Xây dựng quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ ĐÀO XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ ĐÀO XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN Tp Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn đảm bảo tính trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Lê Thị Đào Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Lê Thị Đào Hướng dẫn khoa học: TS Chương Ngọc Nãi, PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: LC-MS/MS, irbesartan, hydroclorothiazid Mở đầu: Phối hợp irbesartan (IRB) hydroclorothiazid (HCTZ) định điều trị phù nề tăng huyết áp Các nghiên cứu lâm sàng IRB HCTZ cho kết hợp có hiệu lâm sàng Cho đến nay, có chế phẩm phối hợp IRB HCTZ sản xuất nước với giá thành rẻ so với sản phẩm ngoại nhập Để chứng minh hiệu điều trị tương đương thuốc generic thuốc phát minh, cần phải đánh giá tương đương sinh học in vivo Kỹ thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm độ nhạy tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn giới hạn định lượng chất thấp mẫu dịch sinh học Vì vậy, kỹ thuật áp dụng phổ biến để định lượng thuốc dịch sinh học Trên giới có số cơng trình định lượng đồng thời IRB HCTZ huyết tương người Tuy nhiên, chưa có tác giả nước cơng bố cơng trình định lượng đồng thời IRB HCTZ huyết tương người Do đó, đề tài thực với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn US-FDA EMA, góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa IRB HCTZ Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: IRB HCTZ mẫu huyết tương người giả lập Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tương giả lập chứa chất phân tích chuẩn nội telmisartan xử lý phương pháp kết tủa protein với methanol, acetonitril; chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl ether, ethyl acetat hỗn hợp tert-butyl methyl ether ethyl acetat Mẫu sau xử lý định lượng kỹ thuật LC-MS/MS, sử dụng cột sắc ký pha đảo, pha động methanol đệm amoni format mM pH Sau cùng, quy trình định lượng thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: IRB, HCTZ chuẩn nội ion hóa kỹ thuật ESI ghi phổ k4y thuật MRM để thu ion phân tử ion phân mảnh dùng cho định lượng Quy trình định lượng đồng thời IRB HCTZ huyết tương người kỹ thuật LCMS/MS xây dựng, sử dụng cột sắc ký Gemini C18 (250 x mm; µm), pha động methanol đệm amoni format mM, pH (80:20, tt/tt), tốc độ dòng 0,4 ml/phút Mẫu huyết tương giả lập xử lý phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp tert-butyl methyl ether - ethyl acetat (50:50, tt/tt) cho hiệu suất chiết 95% Quy trình định lượng thẩm định đạt u cầu chung quy trình phân tích thuốc dịch sinh học Kết luận: Đề tài xây dựng quy trình định lượng đồng thời IRB HCTZ huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Quy trình ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học chế phẩm chứa IRB HCTZ i Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LC-MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF IRBESARTAN AND HYDROCHLOROTHIAZIDE IN HUMAN PLASMA Le Thi Dao Supervisor: Dr Chuong Ngoc Nai, Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: LC-MS/MS, irbesartan, hydrochlorothiazide Introduction: Combination of irbesartan (IBR) and hydrochlorothiazide (HCTZ) is indicated in the treatment of edema and hypertension Clinical studies on IRB and HCTZ suggest that this combination is effective So far, there has been only one formulation of IRB and HCTZ combination is locally produced with a competitive price than one of imported products In order to prove clinically equivalent efficacy between generic and patent drugs, the in vivo bioequivalence study is mandatory The LC-MS/MS technique has several advantages such as high sensitivity and specificity, short analysis time and low limit of quantitation This technique is being applied commonly to quantify active ingredients in biological fluids There have been several simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma until now However, no local authors have published the simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma, so far Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing IRB and HCTZ Materials and methods Object of study: IRB and HCTZ spiked into blank human plasma samples Methods of study: Blank human plasma samples containing the analytes and telmisartan as internal standard, were treated by protein precipitation with methanol, acetonitrile; liquidliquid extraction with tert-butyl methyl ether, ethyl acetate and mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate The treated samples were quantified by LC-MS/MS, using reverse phase column, mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer mM with pH Finally, the quantitative procedure was validated on the basis of FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation Results: IRB, HCTZ and internal standard were ionized using ESI source and detected by multiple reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular ions and fragment ions for quantification The procedure for simultaneous assay IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed, using Gemini C18 column (250 x mm; µm), mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer mM with pH (80:20, v/v), and flow rate of 0.4 ml/min The human plasma samples were treated by liquid-liquid extraction with a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50, v/v), which gave the recovery above 95% The procedure was successfully validated with general requirements for a bioanalytical procedure Conclusion: The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed which is high sensitivity, specificity and accuracy The procedure can be applied for in vivo bioequivalence study of combination medical products containing IBR and HCTZ MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ x MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan irbesartan 1.2 Tổng quan hydroclorothiazid 1.3 Tổng quan chuẩn nội 1.4 Tổng quan phương pháp xử lý mẫu huyết tương 1.5 Thẩm định quy trình định lượng thuốc dịch sinh học theo US-FDA EMA .11 1.6 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.2 Địa điểm nghiên cứu 24 2.3 Nguyên vật liệu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 36 3.2 Khảo sát chuẩn nội 38 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký .38 3.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 46 3.5 Xác định khoảng nồng độ định lượng thuốc 52 3.6 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người LC-MS/MS theo hướng dẫn US-FDA EMA .53 3.7 Dự thảo quy trình định lượng đồng thời irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người LC-MS/MS .62 CHƯƠNG BÀN LUẬN .66 4.1 Lựa chọn kỹ thuật phân tích 66 4.2 Điều kiện khối phổ 66 4.3 Điều kiện sắc ký .67 4.4 Lựa chọn chuẩn nội 67 4.5 Quy trình xử lý mẫu .68 4.6 Kết thẩm định 69 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, Từ nguyên Ký hiệu AF Acid formic AS Analytical standard (Chất chuẩn phân tích) ACN Acetonitrile Cmax Nồng độ đỉnh CC Calibration curve (Đường chuẩn) CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu) ESI Electrospray ionization (Ion hóa phun điện) US-FDA The United States Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ) HCTZ Hydroclorothiazid HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HQC High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IRB Irbesartan IS Internal standard (Chuẩn nội) LC-MS LC-MS/MS Liquid chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ) Liquid chromatography – Tandem Mass spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ/Khối phổ) LLOQ Lower limit of quantification (Giới hạn định lượng dưới) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) .i LOQ Limit of quantification (Giới hạn định lượng) LQC Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) MF Matrix factor (Yếu tố mẫu) MRM Multiple reaction monitoring MQC Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) QC Quality control (Mẫu kiểm tra) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S Area (Diện tích pic) S/N Signal / Noise (Tín hiệu / Nhiễu) TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo tR Retention time (Thời gian lưu) TCCS Tiêu chuẩn sở UHPLC- Ultra high performance liquid chromatography – Tandem Mass MS/MS spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu – Khối phổ/Khối phổ) ULOQ Upper limit of quantitation (Giới hạn định lượng trên) UPLC- Ultra performance liquid chromatography – Tandem Mass MS/MS spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu – Khối phổ/Khối phổ) ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số quy trình xử lý mẫu huyết tương người .10 Bảng 1.2 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng - khối phổ 18 Bảng 1.3 Nồng độ đỉnh (Cmax) khoảng nồng độ tuyến tính irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người 19 Bảng 2.1 Chất chuẩn chuẩn nội sử dụng nghiên cứu .24 Bảng 2.2 Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Các mẫu huyết tương trắng sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.4 Một số thiết bị phân tích sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.5 Khoảng nồng độ tuyến tính dự kiến mức nồng độ mẫu kiểm tra IRB HCTZ huyết tương người 31 Bảng 2.6 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương người 32 Bảng 3.1 Kết tối ưu hóa phân mảnh IRB, HCTZ, telmisartan, losartan, valsartan 36 Bảng 3.2 Kết tối ưu hóa điều kiện khối phổ telmisartan, losartan, valsartan nồng độ µg/mL 38 Bảng 3.3 Các thông số sắc ký chất phân tích theo nhiệt độ cột 43 Bảng 3.4 Các thơng số sắc ký chất phân tích theo tốc độ dòng 44 Bảng 3.5 Các thơng số sắc ký chất phân tích theo thể tích tiêm mẫu .45 Bảng 3.6 Hiệu suất chiết dược chất chuẩn nội từ huyết tương với dung môi tủa protein (n=6) 47 Bảng 3.7 Kết khảo sát dung môi chiết (n=6) 48 Bảng 3.8 Kết khảo sát nồng độ natri hydroxyd kiềm hóa huyết tương (n=6) 49 Bảng 3.9 Kết khảo sát nồng độ acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) 50 Bảng 3.10 Kết khảo sát thể tích acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) 51 Bảng 3.11 Kết khảo sát số lần chiết (n=6) 52 Bảng 3.12 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tương 53 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-35 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-36 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-37 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-38 Stability plasma freeze-thaw: cycles Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-39 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-41 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-43 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-44 Phụ lục 13 Chứng nhận phân tích chất chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-45 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-46 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Phụ lục 14 Giấy xác nhận đề tài triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo người tình nguyện Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... trình chiết irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người kỹ thuật LC- MS/ MS Việc thẩm định thực... cơng trình định lượng đồng thời IRB HCTZ huyết tương người Do đó, đề tài thực với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan hydroclorothiazid huyết tương người kỹ thuật. .. hạn định lượng chất thấp mẫu phức tạp dịch sinh học Vì lý trên, đề tài “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC- MS/ MS”