được số lượng nhất định trong máu và tổ chức,

các bệnh tích và triệu chứng của bệnh bắt đầu xuất hiện do tác động của độc tố, tính độc của vỏ tế bào Leptospira làm phá vỡ các vi mao mạch dẫn đến thiếu máu cục

bộ ở các khí quan, gây ra các hiện tượng bệnh lý ở thận, gan, màng não, lách Gia súc mắc bệnh nặng có hiện tượng xuất huyết và vàng da [9] Nếu gia súc mắc bệnh

ở thể mạn tính, trên các khí quản đặc biệt là thận có thể xuất hiện những chấm màu

trắng sữa [23]

Leptospira xâm nhập vào cơ thể chỉ sau 12 giờ đã phát hiện có xoắn khuẩn

trong gan, xoắn khuẩn tập trung ở đây cho đến lúc có triệu chứng sốt Trong một số

trường hợp còn thấy Leptospira ở tuyến thượng thận, cơ tim…Khi cơ thể gia súc bị sốt, Leptospira có nhiều trong máu có thể kéo dài tới một tuần Cơ thể bắt đầu sản

sinh kháng thể và có thể tìm thấy được sau 5-10 ngày [28] Hàm lượng kháng thể trong máu cao nhất xác định được sau 3 tuần từ khi gia súc sốt [51] Xoắn khuẩn

Leptospira tiết độc tố làm phá hủy hồng cầu, gây thiếu máu trầm trọng dẫn đến

vàng da, nước tiểu có huyết sắc tố Độc tố phá vỡ thành mao mạch của mô liên kết dưới da gây nên hiện tượng xuất huyết, thẩm lậu dịch cùng với triệu chứng phù nề,

vàng da… Số lượng xoắn khuẩn Leptospira trong máu, gan, phổi…giảm dần và

chuyển về khu trú ở thận Thời kỳ cuối của bệnh, xoắn khuẩn trong thận tăng lên

với số lượng lớn và cư trú trong ống thận gây viêm, hoại tử thận Leptospira xâm

nhập vào nhau thai cùng với độc tố gây biến đổi bệnh lý ở bào thai, làm sảy thai, chủ yếu ở giai đoạn gia súc có chửa từ 1-4 tuần bị bệnh [28]

Độc tố tác động vào não gây triệu chứng thần kinh nhẹ, viêm màng não, tác

dụng vào trung khu hô hấp gây rối loạn hô hấp [28] Độc tố Leptospira làm mất cân

bằng sự điều tiết của hocmon sinh dục làm rối loạn chức năng sinh sản hoặc làm mất hẳn khả năng sinh sản [49]

Thời kỳ nung bệnh của gia súc tùy thuộc vào điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, đường xâm nhập của xoắn khuẩn và độc tố của chúng Sau khi khỏi bệnh, con vật

có miễn dịch với xoắn khuẩn Leptospira nhưng cũng chỉ với những serovar đã gây bệnh cho chúng, nhưng không có khả năng bảo hộ với các serovar Leptospira Gia súc khỏi bệnh Leptospira là ổ chứa vi khuẩn, là vật mang trùng [28]

và người

1.2.4.1 Bệnh Leptospirosis ở lợn

Các serovar thường gây bệnh mang tính đặc trưng loài như Autralis và Pomona ở lợn [11] Bênh cạch đó, có rất nhiều serovar khác có thể gây bệnh ở lợn như là Grippotyphosa, Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae [23], [34], [9] Bệnh xảy ra quanh năm, nhưng nhiều nhất thường vào mùa mưa, gây bệnh cho lợn

ở các lứa tuổi và tính biệt khác nhau, đặc biệt là lợn nái và lợn đực giống Trong số các serovar gây bệnh trên lợn thì L Pomona là một trong những tác nhân gây sẩy thai phổ biến ở lợn nái, làm lợn con sinh ra chết sớm sau khi sinh hoặc trước khi được sinh ra [18]

TRIỆU CHỨNG:

Thể cấp tính: thời gian nung bệnh từ 3 - 5 ngày, lợn ăn ít hoặc bỏ ăn, thở nhiều, thỉnh thoảng có những con run giật tăng dần, nhiều con kêu thét lên sau đó ngã chúi xuống đất, lúc đứng dậy loạng choạng Thân nhiệt tăng cao 40 - 41,5oC Sau 4 - 5 ngày, niêm mạc, da có màu vàng, nước tiểu vàng có huyết sắc tố, mắt có ghèn, thậm chí bị mù Lợn con có thể thấy vàng da, sốt nhẹ kèm theo tiêu chảy nhưng không quá 3 ngày nên khó nhận biết Lợn con theo mẹ bị thiếu máu, da nhợt nhạt và hơi vàng, chậm lớn, lông dựng và phù rõ ở đầu [56]

Thể mạn tính: bệnh phát âm ỉ, thời gian nung bệnh từ 3 - 20 ngày, lợn ăn ít hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, táo bón sau chuyển sang tiêu chảy, tiểu khó khăn, nước tiểu vàng, nước mắt chảy nhiều, thỉnh thoảng có những cơn run giật nhẹ Mũi

lợn khô bóng, mõm sưng, dần dần mặt phù to, mi mắt sụp xuống

Ở heo đực, bao dương vật sưng to trương thành một cái túi, đầu dương vật có khi thò ra ngoài không tụt vào được Ở lợn con, da có thể bong từng mãng, có con hai chân sau bị liệt nằm một chỗ hoặc đi khập khiễng Lợn nái thường có những rối loạn về sinh sản, sảy thai có thể từ 10 - 30% Lợn con đẻ ra chết ngay hoặc có thể sống nhưng còi cọc chết dần [56]

1.2.4.2 Bệnh Leptospirosis ở người

Bệnh do Leptospira gây ra ở người nguy hiểm nhất là do các serovar Icterohaemorrhagiae và Copenhageni nhưng cũng có serovar khác gây bệnh nặng

như Gryppotyphosa, Pyrogenes, có thể gây tử vong [3]

Theo Lê Trung, (1997) thì các serovar Leptospira gặp phổ biến ở người

là Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphora, Hyos, Bataviae, Sejoe, Autralis, Saxkoebing và Pomona Ở Việt Nam hay gặp các serovar như Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Grippotyphosa, Autralis Trong đó, serovar phổ biến nhất ở người là Icterohaemorrhagiae Tuy nhiên, các serovar có khả năng truyền lây trực tiếp hoặc gián tiếp từ gia súc sang người là Canicola và Pomona Vì thế, bệnh do những serovar này gây ra ở người là một bệnh nghề nghiệp của những công nhân nông nghiệp, chăn nuôi, giết mổ và tất cả những người thường xuyên tiêp xúc với gia súc [8]

Sau khi qua da và niêm mạc, Leptospira vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, kéo dài khoảng 5-7 ngày, tương ứng với giai đoạn khởi phát Sau đó Leptospira khu trú

vào các khí quan như gan, thận, màng não, tim, phổi, thượng thận và gây tổn thương các khí quan này Giai đoạn này kéo dài 7-8 ngày, tương ứng với thời kỳ toàn phát Thường từ ngày thứ 8 của bệnh, xoắn khuẩn thải ra ngoài qua đường nước tiểu [2]

Tổn thương gan trong bệnh Leptospirosis gây triệu chứng vàng da Nguyên nhân do tổn thương mạch máu nuôi dưỡng tế bào gan dẫn đến hoại tử tế bào và do độc tố xoắn khuẩn gây huỷ hồng cầu [2]

Tổn thương thận: chủ yếu là tổn thương ống thận gây thiểu-vô niệu, ure và creatinin máu tăng và là nguyên nhân chính gây tử vong Nguyên nhân gây tổn thương ống thận là do thiếu oxy máu và do tác động trực tiếp của nội độc tố

Leptospira [2]

Xuất huyết: nguyên nhân là do độc tố làm tổn thương thành mạch và một phần

do đông máu nội mạch [2]

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH LEPTOSPIROSIS 1.3.1 Chẩn đoán vi khuẩn học

Việc xét nghiệm vi khuẩn học dựa trên các bệnh phẩm thu được chỉ có thể tìm

thấy xoắn khuẩn Leptospira chứ không phân biệt được serovar nào gây bệnh

a Lấy mẫu bệnh phẩm và kiểm tra

Bệnh phẩm thường dùng trong sử dụng xét nghiệm là máu, nước tiểu, phủ tạng của gia súc nghi mắc bệnh Leptospirosis

Tuỳ theo thời gian và thể bệnh có thể lấy các bệnh phẩm khác nhau:

- Sốt trong tuần lễ đầu thì lấy máu

- Sốt trên 10 ngày thì lấy nước tiểu

- Nếu súc vật chết thì lấy gan, thận, óc

Bệnh phẩm là máu: Phải lấy súc vật đang sốt vì lúc này trong máu nhiều xoắn

khuẩn Leptospira Máu được chống đông băng citrat natri 5%, để lắng, hút lớp dịch

trong ở trên nhỏ lên phiến kính và soi tìm vi khuẩn bằng kính hiển vi tụ quang nền đen

Bệnh phẩm là nước tiểu: Lấy khi gia súc hết sốt (thường vào ngày thứ 3 -5 sau

khi sốt) vì lúc này xoắn khuẩn Leptospira khu trú ở thận nhiều nhất Nước tiểu đem

ly tâm, lấy cặn phết lên phiến kính và soi tìm xoắn khuẩn dưới kính hiển vi tụ quang nền đen Nước tiểu phải xem ngay, không quá 12 giờ vì rất dễ nhiễm tạp khuẩn

Bệnh phẩm là phủ tạng: Phải lấy càng sớm càng tốt sau khi gia súc chết để hạn chế tạp khuẩn Bệnh phẩm đem nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/50, ly tâm lấy nước trong xem tươi trên kính hiển vi tụ quang nền đen hoặc có thể nhuộm tiêu bản băng các phương pháp: Romanopski – Giemsa hoặc Frontana – Tribonda [51]

b Nuôi cấy phân lập

Bệnh phẩm lấy để tiến hành nuôi cấy phân lập tìm xoắn khuẩn Leptospira bao

gồm: Máu, thận, gan, lách, nước tiểu Tuy nhiên, yêu cầu lấy bệnh phẩm để nuôi cấy phải tuyệt đối đảm bảo vô trùng, không nhiễm tạp, không bị hư hỏng do nhiệt

độ, hoá chất bệnh phẩm lấy phải dùng ngay Môi trường sử dụng để nuôi cấy hiện nay là EMJH

Bệnh phẩm là phủ tạng: Cắt nhỏ cho vào cối nghiền, nghiền nhỏ cho vào một ống môi trường EMJH, lắc đều, ly tâm, lấy nước chuyển sang ống thứ 2 tiếp tục làm như vậy theo cách pha loãng bậc 10 Đặt các ống môi trường đã cấy vào tủ ấm

280C theo dõi ngày 2 lần và liên tục trong 3 tháng

Bệnh phẩm là máu: Lấy 4 ống môi trường EMJH và tiến hành theo các bước sau:

Bệnh phẩm là nước tiểu: Lấy 3 ống môi trường EMJH và tiến hành như sau:

● Ống 1 nhỏ 1 giọt nước tiểu

● Ống 2 nhỏ 2 giọt nước tiểu

Ống 3 nhỏ 3 giọt nước tiểu

Đặt các ống môi trường đã nuôi cấy vào tủ ấm 280C theo dõi ngày 2 lần, liên tục trong 3 tháng

Lấy máu tim hoặc nước phúc mạc kiểm tra sẽ thấy xoắn khuẩn

Sau 6 - 12 ngày nhiệt độ hạ, con vật sẽ chết [54]

1.3.2 Chẩn đoán huyết thanh học

Là phương pháp cơ bản và quan trọng nhất trong chẩn đoán Leptospirosis

vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết serovar

Leptospira nào gây bệnh [44] Phương pháp này đòi hỏi phải có các serovar Leptospira đã biết, số lượng serovar tuỳ thuộc từng nơi, từng nước sử dụng và huyết

thanh chẩn đoán lấy ở gia súc nghi bệnh

Gia súc sau khi nhiễm bệnh khoảng một tuần trong máu có kháng thể, sau 3 tuần hàm lượng kháng thể trong máu cao nhất rồi giảm dần [28] Các phương pháp

chẩn đoán huyết thanh học để phân biệt các serovar Leptospira là:

- Phản ứng với kháng nguyên chết (hấp thu hồng cầu thụ động)

- Phản ứng vi ngưng kết tan – MAT với kháng nguyên sống

- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno Fluorescence)

- Phản ứng ELISA

1.3.3 Sử dụng phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay, kỹ thuật PCR và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi để chẩn

đoán bệnh do Leptospira gây ra [50], [35], [9] Một số kỹ thuật sinh học phân tử

hiện đại khác cũng đã được ứng dụng để chẩn đoán Leptospira như RFLP [31],

VNRT [36], giải trình tự gen 16S rRNA [40], MLST [10]

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN LỢN

TẠI VIỆT NAM

Ở Việt Nam, bệnh Leptospirosis trên gia súc được nghiên cứu từ rất sớm (1968-1978) Theo Vũ Đình Hưng và Nguyễn Thị Diện (1968-1978) trâu bò và chó đều mắc bệnh này với tỉ lệ rất cao, với 35,1% ở trâu, ở lợn là 22,9% và ở chó là 26,47%, đặc biệt đối với công nhân chăn nuôi tỉ lệ dương tính lên tới 56,0% [3] Tại khu vực Nam Trung Bộ - Tây Nguyên, Hoàng Mạnh Lâm và cs (2001) đã tiến hành xét nghiệm và 357 mẫu huyết thanh lợn thu thập từ 3 vùng sinh thái của tỉnh đắk Lắk Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm ở lợn là 3,53% [5]

Theo Ho Thi Viet Thu và Tran Chi Hieu (2002), tỷ lệ nhiễm Leptospira trên

lợn tại làng Tân Phú Thành, Châu Thành A, Hậu Giang là 16,98%, serovar phổ biến nhất là Icterohaemorrhagiae (13,2%), tiếp theo là Pomona (5,66%) và Bataviae (3,77%)

Năm 2002, Boqvist và cs., đã khảo sát sự ảnh hưởng của Leptospira đến các

chỉ số sinh sản của lợn nái tại một số tỉnh phía Nam [16] Năm 2003, Boqvist và cs.,

đã sử dụng phương pháp miễm dịch huỳnh quang để xác định tình hình nhiễm

Leptospira trên lợn thịt nghi mắc bệnh tại lò mổ miền Nam Việt Nam [17]

Trên đàn lợn nuôi ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ, nghiên cứu của Trương Quang

và cs (2004) cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira tương đối cao, chiếm 26,83% Ở những vùng sinh thái khác nhau thì tỷ lệ nhiễm Leptospira cũng khác nhau, trong

đó vùng đồng bằng có tỷ lệ cao nhất (32,28%) và thấp nhất là vùng ven biển với 20,83% Các serovar phổ biến với tỷ lệ nhiễm cao ở khu vực này là

L.icterohaemorrhagiae (18,01%), L.grippotyphosa (16,15%), L.pomona (15,53%), L.canicola (14,91%), L.bataviae (13,04%) [7]

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian cứu

Tiến hành từ ngày 23/2/2012 đến ngày 31/5/2012

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang – Khánh Hòa

Các lò mổ trên địa bàn Buôn Hồ - Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài được nghiên cức trên mẫu thận lợn lấy lò mổ tại Buôn Hồ – Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định

2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

 Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA theo bộ Kit High pure PCR

template preparation do Roche (Đức) sản xuất.

o GoTaq Green master mix (Promega, USA)

o Mồi xuôi và mồi ngược (IDT, USA)

o Đối chứng dương (mẫu DNA chuẩn do viện IZSVe Italia cung cấp)

o Đối chứng âm

o DNA Marker (100bp, Promega)

 Hóa chất dùng cho điện di

o Điệm TBE 10X

o Agarose

o Thuốc nhuộm ethidium bromide

2.2.3 Kháng nguyên chuẩn

 Bộ kháng nguyên Leptospira gồm 16 serovar do Viện IZSVe (Italia)

và Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách các serovar Leptospira dùng trong chuẩn hóa PCR

4 Icterohaemorrhagiae Copenhageni Wijnberg

TT Serogroup Serovar Chủng

6 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Verdun

- DNA của một số chủng vi khuẩn khác như E coli, C perfringens,

 Máy li tâm lạnh Eppendor MiKro 22R (Hattich – Đức)

 Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)

 Chày, cối sứ nghiền mẫu

 Kéo và panh kẹp

 Máy điện di Apelex PS 304 minipac II

 Hệ thống chụp ảnh điện di Bioprint, máy tính và máy in Viber Lourmat, Pháp

 Lò vi sóng

 Máy Block nhiệt Thermo block NB_305TB, N_BioTEX, Korea

 Máy vortex VWR_International

 Tủ lạnh SR-18AN, Sanyo, Nhật

 Tủ lạnh âm DAIREI, Nhật

 Cân phân tích 324S, Sartorius, Đức

 Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc

 Máy quang phổ kế

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

khoảng 1/3 quả thận Bảo quản trong thùng lạnh ổn nhiệt và chuyển ngay về phòng thí nghiệm

Trong thời gian từ 20/3/2012 đến 2/6/2012 chúng tôi sẽ tiến hành 2 đợt thu mẫu, bao gồm:

- Đắk Lắk: Lấy mẫu tại huyện Buôn Hồ

- Bình Định: Lấy mẫu tại huyện Phù Cát

Mẫu được tiến hành lấy ngẫu nhiên ở các lò mổ lợn tại các địa bàn Buôn Hồ – Đắk Lắk và Phù Cát – Bình Định Do ở các địa phương trên phương thức giết mổ