a. Nguyên tắc
Nhân bản DNA bằng phản ứng PCR là một quy trình dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kì của phản ứng. Một chu kì gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được tăng lên 94oC, làm phá vỡ các liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA ra.
Giai đoạn gắn mồi: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống
nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 57oC, để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn.
Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC, enzyme DNA polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Hình 2.2. Nguyên lý phản ứng PCR
(1) – Biến tính: Tách rời 2 mạch của phân tử DNA.
(2) – Bắt cặp: cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn DNA.
(3) – Kéo dài DNA-polymerase tổng hợp mạch mới từ mồi đã bắt cặp dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất điệm thích hợp
(4) – Chu trình đầu tiên hoàn thành. (5) – Lặp lại n chu kỳ
Sau n phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật PCR, dẫn đến kết quả là một đoạn DNA nhân lên với một lượng rất lớn.
b. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ
o Hệ thống chụp ảnh điện di Bioprint, máy tính và máy in Viber Lourmat, Pháp
o Máy điện di Apelex PS 304 minipac II
o Micropipette các loại
o Máy PCR PX2 (Thermo electron - USA)
o Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)
o Lò vi sống
o Máy vortex VWR_International
o Máy quang phổ kế
o Ống eppendorf các loại vô trùng
o Bao tay
o Đầu típ các loại Hóa chất
Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR.
o Nước
o GoTaq Green master mix (Promega, USA)
o Mồi xuôi và mồi ngược (IDT, USA)
o Đối chứng dương (mẫu DNA chuẩn do viện IZSVe Italia cung cấp)
o Đối chứng âm
o DNA Marker (100bp, Promega) Hóa chất dùng cho điện di
o Điệm TBE 10X
o Agarose
o Thuốc nhuộm ethidium bromide
c. Cách tiến hành
Phản ứng PCR được chuẩn hóa dựa trên mẫu DNA Leptospira chuẩn do Viện IZSVe (Italia) cung cấp với bộ hóa chất của Promega trên hệ thống máy PCR PX2 (Thermo electron - USA). Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gene mã hóa Lipoprotein màng ngoài LipL 32 [35] (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
Gen Trình tự nucleotide của mồi
(5' 3')
Kích thƣớc sản phẩm (bp)
LipL32 LipL32-F CGCTGAAATGGGAGTTCGTATGATT 423
LipL32-R CCAACAGATGCAACGAAAGATCCTTT
Thành phần của phản ứng PCR theo bảng 2.4
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR
i. Xác nhận giá trị của phƣơng pháp PCR
Giá trị của phương pháp PCR được xác nhận dựa trên mẫu DNA Leptospira
chuẩn do Viện IZSVe (Italia) cung cấp. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi phát hiện gene mã hóa Lipoprotein màng ngoài LipL 32. Theo hướng dẫn của Viện IZSVe, sản phẩm khuyếch đại của phản ứng PCR có độ dài là 423bp.
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, ta tiến hành chạy điện di để kiểm tra sản phẩm PCR phải có độ dài là 423bp hay không.
ii. Kiểm tra độ nhạy của phản ứng
Để đánh giá độ nhạy của phản ứng PCR, ta tiến hành pha loãng mẫu DNA theo cơ số 2, sau đó tiến hành phản ứng, đánh giá nồng độ DNA thấp nhất cho kết quả dương tính. Hóa chất Nồng độ PCR (µl/phản ứng) Nước 11,5
GoTaq Green master mix 10
LipL32-F 10μM 0,25
LipL32-R 10μM 0,25
DNA 3
iii. Xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR
Để xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR dùng trong chẩn đoán
Leptospira, chúng tôi tiến hành phản ứng trên mẫu DNA của 15 serovar Leptospira
gây bệnh trên gia súc (Pomona, Bataviae, Tarassovi, Panama, Autumnalis, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Gryppotyphosa, Australis, Hebdomadis, Javanica, Pyrogenes, Copenhageni, Hardjo, Bratislava), 1 serovar không gây bệnh (Patoc) và DNA của một số chủng vi khuẩn khác như E. coli, C. perfringens, P. multocida, S. Typhimurium. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose và đánh giá kết quả phản ứng là dương tính hay âm tính.