xây dựng qui trình định lượng đồng thời simvastatin và chất chuyển hóa acid beta hydroxy simvastatin trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc msms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TẠ THỊ THANH XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SIMVASTATIN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID BETAHYDROXY SIMVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TẠ THỊ THANH XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SIMVASTATIN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID BETAHYDROXY SIMVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Hướng dẫn khoa học: TS CHƯƠNG NGỌC NÃI PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tạ Thị Thanh Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SIMVASTATIN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID BETA-HYDROXY SIMVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Tạ Thị Thanh Người hướng dẫn: TS Chương Ngọc Nãi, PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: Simvastatin, acid beta-hydroxy simvastatin, huyết tương người, LC – MS/MS Mở đầu: Simvastatin thuốc thuộc nhóm statin sử dụng nhiều điều trị rối loạn lipid máu để dự phòng bệnh tim mạch làm giảm LDL-cholesterol, làm tăng HDLcholesterol giảm triglycerid, ổn định mảng xơ vữa, chống viêm Hiện nay, thị trường Việt Nam lưu hành thuốc generic simvastatin với giá thành thấp nhiều so với thuốc gốc Tuy nhiên, chế phẩm chưa đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc Simvastatin (SIM) diện huyết tương nồng độ thấp sau uống chuyển hóa thành chất có hoạt tính acid beta-hydroxy simvastatin (SIM-A) Tại Việt Nam, chưa có cơng trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển hóa huyết tương người cơng bố Vì vậy, đề tài thực với mục tiêu xây dựng qui trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển hóa acid beta-hydroxy simvastatin huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa simvastatin thị trường Việt Nam Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tương người giả lập chứa SIM SIM-A Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện khối phổ, chuẩn nội điều kiện sắc ký; Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương giả lập chứa chất phân tích chuẩn nội phương pháp chiết lỏng-lỏng; Thẩm định qui trình định lượng SIM SIM-A huyết tương người theo hướng dẫn US-FDA, EMA DĐVN V Kết quả: SIM, SIM-A chuẩn nội ion hóa chế độ ESI ghi phổ với kỹ thuật MRM để phát ion phân tử ion phân mảnh SIM SIM-A dùng cho định lượng m/z 436,00 → 285,15; 435,10 → 319,15 404,95 → 199,10 Với dung môi chiết tert-butyl methyl ether (2,5 ml x lần) có bổ sung 300 µl amoni acetat 100 mM (pH 4,5), chất chiết với hiệu suất chiết ổn định 80% Điều kiện sắc ký thích hợp bao gồm cột Eclipse XDB-C8 (100 × 4,6 mm; 3,5 µm); Nhiệt độ cột 35 oC; Nhiệt độ buồng tiêm mẫu oC; Tốc độ dịng 0,5 mL/phút; Thể tích tiêm mẫu µL; Pha động bao gồm acetonitril - dung dịch đệm amoni acetat mM (pH 4,5) với chương trình dung mơi sau: 0’(60:40), 6’(80:20), 8,5’(80:20), 9’(60:40), 11’(60:40) Khoảng tuyến tính SIM SIM-A 0,05 – 50 ng/ml 0,05 – 10 ng/ml Giới hạn định lượng phương pháp 0,05 ng/ml với SIM SIM-A Các tiêu thẩm định tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác, ảnh hưởng mẫu, lượng mẫu tồn dư, độ pha loãng độ ổn định cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đã xây dựng qui trình định lượng đồng thời SIM chất chuyển hóa SIM-A huyết tương người kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác độ cao Qui trình ứng dụng để theo dõi nồng độ thuốc huyết tương người nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học Master’s Thesis – Academic course: 2018- 2020 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LC–MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SIMVASTATIN AND BETA-HYDROXY SIMVASTATIN ACID METABOLITE IN HUMAN PLASMA Ta Thi Thanh Supervisor: Dr Chuong Ngoc Nai, Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: Simvastatin, beta-hydroxy simvastatin acid, LC-MS/MS, human plasma Introduction: Simvastatin is one of the pharmaceutical substances belonging to a statin group and is widely used in treatment of dyslipidemia to prevent cardiovascular diseases by LDL-cholesterol and triglyceride lowering, HDL-cholesterol increasing, atherosclerosis stabilizing, and antiinflammation… The Vietnamese market is currently circulating a simvastatin generic with a selling price which is more cheaper than the one of brand-name product However, this formulation has not been assessed for in vivo bioequivalence to the reference product Simvastatin is present in plasma at very low concentration after oral administration due to it is converted to an active metabolite, beta-hydroxy acid simvastatin (SIM-A) To the best of our knowledge, no study has been published in Vietnam for simultaneous quantification of simvastatin and its metabolite in human plasma so far Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure for SIM and SIM-A in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing simvastatin Materials and methods Objective of study: Human plasma samples containing SIM and SIM-A Methods of study: Mass spectrometry, internal standard (IS), and chromatographic conditions were investigated to find out the suitable IS and conditions; Human plasma samples containing SIM, SIM-A and IS were investigated by using liquid-liquid extraction (LLE) And finally, the assay was validated in compliance with US-FDA, EMA and Vietnamese pharmacopoeia V guidelines on bioanalytical method validation Results: SIM, SIM-A, and IS were ionized using ion electrospray ionization (ESI) and detected by multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for quantification The transition of m/z is 436.00 → 285.15, 435.10 → 319.15, and 404.95 → 199.10 for SIM, SIMA, and IS, respectively The human plasma samples were treated by LLE using methyl tert-buthyl ether (2.5 ml x times) followed by the addition of 300 µL of 100 mM ammonium acetate (pH 4.5), which gave the stable recovery above 80% for all analytes The suitable chromatographic conditions were performed on an Eclipse XDB-C8 column (100 x 4.6 mm; 3.5 µm) at 35ºC The mobile phase comprising of acetonitrile and mM ammonium acetate buffer (pH 4.5) was delivered 0' (60:40), 6' (80:20), 8,5' (80:20), '(60:40), 11' (60:40) at a flow rate of 0.5 mL/min The autosampler was kept at 4oC and an aliquot of µL was injected into the LC-MS/MS system Linearity range is 0.05 - 50 ng/mL, and 0.05 - 10 ng/mL for SIM, and SIM-A, respectively The lower limit of quantitation of SIM, and SIM-A is 0.05 ng/mL The validation results showed that the specificity, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and stability of all the analytes were in the acceptable range Conclusion: A highly sensitive, specific, precise, and accurate LC-MS/MS method for simultaneous quantification of SIM and SIM-A in human plasma was successfully developed and validated This method can be applied for quantification of these compounds in human plasma for in vivo bioavailability (BA) and bioequivalence (BE) studies i MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan simvastatin 1.2 Tổng quan chất chuyển hóa acid beta-hydroxy simvastatin 1.3 Tổng quan chuẩn nội lovastatin 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) 1.5 Lựa chọn chuẩn nội cho kỹ thuật LC-MS/MS 11 1.6 Ảnh hưởng mẫu (Matrix effects) 13 1.7 Xử lý mẫu huyết tương 13 1.8 Thẩm định qui trình định lượng thuốc dịch sinh học theo hướng dẫn USFDA, EMA DĐVN V 15 1.9 Một số công trình nghiên cứu định lượng đồng thời simvastatin acid betahydroxy simvastatin huyết tương người kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ .17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu .21 2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Nguyên vật liệu 21 2.4 Trang thiết bị 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ .32 3.2 Khảo sát chuẩn nội 34 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 34 ii 3.4 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 42 3.5 Xác định khoảng nồng độ định lượng chất cần phân tích 48 3.6 Thẩm định qui trình phân tích 49 3.7 Dự thảo qui trình định lượng đồng thời simvastatin acid beta-hydroxy simvastatin tronghuyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS 58 CHƯƠNG BÀN LUẬN .62 4.1 Lựa chọn kỹ thuật phân tích .62 4.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 62 4.3 Lựa chọn chất chuẩn nội 63 4.4 Điều kiện xử lý mẫu hiệu suất chiết 64 4.5 Độ nhạy phương pháp .65 4.6 Tính đặc hiệu 65 4.7 Xây dựng đường chuẩn khoảng tuyến tính 65 4.8 Độ ổn định chất phân tích 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận .66 Kiến nghị .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên Tiếng Việt chữ viết tắt ACN Acetonitrile API Atmospheric pressure ionization Ion hóa áp suất khí quiển APCI Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất khí ionization quiển ATO Atorvastatin BLK Blank BYT Bộ Y tế Cmax Maximum plasma concentration Nồng độ đỉnh huyết tương CC Calibration curve Đường chuẩn CI Chemical Ionization Ion hóa hóa học CTPT Cơng thức phân tử CV Coefficient of variation DMSO Dimethyl sulfoxide EA Ethyl acetat EMA European medicines agency Cơ quan Dược phẩm châu Âu EI Ionization by electron impact Ion hóa bắn phá điện tử ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện EZE Ezetimibe CF-FAB Continous flow fast atom Bắn phá nhanh nguyên tử dòng bombardment liên tục FB Particle beam Chùm tia hạt FI Field ionization Ion hóa trường HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Mẫu trắng Hệ số phân tán chromatography HQC High quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ cao iv IS Internal standard KLPT Khối lượng phân tử LC-MS/MS Liquid chromatography - Chuẩn nội Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ Tandem mass spectrometry LLCE Liquid–liquid cartridge Chiết phân đoạn lỏng-lỏng extraction LLE Liquid-liquid extraction Chiết lỏng-lỏng LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOV Lovastatin LOV-A Lovastatin acid LQC Low quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp LSE Liquid–solid extraction Chiết lỏng rắn MAA Methyl amoni acetat MF Matrix factor Hệ số ảnh hưởng mẫu MQC Medium quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình ppb Parts per billion Một phần tỷ ppm Parts per million Một phần triệu PTHQ Phương trình hồi qui RP Reverse phase Pha đảo RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối ROS Rosuvasatin SD Standard deviation SIM Simvastatin SIM-A Acid beta-hydroxy simvastatin SQC Small quality control Độ lệch chuẩn Mẫu kiểm chứng nồng độ nồng độ trung bình TB Trung bình v TBME tert-butyl methyl ether tR Retention time TCCS Tiêu chuẩn sở US-FDA United States - Food and drug Cơ quan Quản lý Thuốc Thực administration phẩm Hoa Kỳ Upper limit of quantitation Giới hạn định lượng ULOQ Thời gian lưu PL-45 PL-46 PL-47 PL-48 Phụ lục 10 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hưởng mẫu PL-49 PL-50 PL-51 Phụ lục 11 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư PL-52 PL-53 Phụ lục 12 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hưởng pha loãng PL-54 Phụ lục 13 Chứng nhận phân tích chất chuẩn PL-55 PL-56 PL-57 PL-58 Phụ lục 14 Giấy xác nhận đề tài triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo người tình nguyện PL-59 ... dựng qui trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển hóa acid beta- hydroxy simvastatin huyết tương người kỹ thuật LC- MS/MS - Thẩm định qui trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển. .. cơng trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển hóa huyết tương người cơng bố Vì vậy, đề tài thực với mục tiêu xây dựng qui trình định lượng đồng thời simvastatin chất chuyển hóa acid beta- hydroxy. .. Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI SIMVASTATIN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID BETA- HYDROXY SIMVASTATIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC- MS/MS Tạ Thị Thanh Người hướng dẫn: