Xây dựng quy trình định lượng đồng thời amlodipin, losartan và chất chuyển hóa acid carboxylic losartan trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ NGUYỄN VĂN TRUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, LOSARTAN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID CARBOXYLIC LOSARTAN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CHƢƠNG NGỌC NÃI PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Nguyễn Văn Trung Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, LOSARTAN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID CARBOXYLIC LOSARTAN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Nguyễn Văn Trung Ngƣời hƣớng dẫn: TS Chƣơng Ngọc Nãi, PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: amlodipin, losartan, huyết tƣơng ngƣời, LC – MS/MS Mở đầu: Dạng thuốc phối hợp amlodipin (thuốc chẹn kênh calci) losartan (thuốc ức chế thụ thể angiotensin II) đƣợc sử dụng rộng rãi giúp kiểm sốt huyết áp hữu hiệu nhanh chóng so với đơn trị thành phần riêng rẽ Hiện nay, thị trƣờng Việt Nam lƣu hành thuốc kết hợp amlodipin losartan với giá thành rẻ so với thuốc ngoại nhập Tuy nhiên, chế phẩm chƣa đƣợc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học so với thuốc gốc, hai dƣợc chất diện huyết tƣơng nồng độ thấp 14% liều losartan uống chuyển thành chất chuyển hóa có hoạt tính acid carboxylic losartan Cho đến nay, có cơng trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan chất chuyển hóa huyết tƣơng kỹ thuật LC-MS/MS Vì vậy, đề tài đƣợc thực với mục tiêu xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan chất chuyển hóa acid carboxylic losartan huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật LC-MS/MS, góp phần vào việc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học chế phẩm phối hợp chứa amlodipin losartan Đối tƣợng & Phƣơng pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu huyết tƣơng ngƣời chứa amlodipin (AM), losartan (LOS) acid caboxylic losartan (ACL) Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tƣơng giả lập chứa chất phân tích nội chuẩn (IS) irbesartan đƣợc xử lý phƣơng pháp chiêt lỏng-lỏng Qui trình định lƣợng AM, LOS ACL huyết tƣơng ngƣời đƣợc xây dựng kỹ thuật LC-MS/MS đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn US-FDA EMA Kết quả: AM, LOS, ACL nội chuẩn đƣợc ion hóa chế độ ESI(+) đƣợc ghi phổ với kỹ thuật MRM cho ion phân tử ion phân mảnh dùng cho định lƣợng lần lƣợt m/z 409,15 → 238,05, m/z 423,25 → 207,10, m/z 437,20 → 235,10 m/z 429,35 → 207,10 Với dung môi chiết ethyl acetat (3 ml x lần) có bổ sung 100 µl acid phosphoric 5%, hầu hết chất đƣợc chiết với hiệu suất chiết ổn định 85% Điều kiện sắc ký thích hợp bao gồm cột Gemini C18 (250 x mm; µm) nhiệt độ cột 40º C, pha động acetonitril – acid formic 0,1% (65:35,tt/tt), tốc độ dòng 0,55 ml/phút Miền giá trị AM, LOS ACL lần lƣợt 0,045 – 15 ng/ml; 0,5 – 1000 ng/ml 0,5 – 1000 ng/ml Giới hạn định lƣợng dƣới AM, LOS ACL lần lƣợt 0,045 ng/ml; 0,5 ng/ml 0,5 ng/ml Các tiêu thẩm định nhƣ tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác, ảnh hƣởng mẫu, lƣợng mẫu tồn dƣ, độ pha loãng độ ổn định cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đã xây dựng đƣợc qui trình định lƣợng đồng thời AM, LOS chất chuyển hóa ACL huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Qui trình đƣợc ứng dụng để theo dõi nồng độ hai thuốc huyết tƣơng ngƣời nghiên cứu sinh khả dụng tƣơng đƣơng sinh học Master’s Thesis – Academic course: 2017- 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LC–MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF AMLODIPINE, LOSARTAN AND LOSARTAN CARBOXYLIC ACID METABOLITE IN HUMAN PLASMA Nguyen Van Trung Supervisor: Dr Chuong Ngoc Nai, Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywords: Amlodipine, losartan, losartan carboxylic acid, LC-MS/MS, human plasma Introduction: The combination of amlodipine (calcium channel blockers) and losartan (angiotensin II receptor inhibitors) is widely used since it helps control blood pressure more effectively and quickly than monotherapy with individual components Vietnamese market is currently circulating a combination of amlodipine and losartan with a selling price which is cheaper than the one of imported products However, this formulation has not been assessed for in vivo bioequivalence to reference product, these substances are present in plasma at very low concentrations, and 14% of the oral dose of losartan is converted to an active metabolite, losartan carboxylic acid There has been only one publication on simultaneous quantitative determination of amlodipine, losartan and its metabolite in human plasma by LC-MS/MS, so far Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure for amlodipine, losartan and its losartan carboxylic acid metabolite in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing amlodipine and losartan Materials and methods Object of study: Human plasma samples containing amlodipine (AM), losartan (LOS) and losartan carboxylic acid (ACL) Methods of study: Human plasma samples containing AM, LOS, ACL, and irbesartan as internal standard (IS) were treated by liquid-liquid extraction (LLE) A method for quantification of AM, LOS and ACL in human plasma was developed using LC-MS/MS The assay was validated in compliance with US-FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation Results: AM, LOS, ACL and IS were ionized using positive ion electrospray ionization (ESI+) and detected by multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for quantification The transition of m/z is 409.15 → 238.05, 423.25 → 207.10, 437.20 → 235.10, and 429.35 → 207.10 for AM, LOS, ACL and IS, respectively The human plasma samples were treated by LLE using ethyl acetate (3 ml x times) and following by acidification with 100 µl of 5% phosphoric acid, which gave the recovery above 85% for most analytes The chromatography was performed on a Gemini C18 column (250 x 2.0 mm; 5.0 µm) at 40ºC, the mobile phase comprising of acetonitrile and 0.1% formic acid (80:20, v/v), and flow rate of 0.55 mL/min Linearity range is 0.045-15 ng/mL, 0.5-1000 ng/mL, and 0.5-1000 ng/mL for AM, LOS and ACL, respectively The lower limit of quantitation of amlodipine, losartan and losartan carboxylic acid is 0.045 ng/mL, 0.5 ng/mL, and 0.5 ng/mL, respectively The validation results showed that the selectively, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and stability of all the analytes were in the acceptable range Conclusion: A highly sensitive, specific and precision LC-MS/MS method for simultaneous quantitative determination of AM, LOS and ACL in human plasma was successfully developed and validated This method can be applied for quantification of these compounds in human plasma for in vivo bioavailability (BA) and bioequivalence (BE) studies MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .III DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan amlodipin .3 1.2 Tổng quan losartan kali 1.3 Tổng quan chất chuyển hóa acid carboxylic losartan .6 1.4 Tổng quan chuẩn nội .7 1.5 Tổng quan sắc ký lỏng - khối phổ 1.6 Lựa chọn chuẩn nội cho phƣơng pháp LC-MS 12 1.7 Ảnh hƣởng mẫu huyết tƣơng 13 1.8 Xử lý mẫu huyết tƣơng 13 1.9 Thẩm định quy trình định lƣợng thuốc dịch sinh học 15 1.10 Một số công trình nghiên cứu 21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .28 2.2 Địa điểm nghiên cứu 28 2.3 Nguyên vật liệu 28 2.4 Trang thiết bị 29 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ .38 3.2 Khảo sát chuẩn nội .38 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 38 3.4 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu 48 3.5 Xác định khoảng nồng độ định lƣợng thuốc 54 i 3.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 55 3.7 Dự thảo quy trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan acid carboxylic losartan huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật LC-MS/MS 64 CHƢƠNG BÀN LUẬN .66 4.1 Lựa chọn kỹ thuật phân tích .66 4.2 Điều kiện sắc ký 66 4.3 Lựa chọn chất chuẩn nội 67 4.4 Điều kiện xử lý mẫu hiệu suất chiết 68 4.5 Độ nhạy phƣơng pháp 68 4.6 Tính đặc hiệu 69 4.7 Xây dựng đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 69 4.8 Độ ổn định chất phân tích .69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 Kết luận……… 72 Kiến nghị… 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ Từ nguyên viết tắt AUC Area under cover (Diện tích bên dƣới đƣờng cong) AM Amlodipin ACL Acid carboxylic losartan APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học áp suất khí CE Collision cell (Buồng va chạm) CF-FAB Continuous flow fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tục) CI Chemical ionization (Ion hóa hóa học) Cmax Nồng độ đỉnh CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) EI Electronic ionization (Ion hóa điện tử) ESI Electrospray ionization (Ion hóa phun điện) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc Thực phẩm) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu) FI Field ionization (Ion hóa trƣờng) FTICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance - Mass spectrometry (Khối phổ cộng hƣởng ion cyclotron - sử dụng phép biến đổi Fourier) HQC High quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao) IT Ion trap (bẫy ion) IS Internal standard (Chuẩn nội) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc v Ký hiệu, chữ Từ nguyên viết tắt tế Hóa học túy ứng dụng) LC Liquid chromatography (Sắc ký lỏng) LC-MS/MS Liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng Khối phổ/Khối phổ) LOS Losartan LLOQ Lower limit of quantification (Giới hạn định lƣợng dƣới) LQC Low quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp) MQC Medium quality control (Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình) MS Mass spectrometry (Khối phổ) MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối) Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh TOF Time of flight (Thời gian bay) ULOQ Upper limit of quantification (Giới hạn định lƣợng trên) USP United States Pharmacopoeia (Dƣợc điển Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh hƣớng dẫn US-FDA EMA 20 Bảng 1.2 Một số công trình nghiên cứu định lƣợng amlodipin, losartan chất chuyển hóa acid carboxylic losartan huyết tƣơng ngƣời kỹ thuật sắc ký lỏng - khối phổ 22 Bảng 2.1 Chất chuẩn chuẩn nội dự kiến sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Hóa chất dung mơi sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.3 Lô huyết tƣơng trắng ngƣời sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.4 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 3.1 Các hệ pha động khảo sát 41 Bảng 3.2 Thông số sắc ký chất phân tích chuẩn nội tƣơng ứng với tốc độ dòng khảo sát 46 Bảng 3.3 Thơng số sắc ký chất phân tích chuẩn nội tƣơng ứng với nhiệt độ cột khảo sát .47 Bảng 3.4 Thông số sắc ký chất phân tích chuẩn nội tƣơng ứng với thể tích tiêm khảo sát .49 Bảng 3.5 Hiệu suất chiết hoạt chất chuẩn nội từ huyết tƣơng với dung môi tủa protein (n=6) 49 Bảng 3.6 Kết khảo sát dung môi chiết (n=6) 50 Bảng 3.7 Kết khảo sát nồng độ acid hóa huyết tƣơng (n=6) 52 Bảng 3.8 Kết khảo sát thể tích acid hóa huyết tƣơng (n=6) 53 Bảng 3.9 Kết khảo sát thể tích dung mơi chiết ethyl acetat (n=6) 53 Bảng 3.10 Kết khảo sát số lần chiết (n=6) .54 Bảng 3.11 Nồng độ lý thuyết thuốc huyết tƣơng .55 Bảng 3.12 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n=6) (phụ lục 2) 55 Bảng 3.13 Kết xác định độ đặc hiệu 56 Bảng 3.14 Kết xác định giới hạn đinh lƣợng dƣới 57 i Bảng 3.15 Mối tƣơng quan nồng độ AM, LOS ACL tỷ số diện tích pic chất phân tích với chuẩn nội huyết tƣơng 58 Bảng 3.16 Kết đánh giá tính tƣơng thích phƣơng trình hồi quy ý nghĩa hệ số phƣơng trình hồi quy 58 Bảng 3.17 Kết xác định độ đúng, độ xác ngày khác ngày .59 Bảng 3.18 Hiệu suất chiết AM, LOS ACL (n = 6) 60 Bảng 3.19 Độ ổn định AM, LOS, ACL IS dung dịch chuẩn gốc (n = 6) 60 Bảng 3.20 Độ ổn định AM, LOS ACL huyết tƣơng (n = 6) 61 Bảng 3.21 Kết đánh giá ảnh hƣởng mẫu 62 Bảng 3.22 Kết đánh giá ảnh hƣởng mẫu tồn dƣ 63 Bảng 3.23 Kết đánh giá ảnh hƣởng việc pha loãng 63 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-37 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-38 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-39 Phụ lục 10 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hƣởng mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-41 Phụ lục 11 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hƣởng lƣợng mẫu tồn dƣ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-43 Phụ lục 12 Sắc ký đồ liệu khảo sát ảnh hƣởng độ pha lỗng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-44 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-45 Phụ lục 13 Chứng nhận phân tích chất chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-46 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-49 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-50 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-51 Phụ lục 14 Giấy xác nhận đề tài đƣợc triển khai ứng dụng thử nghiệm in vivo ngƣời tình nguyện Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... - Xây dựng quy trình chiết amlodipin, losartan chất chuyển hóa acid carboxylic losartan huyết tƣơng ngƣời - Xây dựng thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan chất chuyển hóa. .. losartan chất chuyển hóa huyết tƣơng kỹ thuật LC- MS/ MS Vì vậy, đề tài đƣợc thực với mục tiêu xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời amlodipin, losartan chất chuyển hóa acid carboxylic losartan huyết. .. chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN, LOSARTAN VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA ACID CARBOXYLIC LOSARTAN TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG KỸ THUẬT LC- MS/ MS Nguyễn Văn Trung Ngƣời