Xây dựng qui trình định lượng đồng thời valsartan và nifedipin trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CAO THỊ THU GIANG XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VALSARTAN VÀ NIFEDIPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CAO THỊ THU GIANG XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VALSARTAN VÀ NIFEDIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số : 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn đƣợc đảm bảo tính trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Cao Thị Thu Giang Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 60.72.04.10 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VALSARTAN VÀ NIFEDIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Cao Thị Thu Giang Thầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn, TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Từ khóa: valsartan, nifedipin, huyết tương người, kỹ thuật LC – MS/MS Mở đầu: Tăng huyết áp yếu tố nguy gây nên bệnh tim mạch tỷ lệ bệnh nhân đạt huyết áp mục tiêu sau thời gian điều trị cịn thấp Vì vậy, phác đồ điều trị tăng huyết áp khuyến cáo tăng liều phối hợp thuốc từ giai đoạn sớm bệnh để đạt hiệu điều trị Trong đó, việc phối hợp valsartan liều 80 mg nifedipin liều 30 mg cho hiệu kiểm soát tốt huyết áp chứng minh lâm sàng Tuy nhiên, giới có số cơng trình nghiên cứu định lượng đồng thời hai hoạt chất huyết tương người, đặc biệt Việt Nam chưa có cơng trình thực Từ nhu cầu thực tế trên, đề tài thực với mục tiêu xây dựng thẩm định qui trình định lượng đồng thời valsartan nifedipin huyết tương người kỹ thuật LCMS/MS theo hướng dẫn US-FDA EMA Đối tƣợng & Phƣơng pháp nghiên cứu Qui trình định lượng đồng thời valsartan nifedipin huyết tương người thực hệ thống ACQUITY UPLC H-CLASS SYSTEM (Waters) ghép đầu dò khối phổ Xevo TQD (Waters) với phận ion hóa phun điện tử Mẫu huyết tương xử lý phương pháp kết tủa protein với acetonitril acid formic 0,045% Valsartan, nifedipin nội chuẩn losartan tách cột sắc ký pha đảo, sử dụng hệ pha động acetonitril acid formic 0,015% Qui trình định lượng thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: Valsartan, nifedipin nội chuẩn ion hóa chế độ ion hóa dương với kỹ thuật ghi phổ MRM cho mảnh mẹ mảnh dùng cho định lượng tương ứng sau: m/z 436,15  235,05, m/z 349,03  315,03 m/z 423,16  207,04 Tỷ lệ huyết tương acetonitril acid formic 0,045% để kết tủa hoàn toàn protein 1:3 Điều kiện sắc ký bao gồm cột Thermo C18 AcclaimTM 120 (250 mm x mm; µm), pha động hỗn hợp acetonitril – acid formic 0,015% (65:35,tt/tt), tốc độ dòng ml/phút Miền giá trị valsartan nifedipin 20,0 – 6000,0 ng/ml 0,25 – 75 ng/ml Giới hạn định lượng valsartan nifedipin 20,0 ng/ml 0,25 ng/ml Các tiêu tính đặc hiệu, tỷ lệ thu hồi, độ đúng, độ xác, ảnh hưởng mẫu chất mang, độ ổn định cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đề tài xây dựng thẩm định thành công qui trình định lượng đồng thời valsartan nifedipin huyết tương người phương pháp LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Do đó, qui trình ứng dụng để theo dõi nồng độ hai thuốc huyết tương nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học Master’s Thesis – Academic course: 2015 - 2017 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60.72.04.10 DEVELOPMENT OF LC – MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF VALSARTAN AND NIFEDIPINE IN HUMAN PLASMA Cao Thị Thu Giang Supervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan, Dr Do Chau Minh Vinh Tho Keywords: Valsartan, Nifedipine, Human plasma, LC–MS/MS Introduction: Although hypertension is one of the high risk factors for cardiovascular diseases, its control rate is not very high Therefore, most of the guidelines suggest starting medication as monotherapy and increasing the dose or prescribing a low-dose combination The combination of valsartan (VAL) with 80 mg dose and nifedipine (NIF) with 30 mg dose has been proved to have a good effect on controlling blood pressure However, a few analytical method was reported for simultaneous determination of these drugs in human plasma; especially, in Viet Nam, there has been no published study Therefore, this study was conducted with the aim of development of LC – MS/MS method for simultaneous determination of VAL and NIF in human plasma Materials and methods: A method for quantification of VAL and NIF in human plasma was been developed using Acquity UPLC H–Class system and Xevo TQD mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source VAL, NIF and losartan as internal standard (IS) in human plasma were extracted by protein precipitation with acetonitrile and 0.045% formic acid (AF) solution , then seperated on a C18 reversed phase column, and finally eluted with acetonitrile mixed with 0.015% AF solution The assay was validated in compliance with US FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation Results: Electrospray ionnization source was operated in positive mode and multiple reaction monitoring (MRM) mode, using the transition of m/z 436.15  235.05, m/z 349.03  315.03 and m/z 423.16  207.04 to quantify VAL, NIF and IS, respectively VAL and NIF were extracted from human plasma using acetonitrile in combination with 0.045% AF with ratio of 1:3 The optimized LC conditions contained of the reversed phase column Thermo C18 AcclaimTM 120 (250 x 4.6 mm; µm), the mobile phase with a mixture of acetonitrile and 0.015% AF (65:35, v/v) at flow rate of mL/min The linearity was obtained over the concentration range of 20 – 6000 ng/mL and of 0.25 – 75 ng/mL with the lower limits of quantitation of 20 ng/mL and 0.25 ng/mL for VAL and NIF, respectively The selectively, intra and inter – day precision and accuracy, stability, matrix effect and recoveries of all the analytes were in the acceptable range Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid LC-MS/MS method for simultaneous determination of valsartan and nifedipine in human plasma was successfully developed and validated This method can be useful for monitoring level of these drugs in human plasma in pharmacokinetic and bioequivalence studies iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan valsartan (VAL) 1.2 Tổng quan nifedipin (NIF) 1.3 Tổng quan nội chuẩn 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng siêu hiệu ghép với đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 1.5 Xử lý mẫu huyết tƣơng .12 1.6 Thẩm định quy trình định lƣợng thuốc dịch sinh học theo US-FDA EMA .15 1.7 Một số cơng trình nghiên cứu định lƣợng valsartan nifedipin huyết tƣơng ngƣời kỹ thuất sắc ký lỏng với đầu dò khối phổ .22 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm nghiên cứu .25 2.3 Nguyên vật liệu .25 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Khảo sát nội chuẩn 26 2.4.2 Khảo sát điều kiện khối phổ để thu đƣợc tín hiệu VAL, NIF IS cao 26 2.4.3 Khảo sát điều kiện sắc ký để phân tích đồng thời VAL, NIF IS huyết tƣơng ngƣời 27 iv 2.4.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tƣơng 27 2.4.5 Thẩm định qui trình định lƣợng đồng thời VAL, NIF, IS huyết tƣơng ngƣời phƣơng pháp UPLC-MS/MS theo hƣớng dẫn US-FDA EMA 30 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Khảo sát nội chuẩn 36 3.2 Khảo sát điều kiện khối phổ để thu đƣợc tín hiệu VAL, NIF IS cao .36 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký để tách đồng thời VAL, NIF IS huyết tƣơng ngƣời 38 3.4 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tƣơng 41 3.5 Thẩm định qui trình định lƣợng đồng thời VAL NIF huyết tƣơng ngƣời phƣơng pháp UPLC-MS/MS theo hƣớng dẫn US-FDA EMA .43 3.6 Dự thảo quy trình định lƣợng đồng thời VAL NIF huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật UPLC-MS/MS 53 Chƣơng BÀN LUẬN 57 4.1 Lựa chọn điều kiện khối phổ để thu đƣợc tín hiệu VAL, NIF IS cao .57 4.2 Lựa chọn nội chuẩn .57 4.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích đồng thời VAL NIF huyết tƣơng ngƣời 58 4.4 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tƣơng 59 4.5 Thẩm định qui trình định lƣợng đồng thời VAL NIF huyết tƣơng ngƣời phƣơng pháp UPLC-MS/MS theo hƣớng dẫn US-FDA EMA .59 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên AF Acid formic AS Analyte Standard ACN Acetonitrile Ý nghĩa Chất chuẩn phân tích Atmospheric pressure Ion hóa hóa học áp suất khí chemical ionization CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán EMA European Medicines Agency ESI Electronsray Ionization Ion hóa cách phun điện tử The United States Food and Cục Quản lý thuốc Thực Drug Administration phẩm Hoa Kỳ APCI FDA HCTZ HPLC Cơ quan quản lý dƣợc phầm Châu Âu Hydroclorothiazid High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HQC High quality control Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Internal Standard Nội chuẩn LLE Liquid-liquid extraction Chiết lỏng-lỏng LLOQ Lower Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng dƣới LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng LOR Losartan LQC Low quality control MeOH Methanol MF Matrix effect Mẫu kiểm tra nồng độ thấp Ảnh hƣởng mẫu vi Chữ viết tắt Từ nguyên Ý nghĩa MRM Multiple reaction monitoring MQC Medium quality control NIF Nifedipin PP Protein precipitation Tủa protein ppm Parts per million Phần triệu ppb Parts per billion Phần tỷ QC Quality control Mẫu kiểm chứng Rs Resolution factor Hệ số phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối S Area Diện tích S/N Signal / Noise Tín hiệu / Nhiễu SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SRM Single reaction monitoring TLTK Tài liệu tham khảo Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình Ultra Performance Liquid UPLC-MS/MS Chromatography – Mass Sắc ký lỏng siêu hiệu Spetrometry/Mass ghép khối phổ lần tứ cực Spetrometry VAL Valsartan vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số qui trình xử lý mẫu huyết tƣơng ngƣời 14 Bảng 1.2 Một số công trình nghiên cứu định lƣợng valsartan nifedipin huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật sắc ký lỏng với đầu dò khối phổ 22 Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu nội chuẩn đƣợc sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Nồng độ dung dịch chuẩn 28 Bảng 2.3 Nồng độ lý thuyết giai mẫu tuyến tính mẫu kiểm chứng 28 Bảng 3.1 Tóm tắt thơng tin khảo sát nội chuẩn 36 Bảng 3.2 Các thông số đầu dị khối phổ dùng để định tính, định lƣợng VAL, NIF LOR 38 Bảng 3.3 Kết khảo sát điều kiện xử lý huyết tƣơng 42 Bảng 3.4: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống nồng độ LQC 43 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống nồng độ HQC 43 Bảng 3.6 Tóm tắt kết khảo sát tính đặc hiệu 45 Bảng 3.7 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi hoạt chất nội chuẩn 45 Bảng 3.8 Kết khảo sát xây dựng đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 47 Bảng 3.9 Kết thẩm định độ – độ xác phƣơng pháp với VAL 47 Bảng 3.10 Kết thẩm định độ – độ xác phƣơng pháp với NIF 48 Bảng 3.11 Kết khảo sát xác định giới hạn định lƣợng dƣới VAL 49 Bảng 3.12 Kết khảo sát xác định giới hạn định lƣợng dƣới NIF 49 Bảng 3.13 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc 50 Bảng 3.14 Độ ổn định hoạt chất VAL huyết tƣơng 50 Bảng 3.15 Độ ổn định hoạt chất NIF huyết tƣơng 50 Bảng 3.16 Kết đánh giá ảnh hƣởng mẫu chất mang phân tích VAL NIF 51 Bảng 3.17 Chất chuẩn đối chiếu nội chuẩn đƣợc sử dụng quy trình 52 Bảng 3.18 Nồng độ giai mẫu chuẩn 53 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-21 PHỤ LỤC DỮ LIỆU THÔ CỦA CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG DƢỚI (LLOQ) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-22 PHỤ LỤC DỮ LIỆU THÔ CỦA CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA MẪU Phụ lục 9.1 Độ ổn định dung dịch gốc Phụ lục 9.1.1 Mẫu ban đầu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-23 Phụ lục 9.1.2 Mẫu bảo quản ngắn hạn nhiệt độ phòng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-24 Phụ lục 9.1.3 Mẫu bảo quản dài hạn -20 oC 20 ngày Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-25 Phụ lục 9.2 Độ ổn định hoạt chất huyết tƣơng Phụ lục 9.2.1 Độ ổn định ngắn hạn nhiệt độ phòng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-27 Phụ lục 9.2.2 Độ ổn định mẫu sau xử lý phận tiêm mẫu (20 oC 24 giờ) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-29 Phụ lục 9.2.3 Độ ổn định mẫu sau chu kỳ đơng – rã đơng Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-31 Phụ lục 9.2.4 Độ ổn định mẫu thời gian 20 ngày Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-32 Phụ lục 9.2.5 Độ ổn định mẫu thời gian 30 ngày Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-33 PHỤ LỤC 10 DỮ LIỆU THÔ CỦA CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA NỀN MẪU VÀ CHẤT MANG Phụ lục 10.1 Mẫu chuẩn dung môi Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-34 Phụ lục 10.2 Mẫu chuẩn huyết tƣơng xử lý Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PL-35 ... NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC – MS/ MS” đƣợc thực với mục tiêu sau:  Xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời valsartan nifeipin huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật LC – MS/ MS  Thẩm định qui trình định lƣợng đồng. .. trình định lượng đồng thời valsartan nifedipin huyết tương người kỹ thuật LCMS /MS theo hướng dẫn US-FDA EMA Đối tƣợng & Phƣơng pháp nghiên cứu Qui trình định lượng đồng thời valsartan nifedipin huyết. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CAO THỊ THU GIANG XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VALSARTAN VÀ NIFEDIPIN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC- MS/ MS Chuyên