phân lập và xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong dược liệu cốt khí (rễ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HOÀNG DUY PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ (RỄ) (Radix Polygoni cuspidati) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HOÀNG DUY PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ (RỄ) (Radix Polygoni cuspidati) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu luận văn trung thực chưa có cơng trình cơng bố Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019 Nguyễn Hoàng Duy Luận văn thạc sĩ dược học - Khóa 2017 - 2019 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất - Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ (RỄ) (Radix Polygoni cuspidati) Thầy hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Thực hiện: Nguyễn Hồng Duy Đặt vấn đề Cốt khí dược liệu sử dụng phổ biến thuốc dân gian Dược liệu có nhiều hoạt chất thuộc nhóm anthraquinon, tiêu biểu emodin, physcion Hai chất chứng minh có nhiều tác dụng sinh học Hiện chuyên luận Cốt khí (rễ) DĐVN V chưa xây dựng quy trình định lượng hoạt chất Do đề tài thực với mục tiêu: “Phân lập xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin physcion dược liệu Cốt khí (rễ) (Radix Polygoni cuspidati)” phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng Dược liệu Cốt khí, emodin, physcion Phương pháp nghiên cứu Bột dược liệu chiết phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol Cao ethanol phân tán vào nước, lọc lấy tủa Tủa rửa nhiều lần với methanol n-hexan sau xử lý kết tinh lại thu hợp chất Phần dịch methanol ban đầu thu hồi dung môi đến cắn Cắn dùng để phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột cổ điển Các hợp chất kiểm tra độ tinh khiết SKLM DSC, xác minh cấu trúc liệu phổ nghiệm UV, IR, NMR, MS so sánh với tài liệu tham khảo Đánh giá đặc tính hợp chất phân lập với tiêu: tính chất, điểm chảy, định tính, độ tinh khiết sắc ký Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời hợp chất dược liệu Cốt khí phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết bàn luận Từ 500 gam dược liệu, phân lập emodin (435 mg) physcion (35,6 mg) Độ tinh khiết sắc ký 99,02% 99,69% Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời emodin physcion Cốt khí HPLC: cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động: MeOH – dung dịch acid phosphoric 0,1% (85 : 15), tốc độ dịng ml/phút, bước sóng phát 254 nm Kết luận Đề tài đạt mục tiêu đề Quy trình phân lập hoạt chất từ dược liệu Cốt khí thu emodin physcion đạt độ tinh khiết cao Với quy trình định lượng thẩm định, áp dụng định lượng đồng thời emodin physcion mẫu Cốt khí thị trường Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 ISOLATE AND SIMULTANEOUS DETERMINATE EMODIN AND PHYSCION IN POLYGONUM CUSPIDATUM (ROOT) (Radix Polygoni cuspidati) Nguyen Hoang Duy Supevisor: Ph.D Nguyen Huu Lac Thuy Assoc Prof: Vo Thi Bach Hue Introduction Radix Polygoni cuspidati is a popular traditional herbal medicine Major compounds in this herb are anthraquinone group such as emodin and physcion Both of them have a lot biological effects At present, there is no announcement of quantitative emodin and physcion in Radix Polygoni cuspidati This study focus on: isolate and simultaneous determinate emodin and physcion in Radix Polygoni cuspidati by HPLC Materials and method Objects: Polygonum cuspidatum, emodin, physcion Methods Dried powder of Radix Polygoni cuspidati was percolated with ethanol Ethanol extract was dispersed into water, suspension was filtered to get precipitant Precipitant was purifed by rine with methanol and n-hexan then recrystallized in suitable solvent Methanol solution in previous step was used for isolate another compound by column chromatoghraphy The purity of these compound were checked by TLC and DSC Structure of them were verified by UV, IR, MS, NMR spectra Characteristics of emodin and physcion were evaluated such as: property, melting point, identification, purity by liquid chromatoghraphy Validate analytical method for simultaneous determination emodin and physcion in Radix Polygoni cuspidati by high performance liquid chromatography Results Emodin (435 mg) and physcion (35,6 mg) were isolated from 500 gram power of Radix Polygoni cuspidati Purity of emodin is 99,02 percent Purity of physcion is 99,69 percent Established and validated analytical method for simultaneous determination of emodin and physcion in Radix Polygoni cuspidati by HPLC: column C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), mobile phase: MeOH – phosphoric acid 0,1% (85 : 15), flow rate: ml/min, wavelength 254 nm Conlution The objective of this study has been achieved Emodin and physcion was isolated with high purity Analytical method for simultaneous determination emodin and physcion in Polygonum cuspidatum by HPLC was validated and applied MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ 1.2 TỔNG QUAN VỀ EMODIN 10 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHYSCION .12 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ 14 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ .16 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .21 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỰC VẬT HỌC 30 3.2 PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIÊT 30 3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG CỐT KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 53 CHƯƠNG BÀN LUẬN 65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các ký hiệu Chữ viết tắt Từ nguyên Acetonitril ACN APCI As Tiếng Việt Atmosphere pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất ionization khí Asymmetry factor Hệ số bất đối C Nồng độ DĐVN V Dược Điển Việt Nam V DMSO Dimethyl sulfoxide DSC Differential scanning calorimetry Phân tích nhiệt vi sai ESI Electrospray ionization Ethanol EtOH HPLC IR High Performance Liquid Chromatography Infrared spectra Sắc ký lỏng hiệu cao Quang phổ hồng ngoại Methanol MeOH MS Ion hóa phun điện tử Mass spectrum Phổ khối Số đĩa lý thuyết N NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PDA Photodiode array Dãy diod quang RP Reverse Phase Pha đảo Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối RSM Response Surface Methodology Phương pháp bề mặt đáp ứng Diện tích pic S SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Tử ngoại i DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Độ tan emodin số loại dung môi .11 Bảng 1.2 Chương trình dung mơi nghiên cứu số 17 Bảng 1.3 Chương trình dung mơi nghiên cứu số 19 Bảng 1.4 Chương trình dung mơi nghiên cứu 20 Bảng 3.1 Độ ẩm bột dược liệu Cốt khí .30 Bảng 3.2 Kết gộp phân đoạn sau sắc ký cột 35 Bảng 3.3 Kết kiểm tra độ tinh khiết CK-1 SKLM 38 Bảng 3.4 Kết kiểm tra độ tinh khiết CK-2 SKLM 39 Bảng 3.5 So sánh liệu phổ NMR (1H 13C) emodin CK-1 42 Bảng 3.6 So sánh liệu phổ NMR (1H 13C) physcion CK-2 44 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ UV–vis, MS, IR điểm chảy chất phân lập 45 Bảng 3.8 Kết đánh giá tính phù hợp hệ thống .46 Bảng 3.9 Mối tương quan nồng độ diện tích pic emodin 48 Bảng 3.10 Kết % diện tích pic emodin .49 Bảng 3.11 Kết đánh giá tính phù hợp hệ thống 49 Bảng 3.12 Mối tương quan nồng độ diện tích pic physcion .51 Bảng 3.13 Kết % diện tích pic physcion 52 Bảng 3.14 Kết khảo sát loại dung môi chiết .55 Bảng 3.15 Kết khảo sát số lần chiết 56 Bảng 3.16 Kết khảo sát thời gian chiết .57 Bảng 3.17 Đánh giá tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng 58 Bảng 3.18 Kết khảo sát tính tuyến tính 60 Bảng 3.19 Kết khảo sát độ lặp lại quy trình .61 Bảng 3.20 Kết khảo sát độ xác trung gian 62 Bảng 3.21 Kết tỉ lệ thu hồi emodin 63 Bảng 3.22 Kết tỉ lệ thu hồi physcion 63 Bảng 3.23 Hàm lượng trung bình emodin physcion 64 DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Lá hoa Cốt khí Hình 1.2 Rễ Cốt khí Hình 1.3 Cấu trúc hoá học emodin 10 Hình 1.4 Cấu trúc hoá học physcion 12 Hình 2.1 Ngun liệu Cốt khí 21 Hình 3.1 Kết soi bột ngun liệu Cốt khí 30 Hình 3.2 SKĐ khảo sát loại dung môi chiết 31 Hình 3.3 Sắc ký đồ cao cồn toàn phần tủa (A) 32 Hình 3.4 Tủa (A), tủa (B) dịch (C) .33 Hình 3.5 SKLM cao tồn (TP), dịch (C) tủa (B) 33 Hình 3.6 Sản phẩm thơ trước kết tinh .34 Hình 3.7 Sản phẩm kết tinh CK-1 34 Hình 3.8 Cột sắc ký phân lập hợp chất từ cao methanol 35 Hình 3.9 SKLM phân đoạn thu sắc ký cột cắn (C) 36 Hình 3.10 Sản phẩm kết tinh CK-2 36 Hình 3.11 SKĐ kiểm tra độ tinh khiết CK-1 phương pháp SKLM 38 Hình 3.12 SKĐ kiểm tra độ tinh khiết CK-2 phương pháp SKLM 39 Hình 3.13 Kết đo DSC mẫu CK-1 .40 Hình 3.14 Kết đo DSC mẫu CK-2 .40 Hình 3.15 Cơng thức cấu tạo emodin 41 Hình 3.16 Công thức cấu tạo physcion 43 Hình 3.17 Kết khảo sát độ đặc hiệu – emodin .47 Hình 3.18 SKĐ xác định độ tinh khiết emodin .48 Hình 3.19 Kết khảo sát độ đặc hiệu – physcion .50 Hình 3.20 SKĐ xác định độ tinh khiết physcion 51 Hình 3.21 Khảo sát bước sóng phát .53 Hình 3.22 SKĐ khảo sát thay đổi tỉ lệ pha động 54 Hình 3.23 SKĐ khảo sát với tốc độ dòng 1,2 ml/phút 55 Hình 3.24 Kết khảo sát loại dung môi chiết 56 Hình 3.25 Kết khảo sát số lần chiết .57 Hình 3.26 Kết khảo sát thời gian chiết .57 Hình 3.27 SKĐ khảo sát độ đặc hiệu quy trình định lượng .59 Hình 3.28 Phổ UV độ tinh khiết pic chất phân tích mẫu thử .60 Hình 3.29 Mối tương quan diện tích pic nồng độ chất 61 Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại thực vật Cốt khí Sơ đồ 1.2 Quy trình phân lập emodin từ Cốt khí 14 Sơ đồ 3.1 Phân lập hợp chất tinh khiết từ tủa (A) .37 45 SKĐ kiểm tra tính tuyến tính - Mẫu SKĐ kiểm tra tính tuyến tính - Mẫu 46 SKĐ kiểm tra tính tuyến tính - Mẫu SKĐ kiểm tra tính tuyến tính - Mẫu 47 SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu 48 SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu SKĐ kiểm tra độ lặp lại - Mẫu 49 SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu 50 SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu SKĐ kiểm tra độ xác trung gian - Mẫu 51 SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 80% - Mẫu SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 80% - Mẫu 52 SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 80% - Mẫu SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 100% - Mẫu 53 SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 100% - Mẫu SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 100% - Mẫu 54 SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 120% - Mẫu SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 120% - Mẫu 55 SKĐ kiểm tra độ đúng, mức 120% - Mẫu 56 Phụ lục 14 SKĐ định lượng mẫu Cốt khí thị trường Mẫu thử 1A Mẫu thử 1B Mẫu thử 2A 57 Mẫu thử 2B Mẫu thử 3A Mẫu thử 3B 58 Mẫu thử 4A Mẫu thử 4B 59 Mẫu thử 5A Mẫu thử 5B ... chuyên luận Cốt khí (rễ) DĐVN V chưa xây dựng quy trình định lượng hoạt chất Do đề tài thực với mục tiêu: ? ?Phân lập xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin physcion dược liệu Cốt khí (rễ) (Radix... tiêu đề Quy trình phân lập hoạt chất từ dược liệu Cốt khí thu emodin physcion đạt độ tinh khiết cao Với quy trình định lượng thẩm định, áp dụng định lượng đồng thời emodin physcion mẫu Cốt khí thị... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN HOÀNG DUY PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG DƯỢC LIỆU CỐT KHÍ (RỄ) (Radix