Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phan Thanh Dũng Tp Hồ Chí Minh, 09/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 09/2018 DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA PGS.TS Vĩnh Định Ds Lâm Hoàng Lệ Vân MỤC LỤC MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC Mục tiêu đề tài Tóm tắt nội dung đề tài ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ - DUNG MÔI – HÓA CHẤT Đối tượng nghiên cứu Chất chuẩn đối chiếu Dung mơi hóa chất Trang thiết bị dụng cụ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 1.  Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin 10 2.  Thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin 11 KẾT Qủa nghiên cứu đạt 19 1.  XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN 19 4.1.1.  Khảo sát điều kiện phân tích 19 2.  Thẩm định quy trình định lượng 24 4.2.2.  Khoảng xác định 37 4.2.3.  Độ thô 37 3.  dỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN 44 4.3.1.  Thuốc thử 44 4.3.2.  Điều kiện sắc ký 44 4.3.3.  Tiến hành 44 4.  ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN 46 5.  BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 1.  KẾT LUẬN 49 2.  ĐỀ NGHỊ 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Cinn Cinnarizine Cinnarizin DĐVN Dược điển Việt Nam ĐL Định lượng HPLC High performance Sắc ký lỏng hiệu cao liquid chromatography HLN Hàm lượng nhãn HLTB Hàm lượng trung bình IR Infrared Hồng ngoại Pira Piracetam Piracetam PDA Photo diode array detector RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TB Trung bình TĐPP Thẩm định phương pháp VKN Viện kiểm nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình 4.8.  Sắc kí đồ điều kiện 1.a 19 Hình 4.9.  Sắc kí đồ điều kiện 1.b 20 Hình 4.10. Sắc kí đồ điều kiện 1.c 20 Hình 4.11. Sắc kí đồ điều kiện 21 Hình 4.12. Sắc kí đồ điều kiện 3.a 22 Hình 4.13. Sắc kí đồ điều kiện 3.b 23 Hình 4.14. Sắc kí đồ điều kiện 24 Hình 4.15. Sắc ký đồ mẫu trắng 25 Hình 4.16. Sắc ký đồ mẫu tá dược 26 Hình 4.17. Sắc kí đồ mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam 26 Hình 4.18. Sắc kí đồ mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin 27 Hình 4.19. Sắc ký đồ chuẩn piracetam 27 Hình 4.20. Sắc ký đồ chuẩn cinnarizin 28 Hình 4.21. Sắc kí đồ chuẩn hỗn hợp 28 Hình 4.22. Sắc kí đồ mẫu thử 29 Hình 4.23. Sắc kí đồ mẫu thử thêm chuẩn 29 Hình 4.24. Phổ UV-Vis piracetam mẫu chuẩn 30 Hình 4.25. Phổ UV-Vis piracetam mẫu thử 30 Hình 4.26. Phổ UV-Vis cinnarizin mẫu chuẩn 31 Hình 4.27. Phổ UV-Vis cinnarizin mẫu thử 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1.  Danh mục chất chuẩn đối chiếu Bảng 3.2.  Danh mục hóa chất thuốc thử Bảng 3.3.  Danh mục trang thiết bị dụng cụ Bảng 3.4.  Các điều kiện khảo sát 11 Bảng 3.5.  Công thức mẫu tá dược 12 Bảng 3.6.  Nồng độ dung dịch tính tuyến tính 14 Bảng 4.8.  Tương quan nồng độ diện tích pic 31 Bảng 4.9.  Kết xử lý thống kê 32 Bảng 4.10.  Kết khảo sát độ piracetam 32 Bảng 4.11.  Kết khảo sát độ cinnarizin 33 Bảng 4.12.  Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống piracetam 34 Bảng 4.13.  Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống cinnarizin 34 Bảng 4.14.  Kết khảo sát độ lặp lại 35 Bảng 4.15.  Kết độ xác trung gian piracetam 35 Bảng 4.16.  Kết độ xác trung gian cinnarizin 36 Bảng 4.17.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn tốc độ dòng 0,7 ml/phút 38 Bảng 4.18.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch thử tốc độ dòng 0,7 ml/phút 38 Bảng 4.19.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn tốc độ dòng 0,9 ml/phút 39 Bảng 4.20.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn tỷ lệ pha động ACN – đệm 55:45 40 Bảng 4.21.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch thử tỷ lệ pha động ACN – đệm 55:45 40 Bảng 4.22.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn tỷ lệ pha động ACN – đệm 65:35 41 Bảng 4.23.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch thử tỷ lệ pha động ACN – đệm 65:35 41 Bảng 4.24.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn đệm pH 4,25 42 Bảng 4.25.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch thử đệm pH 4,25 42 Bảng 4.26.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn đệm pH 4,75 43 Bảng 4.27.  Kết thực nghiệm lần tiêm lặp lại dung dịch thử đệm pH 4,75 43 Bảng 4.28.  Kết định lượng lô piracetam 46 Bảng 4.29.  Kết định lượng lô cinnarizin 46 Báo cáo tổng kết CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC - Piracetam (2-(2-oxopyrrolidin-1 -yl)acetamid) dẫn xuất vịng acid gamma amino-butyric (GABA) Thuốc có tác động lên số chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin, noradrenalin, dopamin…, làm tăng hoạt động vùng Đoan não (vùng não tham gia vào chế nhận thức, học tập, trí nhớ, tỉnh táo ý thức), nên có tác dụng hưng trí hay cải thiện khả học tập, trí nhớ; ngồi thuốc có tác dụng bảo vệ chống lại rối loạn chuyển hóa thiếu máu não cục nhờ làm tăng đề kháng não tình trạng thiếu oxy Chỉ định điều trị triệu chứng chóng mặt; suy giảm trí nhớ, tập trung, thiếu tỉnh táo, rối loạn hành vi, sa sút trí tuệ nhồi máu não nhiều ổ người cao tuổi; điều trị hỗ trợ chứng khó đọc trẻ em; bổ trợ điều trị giật rung có nguồn gốc vỏ não - Cinnarizin ((E)-l-(diphenylmethyl)-4-(3-phenylprop-2 -enyl)piperazin) thuốc kháng histamin (H1) có tác dụng ngăn chặn thụ thể quan tận tiền đình, ức chế trình tiết histamin acetylcholin Cinarizin cịn chất đối kháng calci có chọn lọc, ức chế co tế bào trơn mạch máu nên làm giãn mạch máu não, làm tăng lưu lượng máu đến vùng, giảm tình trạng thiếu oxy não Chỉ định phịng say tàu xe; rối loạn tiền đình chóng mặt, ù tai, buồn nơn, nơn bệnh Ménière - Viên phối hợp cho tác động hưng trí piracetam, tác động kháng histamin cinnarizin cịn làm cho tác động cải thiện tuần hoàn não hai hoạt chất tăng lên so với chế phẩm đơn thành phần - Công ty Cổ Phần Dược phẩm Boston Việt nam nghiên cứu sản xuất viên nang cứng chứa hoạt chất chưa xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm Vì vậy, thực đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin viên nang cứng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA” Để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm Báo cáo tổng kết MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA Thăm dị điều kiện phân tích như: - Lựa chọn pha động - pH pha động - Tỉ lệ pha động - Tốc độ dịng - Bước sóng phát Đưa qui trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin Báo cáo tổng kết khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hồn tồn, thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Dung dịch chứa nồng độ cinnarizin 47,0 µg/ml piracetam 750 µg/ml - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm Siêu âm đuổi khí Dung dịch hỗn hợp có nồng độ 300 µg/ml piracetam 18,75 µg/ml cinnarizin Chuẩn bị mẫu thử: Cân 20 nang, xác định khối lượng trung bình bột thuốc nang, nghiền thành bột mịn Cân xác khoảng lượng thuốc bột tương đương với 75 mg piracetam vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 15 phút, đề nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu dung dịch thử đậm đặc Hút xác 10 ml dịch thử đậm đặc pha lỗng thành 25,0 ml với dung mơi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45 μm Siêu âm đuổi khí Kiểm tra tính tương thích hệ thống: Tiến hành tiêm liên tiếp lần dung dịch chuẩn, yêu cầu: - Hệ số kéo pic phải nhỏ từ 0,8 - 1,2 - Các thông số lần tiêm có RSD ≤ 2,0% Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký dung dịch thử Hàm lượng (%) chất viên so với hàm lượng ghi nhãn tính theo khối lượng trung bình viên, tính theo cơng thức: H (%) = St mc D M   C  t  TBV  100 Sc mt Dc HLN Trong đó: St: Diện tích pic hoạt chất mẫu thử Sc: Diện tích pic hoạt chất mẫu chuẩn mc: Khối lượng hoạt chất chuẩn (mg) mt: Khối lượng mẫu thử (mg) C: Hàm lượng hoạt chất chuẩn (%) Dt: Độ pha loãng dung dịch thử Dc: độ pha loãng dung dịch chuẩn HLN: hàm lượng hoạt chất ghi nhãn (mg) MTBV: Khối lượng trung bình viên (mg) Báo cáo tổng kết 4.4 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN Ứng dụng lô sản xuất Chuẩn bị mẫu mục 4.3 4.4 Mỗi lô chuẩn bị mẫu thử, mẫu thử tiến hành sắc ký lần Bảng 4.28 Kết định lượng lô piracetam Piracetam Lô 010517 RD Lô 020517 RD Lô 030517 RD KLTBV(mg) 496,4 496,8 496,3 KL thử 93,94 93,81 94,07 94,01 94,03 S chuẩn S thử S thử S thử S thử S thử S thử 963683 972351 988722 1004695 995384 998899 971146 971107 971678 989295 1006178 995383 999910 971197 984231 986861 992295 994283 TB 982077 972015 989009 1005437 995384 999405 971172 SD 12162 RSD(%) 1,24 98,22 99,88 101,76 100,47 100,83 97,96 STT 93,89 HL% HL 99,05 TB% 101,11 99,40 Bảng 4.29 Kết định lượng lô cinnarizin Cinnarizin Lô 010517 RD Lô 020517 RD Lô 030517 RD KLTBV(mg) 496,4 496,8 496,3 KL thử STT S chuẩn 93,89 93,94 93,81 94,07 94,01 94,03 S thử S thử S thử S thử S thử S thử Báo cáo tổng kết 1151425 1203255 1153179 1122129 1152306 1118397 1189053 1151208 1204869 1152544 1122659 1152261 1117739 1186997 1151497 1152048 1152995 1151261 1122394 1152284 1118068 1188025 97,14 99,73 96,67 102,72 TB 1151739 1204062 1152862 SD 684 RSD(%) 0.06 HL% 104,13 99,70 HL TB% 4.5 101,91 98,44 99,69 BÀN LUẬN Hệ sắc ký hấp phụ pha đảo phương pháp HPLC áp dụng phổ biến nghiên cứu, phân tích kiểm nghiệm nhờ khả vượt trội so kỹ thuật khác đa dạng hợp chất mà phân tách Để có kết phân tách tốt việc lựa chọn điều kiện sắc kí cần thiết trình xây dựng quy trình phân tích, đặc biệt phân tích mẫu, thuốc đa thành phần Những điều kiện bao gồm: chất pha tĩnh (loại pha tĩnh, kích thước cột,…), thành phần tỷ lệ pha động, pH pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, chất chất phân tích,… Về cột pha tĩnh, loại cột nhồi với pha tĩnh khác có tính chất khác Qua khảo sát hai loại cột C8 C18 với lực lưu giữ chất pha tĩnh khác nhau, ta chọn cột C18 có khả tách hiệu ổn định Cột Eclipse XDB C18 với kích thước hạt µm, khoảng trống lỗ xốp 80 Å, diện tích bề mặt 180 m2/g, nhiệt độ tới hạn 60 oC, khoảng pH 2-9, tải lượng cacbon 10%, khả end-capped triệt để,… phù hợp với điều kiện sắc ký lựa chọn thẩm định Việc lựa chọn dung môi phân cực cho pha động dựa vào thông số vật lý đặc trưng dung môi độ phân cực, sức rửa giải, độ nhớt, ngưỡng hấp thu UV,… Nước dung mơi phân cực nên khơng tương tác với nhóm alkyl khơng phân cực pha Báo cáo tổng kết tĩnh, coi pha động yếu có tốc độ rửa giải chậm tất dung mơi động sắc kí pha đảo Do đó, pha động thường hỗn hợp nước đệm với nhiều dung môi hữu phân cực tan nước, nước có vai trị giảm khả rửa giải pha động, lại làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột Như việc lựa chọn dung môi hữu phải phù hợp cho có độ phân cực cao, khả rửa giải nhanh, rút ngắn thời gian phân tách, vừa có độ nhớt thấp,… Các dung mơi hữu thường sử dụng acetonitril, methanol hay tetrahydrofuran Tetrahydrofuran có khả rửa giải mạnh, giúp tách chất cách nhanh chóng, lại tan nước dễ bị phân hủy thành hợp chất peroxyd, tương tác với chất phân tích sau tiếp xúc với khơng khí Kết thăm dị điệu kiện dung môi acetonitril methanol cho thấy acetonitril lựa chọn có khả hịa tan nhiều chất, độ nhớt thấp, q trình sắc kí gây nhiễu thấp Tỷ lệ thành phần pha động điều chỉnh cho đạt phân tách mong muốn thời gian phân tách hợp lý, gia tăng lượng dung mơi hữu giúp rút ngắn thời gian phân tích ngược lại Đối với chất có khả ion hóa pH pha động có khả thay đổi dạng tồn chất phân tích Cinnarizin base yếu, phân cực, có pKa 7,47, pH nhỏ (pKa – 2) chuyển dạng ion hóa làm giảm thời gian lưu chất Với công nghệ chế tạo cột nay, hầu hết hãng chế tạo cột sắc kí endcap, cịn nhóm silanol tự Hiện tượng dư thừa nhóm silanol làm cho pic bị kéo đi, ảnh hưởng đến hình dạng pic thời gian lưu pKa Si-OH khoảng 3,5, có nghĩa pH 3,5 50% dạng ion hóa 50% dạng khơng ion hóa Khi điều kiện thiết lập pH 4,5, có khoảng 10% dạng khơng ion hóa đến 90% dạng ion hóa, triethylamin thêm vào pha động với vai trò gắn vào vị trí này, làm ảnh hưởng dạng ion hóa Bên cạnh đó, nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đến độ nhớt pha động, để giảm độ nhớt, tiến hành nhiệt độ 45 oC thay nhiệt độ phịng Tuy nhiên để ổn định pH ta sử dụng đệm phosphat với khả đệm khoảng pH rộng (1,1 – 13,3) UV cutoff thấp (