Để xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR dùng trong chẩn đoán
Leptospira, chúng tôi tiến hành phản ứng trên mẫu DNA của 15 serovar Leptospira
gây bệnh trên gia súc (Pomona, Bataviae, Tarassovi, Panama, Autumnalis, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Gryppotyphosa, Australis, Hebdomadis, Javanica, Pyrogenes, Copenhageni, Hardjo, Bratislava), 1 serovar không gây bệnh (Patoc) và DNA của một số chủng vi khuẩn khác như E. coli, C. perfringens, P. multocida, S. Typhimurium. Kết quả thực hiện phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2 và minh
họa ở hình 3.3.
Bảng 3.2. Kết quả xác định tính đặc hiệu của phản ứng PCR TT Serovar / chủng vi khuẩn PCR 1 Pomona + 2 Bataviae + 3 Panama + 4 Autumnalis + 5 Canicola + 6 Icterohaemorrhagiae + 7 Tarassovi + 8 Gryppotyphosa + 9 Australis + 10 Hebdomadis + 11 Javanica + 12 Pyrogenes + 13 Copenhageni + 14 Hardjo + 15 Bratislava + 16 Patoc - 17 E. coli - 18 C. perfringens -
TT Serovar / chủng vi khuẩn PCR
19 P. multocida -
20 S. typhimurium -
Hình 3.3. Sản phẩm phản ứng PCR xác định tính đặc hiệu. Giếng 1: đối chứng
âm; giếng 2: thang chuẩn DNA 100bp; giếng 3: đối chứng dương; giếng 4-18: mẫu DNA của 15 serovar Leptospira gây bệnh trên gia súc lần lượt là Pomona, Bataviae, Tarassovi, Panama, Autumnalis, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Gryppotyphosa, Australis, Hebdomadis, Javanica, Pyrogenes, Copenhageni, Hardjo, Bratislava; giếng 19: L. Patoc; giếng 20: E. coli; giếng 21: C. perfringens;
giếng 22: P. multocida; giếng 23: S. Typhimurium.
Kết quả phân tích cho thấy phản ứng PCR chỉ cho kết quả dương tính với mẫu DNA của 15 serovar Leptospira gây bệnh. Điều này chứng tỏ phản ứng này đặc
hiệu với các chủng Leptospira gây bệnh, không xảy ra phản ứng chéo với serovar
Patoc không gây bệnh và các chủng vi khuẩn khác. Như vây, phản ứng PCR đảm bảo tính đặc hiệu nên có thể ứng dụng phản ứng này để chẩn đoán các serovar
Leptospira gây bệnh trên gia súc.
Phản ứng PCR đã được chuẩn hóa phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm tại Phân viện thú y miền Trung. Phản ứng được tối ưu, thỏa mãn các yêu cầu theo quy định, độ nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng cũng đã được xác định. Vì vậy, có thể ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán Leptospira từ mẫu bệnh phẩm.
Tóm lại, phản ứng PCR phát hiện gen LipL32 mã hóa cho lipoprotein LipL32 của các chủng Leptospira đã được chuẩn hóa. Phản ứng này đặc hiệu với các
400bp 500bp
serovar Leptospira thuộc nhóm độc lực cao có khả năng gây bệnh trên gia súc, không có phản ứng chéo với các serovar thuộc nhóm không có độc lực (không có khả năng gây bệnh) như serovar Patoc và các vi khuẩn gây bệnh khác thường gặp trên gia súc. Vì vậy, phương pháp PCR phát hiện gen LipL32 có thể ứng dụng trong việc khảo sát, nghiên cứu sự lưu hành của Leptospira trên đàn gia súc. Với phương
pháp PCR vừa được thiết lập, chúng ta có thể chẩn đoán chính xác sự lưu hành cũng như gia súc mắc bệnh Leptospirosis nhưng không thể hiện triệu chứng thông qua việc phát hiện gen LipL32 trong mẫu bệnh phẩm là thận. Ngoài ra, phương pháp này cũng có thể áp dụng cho mẫu nước tiểu và huyết thanh. Tuy nhiên theo Smythe
và cs., (2002), thì hạn chế của phương pháp chẩn đoán Leptospira từ mẫu nước tiểu
và huyết thanh là độ nhạy thường không cao do một số thành phần trong nước tiểu và huyết thanh ức chế phản ứng PCR [50].