a. Nguyên tắc
Mẫu DNA của Leptospira trong mẫu bệnh phẩm được chiết tách bằng bộ Kit
High pure PCR template preparation do Roche (Đức) sản xuất. Quy trình chiết tách
được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bộ kit dùng nguyên lý của sắc ký trao đổi ion.
- Mẫu sau khi xử lý được ly giải bằng cách ủ với đệm ly giải và protein K
- Các acid nucleic được gắn vào màng lọc của ống lọc sau đó ta rửa với đệm Inhibitor Removal Buffer để loại các chất gây ức chế PCR
- Rủa loại bỏ muối, protein và các thành phần khác
- Nucleic acid sau khi được tinh sạch sẽ dùng đệm Elution tách ra khỏi màng lọc.
DNA trong mẫu tách chiết được kết tủa trên màng lọc.
b. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ
o Ống eppendorf các loại vô trùng
o Bao tay
o Micropipette các loại
o Đầu típ các loại
o Chày, cối sứ nghiền mẫu
o Kéo và kẹp
o Tủ ấm Prolabo, Pháp
o Máy li tâm lạnh Eppendor MiKro 22R (Hattich – Đức)
o Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)
o Máy Block nhiệt Thermo block NB_305TB, N_BioTEX, Korea Hóa chất
o BPS
Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA theo bộ Kit High pure PCR template
preparation do Roche (Đức) sản xuất.
o Binding Buffer
o Proteinase K
o Inhibitor Removal Buffer
o Wash Buffer
o Elution Buffer
o Lysozyme
o Isopropanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Quy trình tách chiết
Quy trình tách chiết DNA của Leptospira trong mẫu thận bộ Kit High pure
PCR template preparation:
Bước 1: Xử lý mẫu thận
o Cắt khoảng 50mg mẫu
o Cho mẫu vào cối sứ vô trùng
o Bổ sung 500µl PBS và nghiền nhỏ bằng chày sứ
o Chuyển toàn bộ huyền dịch sang ống eppendorf 1,5ml
o Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút
o Thu 200µl dịch nổi vào ống eppendorf mới
Bước 2: Bổ sung 5µl Lysozyme (10mg/ml trong 10mM Tris-HCl, pH 8.0) vào ống chứa dịch mẫu, ủ ấm 370C/15phút
Bước 3: Bổ sung 200µl binding buffer và 4µl Proteinase K trộn đều ủ ấm 700C/10 phút
Bước 4: Bổ sung 100µl Isopropanol và trộn đều Bước 5:
o Chèn ống có lọc (ống nhỏ có lọc màu trắng) vào ống thu hoạch (ống lớn)
o Hút 500µl dung dịch mẫu cho vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút Bước 6:
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Bổ sung 500µl Inhibitor removal buffer vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút Bước 7: Rửa lần 1
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Bổ sung 500µl Wash buffer vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút Bước 8: Rửa lần 2
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Bổ sung 500µl Wash buffer vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút Bước 9:
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 giây
Bước 10: thu hoạch DNA
o Chèn ống lọc vào eppendorf mới vô trùng
o Bổ sung 200µl Elution buffer vào ống lọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút
o Thu hoạch dung dịch trong ống eppendorf - Đây chính là dịch chứa DNA của Leptospira
Chú ý: Elution buffer phải được ủ ấm ở nhiệt độ 700C/ 15 phút