2. Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Kỹ thuật PCR
Tiến hành tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử, Viện Da liễu Quốc gia. Bệnh phẩm là dịch tiết niệu đạo (nam) và cổ tử cung (nữ) lấy bằng tăm bông. Sau đó, tiến hành chiết tách DNA bằng Kit Qiamp DNA Mini Kit của hãng Qiagen theo đúng h−ớng dẫn của hãng.
- Thành phần của phản ứng PCR
Dung dịch đệm 10x 5 μl
dNTP 10 mM 1 μl
MgCl2 50 mM 1,5 μl
Taq polymerase 5UI/μl 0,5 μl
Dung dịch ADN 5 μl
Mồi xuôi 10 μM 2,5 μl
Mồi ng−ợc 10 μM 2,5 μl
Tổng l−ợng dung dịch cho 1 lần khuyếch đại ADN là 50 μl. Các hoá chất của phản ứng PCR của hãng Bio-Rad – Hoa Kỳ.
Riêng mồi đ−ợc tổng hợp bởi Invitrogen – Hồng Kông, mồi có trình tự nh− sau:
+ Mồi chẩn đoán C.trachomatis thứ nhất:
(Schachter J et al. Immunological Investigations 1997;26:157-61) KL1: 5' TCC GGA GCG AGT TAC GAA GA 3'
KL2: 5’AAT CAA TGC CCG GGA TTG GT 3' + Mồi chẩn đoán C.trachomatis thứ hai
(Joyee A et al. Jpn. J. Infect. Dis. 2003; 56, 88-92)
T1: 5' CTA GGC GTT TGT ACT CCG TCA 3' T2: 5’ TCC TCA GGA GTT TAT GCA CT 3' + Mồi chẩn đoán lậu cầu
( Ho et al. J. Clin. Pathol. 1992, 45:439–442) HO1: 5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3' HO3: 5’ CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3'
- Chu kỳ nhiệt: biến tính DNA ở 94oC trong 2 phút. Sau đó thực hiện 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính DNA ở 94oC trong 30 giây, giai đoạn gắn mồi ở 55oC trong 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi ở 72oC trong 30 giây. Sau khi hoàn thành 35 chu kỳ, kết thúc phản ứng ở 72oC trong 5 phút.
- Phát hiện sản phẩm khuyếch đại gen: Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm. Bản thạch sau khi chạy điện di đ−ợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 0,5 μg/ml trong 30 phút rồi rửa qua n−ớc cất. Xem và chụp ảnh bản thạch trong buồng tối d−ới ánh sáng cực tím, các băng DNA sẽ phát sáng. So sánh kích cỡ của sản phẩm với thang DNA chuẩn để kết luận sản phẩm có đặc hiệu cho vi khuẩn lậu hay không.
- Chẩn đoán CT bằng cặp mồi KL1 và KL2, cặp mồi này hiện đang đ−ợc sử dụng tại Viện Da liễu Quốc gia. Cặp mồi này nhân lên một đoạn gen 241bp nằm ở plasmid của Chlymydia, để khẳng định chẩn đoán có thể dùng enzyme giới hạn HindIII cắt sản phẩm PCR thành 2 đoạn dài 167bp và 74bp Để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của cặp mồi KL1-KL1, chúng tôi sử dụng cặp mồi T1-T2 làm chuẩn. Cặp mồi T1 – T2 nhân lên 1 đoạn gen dài 200 bp nằm trên plasmid của Chlamydia. Để khẳng định, dùng enzyme giới hạn MspI cắt sản phẩm PCR thành 2 đoạn có kích th−ớc 126 bp và 74 bp.
- Chẩn đoán lậu cầu bằng cặp mồi HO1 – HO3: cặp mồi này nhân lên 1 đoạn gen dài 390bp đặc hiệu cho vi khuẩn lậu.