ây dựng quy trình định lượng virus viêm gan c bằng kỹ thuật real time RT PCR phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trị bệnh viêm gan siêu vi c

Đựa trên mong muốn có các cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn, năm 1991 Holland và cộng sự đã phát hiện chức năn

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

VIRUS VIEM GAN C BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME RT-PCR PHYC VỤ CHO VIỆC

NGHIEN CUU VA DIEU TRI

BENH VIEM GAN SIEU VIC

Chủ nhiém dé tai : DGS FS W6d Wuayah Shay Duong

Cơ quan : — Bộ môn Di truyền ~ Khoa Sinh học

Trường ĐH Khoa học Tự nhiên ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2005

1.4 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR, RT-PCR 1.5, Hóa chất thực hiện phắn ứng lai ELISA

1,6 Hóa chất cho phản ứng PCR và RT-PCR đánh dấu digoxigenin 1.7 Hóa chất cho phản ứng real-time RT-PCR

1.8 Thang DNA (Molecular Weight Marker) 2 Dung cụ ~ Thiết bị

3 Phương pháp

3.1 Phương pháp thiết kế primer-probe-amplicon

3.2 Phương pháp tách chiết RNA HCV 3.3 Phương pháp PCR, RT-PCR

3.4 Phương pháp PCR, RT-PCR đánh dấu với digoxigenin-dUTP 3.5 Phương pháp điện đi trén gel agarose

3.6 Phương pháp ELISA

3.7 Phương pháp real-time RT-PCR 3.8 Phương pháp xử lý thống kê

KẾT QUÁ - THẢO LUẬN

1 Thiét ké oligonucleotide

2 Kiém tra hoat dng cia cdc oligonucleotide

2.1 Hiệu quả nhân bản của cặp pämer RTHCVf-RTHCVr 2.2 Khảo sắt hoạt động của Taqman HCV

2.3, Khả nang lam ban mau (template) cia amplicon

3 Xay dung phan ting real-time RT-PCR định lượng HCV 3.1 Hoạt động của hệ prrner-probe-ampHicon trong phản ứng real-time RT-PCR

3.2 Khảo sát nồng độ MgCl;

3.3 Khảo sát nồng độ Taqman probe

3.4 Khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn (standard curve) 3.5 Khảo sát tính lặp lai cia phan ting real-time RT-PCR

3.5.1 Hệ số biến thiên n6i phan tng (intraassay variability coefficicent) 3.5.2 Hệ số biến thiên liên phần tfng (interassay variability coefficicent) 3.6 Khảo sát độ nhạy của phần ứng real-time RT-PCR

3.7 So sánh với SYBR Green I

4, So sánh quy trình định lượng HCV với quy trình định lượng HCV bằng bDNA

5, Đánh giá tại các cơ sở y tế

5.1, Xây dựng quy trình định lượng dưới dạng bộ kit thử nghiệm

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

22 25 26 28 31 31 33 34

TONG QUAN TAI LIEU

Bệnh viêm gan siêu vi là bệnh nhiễm trùng do nhiều loại virus có ái tính với tế bào gan gây ra Các loại virus này xâm nhập vào tế bào gan và gây ra nhiều biến đổi ở gan, nghiêm trọng nhất là phần ứng viêm (inflammation) và phản ứng hoại tử (necrosis) tế bào gan Bệnh viêm gan siêu vi C do virus viêm gan C (Hepatitis C

Virus - HCV) gây ra Hậu quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan Hiện nay trên thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm 3 đến 4 triệu người nhiễm mới Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ

chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó 10 đến 20% sẽ chuyển sang xơ gan

và 1 đến 5% sẽ chuyển thành ung thư gan HCV còn làm trầm trọng thêm bệnh

viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm Theo đánh giá của các chuyên gia thuộc Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan siêu vi C là một mối đe

dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau

HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con Hiện nay, chưa có vaccine để

phòng chống HCV do tính biến động di truyền cao của virus này

Bệnh viêm gan siêu vi C có thể được chữa khỏi với interferon kết hợp với ribavirin Tỉ lệ thành công thấp, khoảng 10 đến 20% khi dùng interferon và từ 30

đến 50% khi có kết hợp với ribavirin Tuy nhiên, việc điều trị với hai loại thuốc này rất tốn kém Ngoài ra, phan tng phy đi kèm với việc điểu trị bằng interferon và ribavirin đôi khi còn nghiêm trọng hơn tình trạng bệnh và thường làm xấu đi tình trạng bệnh sẵn có Việc điều trị chỉ được tiếp tục khi bệnh nhân có các dấu hiệu đáp ứng điểu trị thông qua các đấu hiệu về lâm sàng, sinh hóa, miễn dịch và trực tiếp

nhất là hàm lượng HCV trong cơ thể giảm xuống theo thời gian điều trị Ngoài ra, hàm lượng HCV trong cơ thể trước khi điều trị còn cung cấp các thông tín tiền đoán

(prognosis) giúp cho việc quyết định phương cách điều trị Nếu người bệnh nhiễm HCV genotype | và có hàm lượng HCV trong cc thể lớn hơn 2 triệu bắn sao trong 1 mì máu thì thời gian điều ưrị là 48 tuần thay vì là 24 tuần như các trường hợp khác

Để đáp ứng mục tiêu theo dõi hàm lượng virus, người ta đã phát tiển nhiều

phương pháp nhằm định lượng HCV Phương pháp PCR cũng được ứng dụng vào việc định lượng virus thông qua vật liệu di truyền của nó, điển hình là FCR định lượng cạnh tranh (competitive quantitative PCR) Phương pháp này là phương pháp bán định lượng (semiquantitation), dựa vào sự so sánh cường độ sắn phẩm PCR trên gel agarose của sản phẩm đích trên một sẳn phẩm nhân bản đồng thời có cường độ đã biết, thông qua sự so sánh đó, người ta suy ra được hàm lượng sản phẩm đích hay

néng độ virus có trong mẫu bệnh phẩm ban đầu Phương pháp này được sử dụng

rộng rãi trong các nghiên cứu định lượng các tác nhân gây bệnh Ứng dụng trong

thực tế lâm sàng ít, chỉ đừng lại ở dang kit ty chế (home-made) và chưa được chuấn

hóa cũng như chấp thuận bởi các cơ quan có thẩm quyền Vì việc đánh giá kết quả

dựa vào điện di trên gel agarose nên phương pháp này có độ biến thiên rất lớn giữa các kết quả Một phương pháp sinh học phân tử được phát triển cho định lượng virus

là bDNA Đây là một phương pháp phát hiện trực tiếp các tiểu thể virus thông qua

việc khuếch đại các tín hiệu buỳnh quang của phân tử lai Hãng Bayer Corp đã phát triển phương pháp này thành một bộ kit định lượng tự động hóa với thiết bị chuyên dụng Phương pháp bDNÑA đã được cơ quan quần lý Thuốc và Thực phẩm

của Mỹ (DA) chấp thuận để sử dụng vào chẩn đoán thường quy trên người Nhiều

nhóm nghiên cứu khi đưa ra một phương pháp định lượng virus dựa trên kỹ thuật real-time PCR cho HCV thường so sánh với bDNA Ở thành phố Hồ Chí Minh, bDNA là phương pháp đầu tiên được sử dụng cho định lượng HCV Ngoài bDNA, phương pháp PCR ELISA với các bộ kit định lượng HBV, HCV, HIV của hãng Roche Diagnostics cũng là một phương pháp khác được FDA chấp thuận cho lưu hành và được sử dụng trên thế giới Tuy nhiên, phương pháp định lượng này không

được sử đụng rộng rãi ở thành phố Hồ Chí Minh do nhiều nguyên nhân Ngoài hai phương pháp kể trên, còn có một số bộ kit miễn địch dùng định lượng các protein

của HCV nhưng không được sử dụng rộng rãi Cũng là một biến thể của PCR nhưng real-time PCR không những khắc phục được những nhược điểm của PCR định lượng cạnh tranh mà cả những nhược điểm của các phương pháp định lượng vừa kể

Đựa trên mong muốn có các cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng

dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn, năm 1991 Holland và cộng sự đã phát hiện chức năng 5”-3' exonuclease của taqg polymerase, 0ee (1993), Bassler (1995), Livak (1995) đã phát triển các loại mẫu đò có khả năng thực hiện phản ứng chuyển năng lượng huỳnh quang hay còn gọi là FRET (Fluorescent energy transfer) và cùng với sự phát triển về mặt thiết bị của các công ty như Perkin Elmer, Idaho Technologies, AcuGen đã góp phan vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là real-time PCR Một cách khái quát, trong phan tng real-time PCR nguti ta có sử dụng các tác nhân có khá năng phát buỳnh quang Các tác nhân này có thể 1A hda chat nh SYBR Green 1, Ethidium

bromide hay JA cdc mẫu dò (probe) có gắn chất phát huỳnh quang như fluorescein,

Tamra 6 hai dau mut Trong phần ứng, nếu có sự nhân bản của sắn phẩm đích thì

chất này sẽ liên kết với sắn phẩm đích và bắt đầu phát tín hiệu huỳnh quang Cường

độ của tin hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hầm lượng sắn phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của

mẫu vựơt qua đường tín hiệu huỳnh quang nên của phản ứng thì mẫu được xem là

đương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ

ngưỡng) để so sánh với một đường cong (standard curve) được xây dựng từ chu kỳ

ngưỡng của các mẫu chuẩn đã biết trudc ndng d6 san phẩm đích mà suy ra nồng độ sản phẩm đích trong mẫu thử nghiệm ban dau

Ngoài các mục tiêu khác, định lượng nucleic acid là ứng dụng đầu tiên khi xây dựng kỹ thuật này, Eink (1998) định lượng mRNA để nghiên cứu mức độ phiên mã của từng tế bào riêng rẽ, Bustin và McKay (1999) nghiên cứu sự phân bố protein trong các mô, Yajima (1998) định lượng các thành phẩn RNA của telomerase ở người Về ứng dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm thì càng ngày càng có nhiều công trình sử dung kỹ thuật này để định lượng các tác nhân gây bệnh nhằm phục vụ cho nghiên cứu và chẩn đoán Trên

đối tượng là HCV, các công trình sử dụng real-time RT-PCR nhằm định lượng virus này xuất hiện từ rất sớm như Martell (1996) và ngày càng nhiều Cho đến nay trên

thị trường đã bắt đầu xuất hiện các bộ kit thương mại như HCV COBAS TaqMan 48 ASR (Roche Diagnostics) hay HCV Quantitation ASR (Abbott)

Việc xây dựng quy trình real-time RT-PCR nhằm định lượng HCV trong để

tài nầy nằm trong xu thế chung hiện nay và đáp ứng các nhu cầu chẩn đoán thực tế

tại chỗ Việc có nhiều hãng bán hóa chất và thiết bị cho realt-ime PCR hiện nay ở

Việt Nam như Amersham Biosciences, Bio-Rad, ABgene, Perkin Elmer, sẽ là

một thuận lợi rất lớn cho sự phát triển phương pháp này vì ngoài định lượng, phương pháp này còn cho phép đáp ứng các nhu cầu khác trong chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi như xác định genotype, phân tích các đột biến kháng thuốc Sự tiện lợi, linh động (một loại máy nhưng làm được nhiễu chức năng), sự phổ biến, sự cạnh tranh

của nhiều công ty là một số ưu điểm của phương pháp này trên các phương pháp

khác có cùng mục tiêu

Với mong muốn phát triển một phương pháp mới có nhiều ưu điểm cộng với các nhu câu thực tế tại các cơ sở y tế có quan hệ hợp tác và nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài”Xây đựng quy trình định lượng virus viêm gan C bằng

kỹ thuật real-time RT-PCR phục vụ cho việc nghiên cứu và điều trị bệnh viêm gan siêu vị C”,

MỤC TIỂU DE TAL

Xây dựng một quy trinh dinh lugng HCV dya trén k¥ thuat real-time RT-PCR (real-time RT-PCR HCV) nhiim phuc vu cho viée nghién evu va diéu trị bệnh viêm gan siép vi C

NOI DUNG THUC HIEN

\ Thiết kế các hệ pruner-tagman probe-amplicon dùng trong phản ứng real-tne RT-PCR

2 Khảo sát hoạt động của các hệ oligonacleotide đã thiết kế về hiệu quả nhân bản,

độ đặc hiệu, khả năng lâm bản mẫu

3 Xay dung phdn ting real-time RKT-PCR HCV ; khảo sát néng dO MgCl2, Taqman probe, ndng dé c&p primer, hệ số tuyến tính của đường chuẩn, độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số biến thiên nội và liên phần ứng, so sánh vdi SYBR Green L

4, So sánh với phương pháp BỌNA

5, Đánh giá hiệu quả sử dụng thực tẾ tại cơ sở y tế

VAT LIEU ~ PHUONG PHAP

1 VAT LIEU SINH HOC

1.1 Primer-probe-amplicon

Tagman 5'6FAMact cac cgg tic cge aga cea cta tgg | 69,9°C 135-164

Một số hoá chất thông dụng khác : Tris HƠI, ethanol, acetone, Triton X-100

(Merck), diethylpyrocarbonate (Amersham Biosciences)

1.4 Hóa chất thực hiện phan ting PCR, RT-PCR

Ready-to-go RT-PCR bead (Amersham Biosciences) Ready-to-go PCR bead (Amersham Biosciences)

1.5 Héa chdt ding cho phan dng lai ELISA

B6 kit PCR ELISA DIG Detection (Roche Diagnostics)

1.6 Hóa chất cho phần ting PCR ya RT-PCR đánh đấu với đigoxigenin

Digoxigenin dUTP (Roche Diagnostics)

1 Hóa chất cho phan ting real-time RT-PCR

cDNA synthesis kit (Bio-Rad) IO supermix (Bio-Rad)

IO SYBR Green I (Bio-Rad)

18 Thang DNA (Molecular Weight Marker)

Thang DNA sử dụng là thang 100 bp (ABgene) và 50 bp (Fermentas)

Máy luận nhiệt (MỸ Research)

Máy luân nhiệt real-time iCycler (Bio-Rad)

Thiết bị điện đi : Bộ điện đi nằm, bộ điện đi đứng (Hoefer) Ly tâm eppendorf lạnh (Hermie)

Ban & nhidét khé (Fisher Scientific)

May lic (ika Labortechnik)

Máy chụp hình kỹ thuật số (Ơlympus) và bộ lọc tia UV (Kodak)

Tủ ấm Ổn nhiệt (Heraeus)

Máy vị tính (Việt Nam)

Máy rửa và máy doc microtiter plate (Tecan)

Một số dụng cụ thông dụng : Pipetman 8 kênh loại 200 yl (Gilson), pipetman

1Ô gi, 200 tì và 100Đ HÌ (BiohiO, tp 10 pl, 200 ul va 1000 HÌ có phin loc (Greiner), eppendorf 1,5 ml (Biopur - Eppendorf)

3 PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương pháp thiết kế primer-probe-ampiicon

Chúng tôi tải (download) tất cả các trình tự bộ gen HCCV hoàn chính (117) từ ngắn hàng đữ liệu NCBĨ (National Center for Biology Information) tai website www.nebLoim.nihgov va sau đó, tách riêng phan tinh tf nucleotide bằng phấn

mềm Annhyb Tất cá !17 trình tự bộ gen hoàn chính này bao gầm tất cả các

genotype HCV đã được phân loại cho đến nay Chúng tôi chia bộ gen HCYV thành

từng đoạn ngắn khoảng 50Đ nucleoHde và tiến hành việc so hang (alignment) tren

từng đoạn này của tất cả 117 trình tự với phần mềm ClustalX Dựa trên sự so hang, chúng tôi chọn ra các vùng bảo tổn trên bộ gen giữa cắc tất cả các genotype khác nhau cla HCV và bắt đấu tiến hành thiết kế các oligonucleotide Cac

oligonucleotide được thiết kế theo tiêu chuẩn đưới đây

Tránh các nueleotide lặp lại, nhất là G_| Tránh các nucleotide lấp lại,

không chứa hơn hai G hoặc C

Chọn mạch khuôn có nhiều C hơn G để | Kích thước sẵn phẩm PCR từ 30 -

Các olgonueleotde thiết kế được kiểm tra các đặc tính và được chỉnh sửa

cho phù hợp với yêu cầu bằng phần mềm OligoAnalyzer (DT)

3.2 Phuong phap tach chiét RNA HCV

Virus được ly gidi bing dung dich guanidinium thiocyanate, RNA virus được

với HạO đã xử lý bằng diethylpyrocarbonate RNA sau tách chiết được bảo quần Ở - 20°C cho tới lúc sử dụng

Chuẩn bị các dụng dịch

- Dung dich L6: Guanidinium thiocyanate (120 g), Tris HCL G1 M pH 64 (100 ml}, Triton X-100 (2,6 2), EDTA 0,2 M pH & 22 mb

Làm tan trong bổn ổn nhiét 6 60°C,

(100 ml), Lam tan trong bén én nhiét 4 60°C

- Dung dich silica ; Cho 60 g silica va HO edt hai lin (dd H.O) cho du 500

Hút bố 430 mì dịch nổi và thêm vào 600 HÌ HCI 10 N, trộn déu Hap khử trùng Cách tiến hành

Cho vào một eppendorf 1,5 mì 200 ti huyết thanh, 900 HÌ dung dich L6, 30 pal

3O giây Loại địch nổi Lặp lại bước này thêm một lần.

Cho I ml ethanol 70% vao Vortex vita di tan can silica Ly tam 13.000 v/p

30 gidy Loai dich néi Lap lại bước này thêm một lần,

Loại dịch nổi Để khô ở 60”C trong 10 phút,

trong 15 phút Ly tâm 12.000 víp 2 phiit, thu 80 jl dich nổi

Bao quan dich RNA tach chiét d -20° vai | pl RNase inhibitor {40 un]VU])

3.3 Phương pháp PCR, RT-PCR

cấp primer đặc hiệu và đÄH;Ô sao cho nỗng độ primer cuối cùng là 0,5 pM va thể tích phần ứng cuối cùng là 25 HÌ, 1 tến hành chạy phần ứng PCR như sau :

(Ta thay đổi tầy theo tác nhân)

Dich RNA tach chiết từ các tác nhân virus nhy HCV va virus Dengue dude

PCR), bể sung cặp primer đặc hiệu va ddH,0 (DEPC) sao cho néng dé primer cuối

trình PCR như trên

3.4, Phương pháp PCR, RT-PCR danh dan vdi digoxigenin-dUTP

Bổ sung Digoxigenin-dUTP vao các phản ứng PCR và RT-PCR (Ready-to-go

bản như bình thường

3,5, Phương pháp điện đi trên gel agarose

nạp vào giếng Điện đi ở 90 V trong 30 phút

Sau đó quan sát và chụp hình các sản phẩm PCR trên bàn đèn tử ngoại.

3.6 Phuong phap ELISA

Tron 20 gi sân phẩm đã đánh đấu đigoxigenin với 20 pl dung dich biển tính DNA Vortex nhẹ Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

Thêm vào 200 HÍ dụng dịch lai có chia probe pin biotin (probe HCV) Vortex nhẹ trong 10 giây, Cho tất cả 240 pil vào trong giéng cia microtiter plate (Streptavidin microtiter plate)

Đất microtiter plate vào máy lắc ổn nhiét Lac trong | gid d 55°C Hút bố dụng dịch trong các giếng,

Rửa các giếng với dung dịch rửa Thực hiện Š lần rửa,

Cho vào giếng 200 pl cng hop khang thé khang digoxigenin - peroxidase

Đặt microgter plate vào máy lắc ổn nhiệt Lắc trong 30 phut 637C Hut bd dung dich trong giếng,

Rửa các giếng với dung dich rửa Thực hiện 5 lần rửa

Cho vào giếng 200 pl dung dich ABTS và đặt vào máy doc ELISA, Ghỉ nhận kết quá sau 20 phút ủ có lắc trong máy đọc ELISA

3,7, Phương pháp real-dime RT-PCK

Đầu tiên RNA tách chiết Hừ các mẫu bệnh phẩm được chuyển thành cDNA

vdi bd kit cDNA synthesis kit (Bio-Rad) 6 42°C trong 30 phút

Sau dé, cDNA dude cho vio phan ting PCR real-time cho Taqman probe với bộ kh iQSupermix (Bio-RBad) hoặc PCRK SYBR Green I với bộ ki 1Q SYBR

Supermix CŒìo-Rad) và tiến hành chương trình luận nhiệt như sau

Việc phân tích các kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần

mềm iCycler phiên bản 3.0 (Bio-Rad) theo đúng các hưởng dan sử dụng

3.8 Phương pháp xử lý thống kê

So sánh độ tương quan của bai phương pháp bằng cách tính toán hệ số tuyến

tính Pearson giữa các cặp số liệu của các mẫu được đo đạc qua hai phương pháp

SNEY ERY ~ R ”

New -—ạ-) CE? = a}

Hệ số r nằm trong khoảng giá trị từ -Í đến 1,

r= -1: hai phương pháp hoàn toàn đối nghịch nhau

r =0; hai phương pháp không có tương quan với nhau

r= 1: hai phương pháp hoàn toàn tương quan với nhau,

Kiểm tra độ tìn cậy của hệ số tuyến tính bằng phân phối Student với n-2 bậc

tự do

Ae Ỷ tL~ 2,

Van at

Tra bảng phân phối Student với độ tín cậy œ lựa chọn từ 10% đến 99,9% được

tơ Nếu ©to thì bai phương pháp có độ tương quan (tày theo r) với độ tin cậy œ đã

chọn

10

KẾT QUÁ ~ THÁO LUẬN

1 Thiết kế các oligonncleotide

Đâu tiên, chúng tôi tập hợp các cặp priner và Tagman probe đã được sử dụng trong các công trình sử dụng kf thuat real-time RT-PCR nhằm định lượng HCV trước đó (chủ yếu là các công trình nước ngoài) rỗi sau đó tiến hãnh sàng lọc dựa trên các cơ sở dữ liệu về bộ gen của HCV cùng hệ thống phân loại các

Qua phân tích, tất cả các hệ prìmer-probe trong các công trình ở rên đểu

được thiết kế Ởở vùng 5' không mã hóa trên bộ gen HCV Tuy nhiên, các hệ

oligonucleotide trong các công trình trên không phù hợp với mục tiêu xây dựng phương pháp trong để tài này, Các hệ oligonucleotide được sử dụng cho miục tiểu định lượng bằng SYBR Green Ï như White (2602), Schroter (2001), Ratge (2000) Cac oligonucleotide trong cong trinh cla Schutter (2004) lại là kiểu probe đôi (hybridization probe) Day 1A kiểu phát huỳnh quang dựa trên FRET giữa hai probe sắt cạnh nhau, kiểu này hoàn toàn khác hẳn kiểu phát huỳnh guang do Taqman probe, Các công trình real-ime RT-PCR sử dụng kiểu phát huỳnh quang là Taqman probe như Martell (1997); Kleiber (2000) thì sắn phẩm nhân bản quá lớn, không thích hợp cho việc thiết kế một oligonucleotde lâm bản mẫu để xây dựng standard curve trong phương pháp real-time RT-PCR cla để tài này Vì thể, chúng tới tiến hành việc thiết kể mới các oligonucleotde

Chúng tôi tải 100 trình tự bộ gen hoàn chính của HCV từ ngân hàng dữ liệu NCBI (www.ncbinlmunih,gov) và sử dụng phân mềm ClustalX nhằm tìm ra các vùng bảo tồn trên bộ gen HCV của nhiều type khác nhau Trên các vùng bảo tân này chúng tôi thiết kế các primer-probe- -amplicon cho quy trình Các oligonucleotide dude thiét ké theo cdc nguyén tắc thiết kế primer-probe cho mot

i]

phần ứng real-ime RT-PCR (xem phần Vật liệu - Phương pháp) Bước đấu, chúng tôi kiểm tra đặc tính của các oligonucleotide trên lý thuyết bằng phần mềm

Oligo Trinh ty nucleotide Yị trí trên bộ gen HCY

Vùng bảo tần trên bộ gen HCV được chọn để thiết kế các oligonucleotide 1A

vùng 5' không mã hóa Theo các nghiên cứu, vùng 5'không mã hóa là vùng có tĩnh

báo tốn rất cao giữa các genotype của HCV, Qua khảo sát bằng nhân mềm ClustalX

trên nhiều trình tự bộ gen HCV, chúng tôi khẳng định kết luận trên Các oligonucleodde được thiết kế trong vũng này cổ thể phát hiện được tất cả các

genotype HCV đã được phân loại cho đến hiện nay

Hằng 3: Khảo sát đặc tính cia cde oligonculeotide thiết kế bằng phần mềm

OligoAnalyzer

Kết quá khảo sát bằng phần mềm OligoAnalyzer chó thấy các

oligonucleotide dat các yêu cầu đặt ra về Tm, thành phần % GC, các cấu trúc thứ

cấp (secondary stưuctre) Tm của probe cao hơn Tm cla primer tt 7-10°C, diéu

nay cho phép Taqman probe dé bat cdp vao mach khudn hun primer Nếu Tagman

probe khó bất cặp vào mạch khuôn sau khí primer bắt cặp thì sẽ không có hiện

tượng phái huỳnh quang do Tagman probe không bị thủy giải bởi chức năng 5š -3' exonuclease chia øa polymerase Cặp primer được thiết kế sao cho không có quả

nhiều G hoặc C ở gần đầu 3' nhằm tránh các trường hợp nhân bản ký sinh có thể

xây ra, Trong trình oy nucleotide ctia Taqman probe, thành phần C nhiều hơn G sé cho phép tín hiệu huỳnh quang do probe phát ra được phân biệt rõ hơn trên tín hiệu

nên của phản ứng Tagman probe không có G ở đầu 5` nên tránh được biện tượng

hấp thu ánh sáng huỳnh quang không mong muốn Thành phần % GC của primer và

prohbe nằm trong khoảng quy định từ 20-80%, Các cấu trúc thứ cấp như hairpm,

homoduplex, heteroduplex đếu có năng lượng tự do lớn hơn ~9kcal/mol và như vậy

không gây ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các oligonucleotide trong phan dng PCR,

Về lý thuyết, cdc oligonucleotide déu dat cdc yéu cau khi thiết kế Chúng tôi tiếp tục kiểm tra hoạt động của các oligonucleotide bằng thực nghiệm,

2 Kiểm tra hoạt động cha cac oligonucleotide

2.1 Hiệu quả nhân bản của cặp prùner RTHCVỆ.RTHCYVr

Trên vùng báo tổn đã chọn, chúng tôi thiết kế được cặp primer RTHCVÍf-

RTHCVr và Taqman probe 1A TaqmanHCV, Hiéu qua nhan bản của cặp prưner trên được khảo sát qua phần ứng RT-PCR với các mẫu huyết thanh đương tính và âm tính HCV (xác định bằng phương pháp bDNA và RT-PCR với hệ prưner JR13-

]R26-IR28) Kích thước của sản phẩm PCR từ cặp primer trên là 117 bp

`

Hình 1: Hiệu quả nhân bắn của cặp prùner RTHCVƒ-RTRHICYr 6: thang DNA; 1,11: mẫu chúng âm

2-5: mẫu huyết thanh dương tính HCV với ÍR13-JR26-JR2ã

7-10: mẫu buyết thanh dương tính HCV với RTHCVỆERTHCVr

Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy có một vạch với kích thước như

mong đợi khi so sánh với thang DNA {00 bp ở mẫu huyết thanh dương tỉnh trong khi không có tín hiệu tương tự Ở mẫu huyết thanh âm tính và mẫu chứng âm Không

thấy xuất hiện các vạch ký sinh Ở mẫu dương tính chứng tô cặp prtmer hoạt động đúng theo yêu cầu khi thiết kế,

Để đấm bảo cặp primer thiết kế chỉ nhân bản vật liệu đi truyền từ HCV,

chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng nhân bắn chọn loc (selective amplification) của cặp primer này trên vật liệu di truyền từ nhiều tác nhân khác nhau Các tác nhân này bao gốm các vi khuẩn như Sirep!oCOCCHS pneumoniae, Haemaphilts influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia cali, Staphylococcus aureus, Cac virus nhu Hepatitis B virus, virus Dengue, Human Papillomavirus va DNA người

13

Các tác nhân này được chọn là vì vật liệu di truyền của chúng có thể xuất hiện

cùng lúc với RNA HCV trong máu người bệnh và trong phần ứng nhân bản bằng

PCR Chúng tôi thực hiện hai loại phản ứng Một loại với cặp primer RTHCVE RTHCYVr và một loại với các cặp prưmmer đặc hiệu cho từng tác nhắn

Hình 2 : Kết quả điện di sẵn phẩm RT-PCR trên nhiéu logi DNA/RNA vet các

RTHCVƒ£-RTHCVr và các prừner đặc hiệu cho từng loại DNA/RNA

†: thang 100 bp; 2: mẫu chúng âm ; 3: kết quả KT-PCR trên RNA HCV

4,6,8,10,12,14,16,18,20: két qud PCR trén vdt liệu di truyén tx HBV, HPV, virus Dengue, nguoi, S pneumoniae, H influenzae, N meningitidis, E colt, 5 aureus val cap primer RTHCVE-RTHCVY

57,9, 01,13, 15,17, 19,21: kết quả PCR trên vật liệu di truyén ww HBY, HPV, virus Dengue, người, § pneumoniae, 0 influenzae, N meningitidis, E coli, 5, aureus với cde cap primer ddc hiéu loai

Kết quả điện di cho thấy, tín hiệu đương tính với cập priimer RTHCVE-

nhân khác cho tín hiệu ấm tính, Không có hiện tượng ức chế phần ứng PCR ở các

đếu cho kết quả đương tính Như vay, cap primer thiết kế chỉ nhãn bản RNA HCOV

này còn thể hiện qua trường hợp nhân bản RNA virus Dengue Vé mat phan loại học thì virus Dengue được xếp vào họ Flaviviridae Ho virus này bao gồm cả nhóm Hepacivrus mà HCV Tả một thành viên Điểu này có nghĩa là có sự tương đồng

trong vật liệu di truyền giữa virus Dengue và HCY, tuy nhiên kết quả âm tính với

cap primer RTHCVE-RTHCVr cang khẳng định tinh đặc hiệu của cặp primer nay

14

Hình 4: Kết quả ChustalX so sánh trình tự nacleotide giữa sản phém PCR từ cặp

prùmer RTHCVƑ-RTHCYF và bộ gen HCV trên GENBANE

# BLASTN 2.2.10 [octr-19-2004]

# Quan

# Gatabase: nr

Pie los: Query id, Subject fd, B identity, alignment Tenath, mismatches, yap

Két qua ClustalX cho thay trinh ty giải mã có độ tương đẳng cao với trình tự bộ gen công bố trên GENBANK tại vùng 5 không mã hóa trên bộ gen HCYV Ngoài ra, kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng Blast cũng khẳng định rằng trình tự sản

phẩm PCR chi duge fim thdy & HCV Nhu vay, san phẩm PCR từ cập primer

PFTHCVf-RTHCVT là hoàn toàn đặc hiệu cho HBV trên đúng vùng trình tự đã chọn, 2.2 Khảo sắt hoạt động của TaqmanHCV

Sau khi đã khảo sắt hoạt động của cặp pruner RTHCVERTHCVI, chúng tôi

mới kháo sắt tiếp tạc hoạt động của TaqmanHCV Trên lý thuyết, TagmanHCV đặc

hiệu cho HCV và hoạt động tốt trong phản ứng lại phân tử Chúng tôi kiểm chứng đặc tính trên bằng 2 thí nghiệm lại trên microtiter plate theo nguyên (tắc của kỹ

thuật ELISA Thí nghiệm đầu tiên, chúng tôi sử dụng các mẫu huyết thanh dương tính và âm tính HCV đã biết, nhân bản trong phần ứng RT-PCR có đánh đấu với digoxigenin va tién hanh lai với TaqmanHCV Trên nguyên tắc, nếu TagmanHCV hoạt động tốt thì các mẫu huyết thanh dương tính HCV sẽ cho kết quá ELISA đương tính và ngược lại kết quả ELISA âm tính ở những mẫu huyết thanh âm tính HCV,

Bảng 4: Kết quả ELISA khảo sát hoại động của TagmanHCV

Theo nguyến tấc của kỹ thuật ELISA thì mẫu đương tính là mẫu có trị số

OD jsy sau khi trừ đi trị s& OD go cla mau trang (blank) dn hon 0,1 đơn vị và ngược

lại mẫu âm tính là mẫu có hiệu số đó nhỏ hơn 0,1 đơn vị Như vậy, các mẫu huyết

thanh dương tinh HCV đều có tín hiệu ELISA đương lính và ngược lại các mẫu

huyết thanh âm tính có tín higu ELISA ấm tính,

Thí nghiệm lai bằng ELISA thứ hai được tiến hành bằng cách lai các sẵn phẩm PCR có đánh dấu digoxigenin từ nhiều tác nhân khác nhau (tương tự như phần

khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của cặp primer) với TaqmanHCy

lồ

Bảng 5: Kết quả ELISA khẳng dinh tinh ddc higu cia TaqmanHCV

Kết quả lai cho thấy, chỉ có sản phẩm PCR từ HCV mới cho kết quả ELISA

dương tính, Như vậy qua hai thí nghiệm lại cho thấy TagraanHCV hoạt động hiệu

quả như mong muốn,

2.3 Khả năng làm bản mẫu (template) của amplicon

Amplicon là đoạn trình tự nucleoHdc nằm giữa cặp primer RTHCVE-

RTHCVr va được sử dụng lâm bản mẫu cho phần ứng RT-PCR với cập primer trên Chúng tôi sử đụng arnplicon nhằm tạo ra các mẫu có nông độ bắn sao HCV đã biết

nhằm xây dựng đường chuẩn (standard curve) trong phan tng real-time PCR Chúng tôi tiến hành khảo sdét khd ning nhin ban amplicon bằng cap primer

RTHCVf-RTHCVr nhằm khẳng định rằng không có sự khác biệt nào về khả năng

lãm bản mẫu trong phần ứng RT-PCR giữa trink ty RNA HCY và trình tự nucleoude

pond, wad

Ua ESET SOAS EE, 4 Bade PERE LATIN CTE 2-5: mẫu huyét thanh HCV duong tinh

7-10; dmphcon HC

Kết quá cho thấy, sản phẩm PCR của các mẫu huyết thanh đương tính HCV

và của amplicon la như nhau cả về cường độ tín biện, kích thước nucleotide và không có sẵn phẩm ký sinh Như vậy, amphcon đã thiết kế hoàn toàn có khả năng

lam ban mau trong phan ting real-time RT-PCR

3 Xây dựng phản ứng real-time RT-PCR dinh lugng RCV

3.1 Hoại động của hệ prùHer-probe-amplicon trong phan ting real-time RT-PCR

tycle

Ninh 7: Phần ứng real-time RT-PCR vdi cdp primer RTHCV]-RTHCVr,

TaqmanHCy, ampliconHCV Ä: Amplicon HCV và mẫu huyết thanh dương tình HCV

B: Mẫu huyết thanh âm tink HCV

Hé primer-probe-amplicon hoat động tốt trong phan ting real-time RT-PCR được biểu hiện qua các đường tín hiệu huỳnh quang theo nguyên tác Mẫu huyết thanh ẩm tính HCV và mẫu nước cất có đường tín biệu huỳnh quang năm dưới

đưỡng tín hiệu nên Mẫu huyết thanh dương tính HCV và mẫu amphconHCV có

đường tín hiệu vượt đường tín hiệu nền Không có các đường tín hiệu khác lạ và

kết quả như trong hình 7 hoàn toần giống kết quả của một phan tng real-time RT-

PCR thông thường

3.2 Khao sdt néng dd MgCl,

Trong phản ứng PCR, MạC|; là một nhân tố quan trọng vì nó là đồng yếu tổ

(co-factor) cần thiết cho sự hoạt động của hầu hết các DNA polymerase MẹCh; kết hợp với cdc nucleotide, oligonucleotide dé bién ching td thanh dang ma Tag

polymerase sử dụng trong phần ứng kéo đãi mạch mới từ mạch khuôn Nếu nống

18

WA EVAR 19 Huns Pua ike Ft Cí( XE? bak Me LE pura tí GH LUE LLL Ue YUE

cho cau tric mach déi Ngodi ra, MgCl, cao cling dn định các cấu trúc bắt cặp không đặc hiệu của primer, tạo ra các sản phẩm ký sinh, Nếu MẸCh ở nắng độ

thấp, phấn ứng nhân bản sẽ giảm hiệu quả hoặc mất hẳn hiệu quả nhân bản Trong

các phân ứng nhân bản, nông độ MẹC; đao động từ 1,5 mM đến 5 mM Phần ứng

real-time PCR that chat cũng là một loại phán ứng nhân bản nên cũng tuân theo

các nguyên tắc về nẵng độ MẸC|; trong phần ứng nên chúng tôi tiến hành khảo sắt

nhằm tìm ra nông độ MẹCh; tối ưu cho phân ứng Chỉ tiêu đánh giá phần ứng là Ct

Chúng tôi khảo sát các nông độ MạCh khác nhau ởi từ 1,5 mM đến 5 mM vdi don

vị tăng là Ó,5 mM trên cùng một mẫu huyết thanh đương tính HCV Nỗng độ cho Ct

nhỗ nhất là nông độ tối ưu được chọn cho quy trình, Thí nghiệm được lấp lại ba lần

và kết quả được trình bày trong hình

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490

2 :Mau huyét thank duong tinh voi ndng dé MgCl 1, SmM

3: Mau huyét thanh duong tinh vdi néng dé MgCl, 3,5mM

4: Mu huyét thanh duong tink voi néng dd MgCls SmM

Kết quả cho thấy, phản ứng real-ime RT-PCR với nông độ MẸCl; cho chu

kỳ ngường thấp nhất (Ct trung bình là 25,3) Các nống độ MpgChạ khác cho Ct cao hơn nỗng độ 3,5 mM hodc không xác định được Ct Kết quả này cũng tương tự như kết quả trong các nghiên cứu có sử dụng phân ứng real-irae PCR Chúng tôi chọn nống độ MẸCh; là 3,5 mM cho tất cà các phần ứng về sau,

19

O93, AY SHE 11011 QỰ J Guin Pave

Theo các nghiên cứu, nồng độ Tagman probe trong phân ứng real-ime PCR

đạo động trong khoảng 100 nM từ 500 nM Cũng giếng như MẸCI;, nếu nỗng độ

Taqman probe quá thấp thì tín hiệu huỳnh quang không đủ để phản ánh chính xác

hàm lượng nucleic acid có trong phần ứng, còn nếu quá cao thì gây lãng phí, hơn

nữa có thể gấy ảnh hưởng xấu đến phản ứng, Vì vậy, chúng tôi các nổng độ

TagmanHCV đi từ 100 nñM đến 500 nM với đơn vị tăng là SỐ nM nhằm tìm ra nồng độ TagmanHCV thích hợp Nguyên tắc của thí nghiệm tương tự như phân khảo sát nống độ MgCh; Thí nghiệm được lặp lại 3 lẫn kết quả được trình bày trong hình

Kết quả cho thấy, nẵng độ TagmanHCV là 300 nM là thích hợp nhất vì với

nông độ này Ct là nhỏ nhất (25,1) Trong các công trình nghiên cứu khác, nồng độ

Tagman probe được chọn cũng nằm trong khoảng 100 nM đến 500 nM, 3.4 Khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn (siandard cưrve)

Giống như các phương pháp định lượng khác, phương pháp định lượng bằng

kỹ thuật real-time PCR cũng cần một đường cong nồng độ chất chuẩn mà dựa vào

đó sẽ suy ra được nống độ hoặc hàm lượng của chất trong các mẫu thử, Trong 20

UU tin" SERSLER SUIS FU ¥ 1d i1 RY EERMAL POG BAMBI, G4 Le Qq PRIMES pháp để xây dựng đường chuẩn Người ta có thể sử đụng các mẫu huyết thanh

dương tính HCV có nống độ đã biết thông qua các phương pháp định lượng khác nhu bDNA hodc ELISA (b6 kit HCV quantitation ~Roche Diagnostics) MOt céch

khác là cẩu trúc nến một vector trong đó có chứa đoạn trình tự HCV cần nhân bản

ri sau d6 tiến hành phiên mã đoạn trình tự này, thu nhận và định lượng đoạn RNA bằng phương pháp đo mật độ quang hoặc đếm phong xa (stincillation counting) Hai cách này được sử dụng rộng rãi không chỉ ở kỹ thuật định lượng bằng real-ime

trên HCV mà còn trên nhiều tác nhân virus khác vì cho đến hiện nay người ta vẫn chưa thành công trong việc nuôi cấy HCYV trên bất kỳ một mô hình tế bào động vật

nao

Hệ số tuyến tinh (correlation coefficient) 1A mét tiéu chudn để đánh giá độ

chính xác của một đường chuẩn Nó được xây đựng đựa trên chủ kỳ ngưỡng

(threshold cycle) cla các nồng độ chuẩn Hệ số này nằm trong khoảng từ 0 đến I

Hệ số tuyến tính của đường chuẩn càng cao thì sự định lượng dựa trên đường chuẩn

càng chính xác So sánh với các phương pháp định lượng khác cũng sử dụng đường

chuẩn như PCR ELISA, bDNA thi real-time PCR có độ tuyến tính trên một đấy nống độ lớn hơn, 8 nông độ pha loãng bậc 10 so với 3, 4 nỗng độ pha loãng bậc 10, độ tuyến tính trên đấy nông độ rộng cho phép đánh giá chính xác về động học của

sự nhiễm virus ở bệnh nhân theo thời gian Điều này sẽ giúp cho việc điều trị có

hiệu quả hơn cũng như cung cấp nhiều thông tin hơn cho việc tìm hiểu và nghiên

cứu bệnh Thông thường, trong phản ứng real-dtine PCR, người ta thường sử dung 5

nẵng độ bắn sao vữuns từ 10” đến 10” bản sao trong một phản ứng để xây dựng

đường chuẩn và hệ số tuyến tính của đường chuẩn nằm trong khoảng từ 0,99 đến 1, Trong để tài này, chúng tôi khảo sát đường chuẩn được xây dựng từ § nỗng độ bản sao HCV tir 10’ dén 10%

Standard Curve Graph for FAM-490

Kinh 10: Putng chudn cia phdn ing real-time RT-PCR

IU CUM GU bit DU UY CH LE Bot oe Ee) O ROU UP CU a

sao HCV trong một phần ứng Hệ số tuyến tinh nay là tương đương với hệ sế tuyến tính trong các công trình trước đó (liệt kê ở bảng 1)

3.3 Khảo sát tính lặp lại của phần ting real-time RT-PCR

Tỉnh lặp lại của mội thí nghiệm thể hiện độ tin cậy của thí nghiệm Tĩnh lặp lại càng cao thì độ tún cậy càng cao Tính lặp lại của phản ứng real-time RT-PCR

được biểu hiện qua hệ số biến thiền (variabiliy coefficienQ gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phân ứng Hệ số biến thiên càng thấp thì tính lấp lại

càng cao Biến thiên liên phần ứng là độ biến thiên được đo đạc thông qua việc lập

lại phần ứng vào các thời điểm khác nhau và ghi nhận sự sai khác giữa các thời

điểm Biến thiên nội phản ứng làđộ biến thiên được khảo sát bằng cách đo đạc sự

sai khác của các phản ứng diễn ra vào cũng một thời điểm Yếu tế để dựa trên đố

để đánh giá sự sai khác ở đây là chu kỳ ngưỡng

3.5.1 Hệ số biến thiên nội phần ứng (Gintraassay variability coefficicent)

Chúng tôi khảo sát hệ số biến thiên nội phần ứng bằng cách tiến hành phan

ứng trên đường chuẩn gồm 5 nồng độ từ 10° đến 10” bắn sao amplicon va phan ting trên đường chuẩn được lập lại 5 lần

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 400

Log Starting Quantity, copy number

Nĩnh 11: Hệ số biến thiên nội phản ing trén ede mau amplicon wt 10° dén 10"bén sao 1: Amplicon HCV vdi néng dé 10’ copies

2: Amplicon HCV vdi néng dé I capies

3: Amplicon HCV voi néng db 10° capies

4: Amplicon HCV với nẵng a8 10’ copies

5: Amplicon HCV với nẵng độ 10’ copies

Bang 6: Chu ky ngưỡng của các nềng độ của đường chuẩn

3.5.2 Hệ số biến thiên hiên phần ứng (interassay variability coefficicent)

ba tos

%+318H2 KH LH CH 4GL1111© IL4MN HC (GiE (UCHIÁ COMA Vi) wf PURER A CE EP CE GE

10° ban sao amplicon, phan ting nay được lập lại 5 lan vào 5 thời điểm khác nhau

để khảo sát hệ số biến thiên liên phấn ứng

a

2 tổ a 10s sa starting Quilty, coy manber 10 4 5 5 19 ? ỹ

Hinh 12: Hé s& bién thién lién phan tng trin cde mau amplicon tx 10' dén 10’bdn sao

Bảng 8: Chu kỳ ngưỡng của các nông độ của đường chuẩn

YOY 67 SU DICH URUBR UCL pias Uli Gila Pat Be Le Mine EV KT E XLÉN ĐĂNG Y

nằm trong khoảng từ 1,9 đến 6,1 So sánh với các công trình đã liệt kê ở bảng Ì thì hệ số biến thiền nội phần ứng trong đề tài là tưởng đương

3.6 Khảo sát độ nhạy của phản ứng reaL-‹dme RT-PCR

Độ nhạy cúa phản ứng RT-PCR một bước thường vào khoảng 10° ban sao virus trong 1 mi m4u, Phan ng real-time RT-PCR si dung chu kỳ ngưỡng làm yếu tổ để phái hiện sự có mặt hay không của tấc nhãn gây bệnh và vì chu kỳ ngưỡng rơi vào pha lũy thừa trong phản ứng nhân bản nên trên nguyên tắc phản ứng real-

time RT-PCR có độ nhạy cao bơn hoặc bằng với độ nhạy ở trên Chúng tôi phá

loãng amplicon thanh các nễng độ từ LŨ? đến 10 bản sao HCV trong Ì mÌ nước và uén hanh phan tng real-time RT-PCR trên các nồng độ này để khảo sát độ nhạy

của phản ứng, Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết quả được trình bày trong hình

san

PCR Amp/Cycle Graph for FAM-499

620

© sm ah

8 40D % s 330

#

8 2Ð

s & lũo0

Hình 13: Khảo sát độ nhạy của phân ứng real-time RT-PCR HCV

123.45 6 7.8: Amplicon HCV lần lượt với các nông độ 10’ copiesémil, 10 capies/ni, & 10 copies/ml, I copies/ml, UP copies/ml, | copies/ml, 10’ copies/ml O capiesAnl

9: Mẫu chúng âm

26

Kết quả kháo sát độ nhạy sau 3 lần lặp lai cho thay, phan tng real-time RT-PCR

HCV có khả năng phát hiện đến 10Ì bản sao HCV trong 1 mÍ máu Khả năng này

là tương đương với các công trình nghiên cứu cing cha dé

3.7 Sa sánh với SYBR Green ï

Trong 4 kiểu real-ime PCR thông dụng : SYBR Green | T aqman probe, Molecular beacon, Hybridisation probe thi hai ki€u phat huynh quang SYBR Green 1 và Tagman probe được sử dụng nhiều nhất trong việc định lượng các tác nhân pầy bệnh ở người, Hai kiểu sau it dude sử dụng do sự phức tạp khí thiết kế các

ohgonucleoude Sự phức tạp này là do yêu cầu của phương pháp đôi hỏi phải có

tính đặc hiệu rất cao Tính đặc hiệu rất cao này đặc biệt phù hợp với những mục

tiêu như phân tích các đội biển, những đa hình chỉ sai khác nhau cho đến 1

nuclconide Trong khi đó, yêu cầu về định lượng các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm lại không khất khe đến như thế Ưu điểm của SYBR Green 11a không cần phải thiết kế mẫu dò đặc hiệu cho từng tác nhân nền nó có thể được sử

dụng rộng rãi cho hàng loạt tác nhân khác nhau, hay nói cách khác việc xây dựng phan ứng realL-dme PCR với SYBR Green Ï sẽ đễ đăng và nhanh chóng, đễ triển

khai từ tác nhần này sang tác nhãn khác Tuy nhiên, ưu điểm này cũng chính là nhược điểm Vì không có mẫu dò đặc hiệu nên nếu xuất hiện sản phẩm nhân bản

ký sinh trong phản ứng thì kết quả định lượng sẽ không còn chính xác Trong khí

đó cần phải thiết kế từng mẫu dò đặc hiệu cho mỗi tác nhân trong phương pháp real-time PCR vdi (agman probe, Việc này mất thêm thời gian so với SYBR Green ï và chậm triển khai trên nhiều tác nhân, Tuy nhiên, tính đặc hiệu của phản ứng sẽ

tăng lên, dẫn đến tính chính xác cũng tăng lên tương ứng Chúng tôi tiến hành song

song cả hai phương pháp real-ume PCR này để đánh giá ưu điểm của Tagman

probe trên SYBR Green Ï Thí nghiệm so sánh được tiến hành trên các nồng độ

= „ - LÊN > ty)? Nằ- ÑN ) L - —g

s*

với xi và yi là từng cặp số liệu chu kỳ ngưỡng của từng mẫu được khảo sát bằng hai

phuong phap SYBR Green I va Taqman probe,

28

MCU H1 H UU LUE Ly Old BY OU LMU Ua Mia ad pul pli vay

phân phốt Student với n-2 bậc tự đo

Tra bằng phân phối Student với 23 bặc tự do và độ tin cậy Ở mức 99,99% thi tơ là 3,767 Vậy t> tơ, Chúng tôi có kết luận hai phương pháp này có độ tương

quan rất cao (r = 0,98) với độ tin cây là 99.9%,

Khi phan tich dudng cong nong chay (melt curve) của các phản ứng PCR sử dung SYBR Green ÏI thì chúng tôi thấy có sự xuất biện của các peak lạ, tức là

những peak khác với peak của sẵn phẩm nhân bản với cặp prmer RTHCVE-

RTHCVr, Những peak này do những sẵn phẩm ký sinh gây ra (primer dimer hoặc sản phẩm do sự bất cặp không đặc hiệu của cấp primer) Do đó, tín hiệu huỳnh

quang được thể hiện qua Ct không chỉ là của sản phẩm đích mà còn bao gầm các

sản phẩm ký sinh khác và như vậy không thể xác định chính xác hầm lượng thật sự

của sản phẩm dich ong phan tng real-time PCR Trong khi d6, tin hiéu huỳnh

quang thu nhận được từ Tagman probe phản ánh chính xác hầm lượng sẵn phẩm

dich vi Taqman probe chỉ bất đặc hiệu vào sẵn phẩm đích, từ đó mới phái tín hiệu

huỳnh quang, các sản phẩm ký sinh khác nếu có thì cũng không phát tín biện

huỳnh quang Nhược điểm này của SYBR Green I có thể được khắc phục bằng cách thiết kế cập primer "hoàn hảo”, không tạo ra bất kỳ sản phẩm ký sinh nào

trong phản ứng nhàn bản, Nhưng trên thực tế, khi thiết kế cặp primer cho phần ứng

PCR thì rất khó để tạo ra nhưng cặp primner hoàn hảo như vậy và cũng không cẩn

thiết nếu sản phẩm ky sinh 1A cdc primer dimer

Trong những mẫu (nông độ amplcon) mà qua phân tích đường cong nồng chiy không thấy có sự xuất hiện của các sản phẩm ký sình thì có độ tương đồng

cao về Ct với những mẫu sử dụng Tagman probe Điểu này cho thấy nếu như

không có hiện tượng ký sinh thì SYBR Green Ï sẽ là một biện pháp thuận lợi nhất

dé tién hanh phan ing real-time PCR

4 So sánh quy trình định lượng HCY với quy trình định lượng HCV bằng bDNA

Trên thực tế, để định lượng HCV nhằm cho mục đích điều trị người ta sử dụng phương pháp bDNA (Bayer Corp.) hoặc bộ kít định lượng HCV bằng PCR

ELISA (Roche Diagnostics) Day là những bệ ku đã được cơ quan Quần lý Thuốc và Thực phẩm (FDA) của Mỹ chấp thuận cho việc ứng dụng chẩn đoán trên lâm

sàng Hiện nay ở thành phố Hồ Chí Minh, ngoài những bộ kít định lượng tự sẵn xuất (home-made) thì phương pháp được sử dụng rộng rãi là bDNA với bộ ki

Versant™ HCV RNA 3.0 assay & Trung tam chấn đoán Y Khoa Hòa Hảo (Medic) Trong thời điểm hiện nay, chúng tôi tạm ding bd kit nay như một tiêu chuẩn vàng

để so sánh với quy trình xây dựng trong để tài này Chúng tôi tiến bành trên 32 mầu huyết thanh và kết quá được trình bày nhữ sau

SHANE Lie 30 SARK PUG NA PNUORY PHAP BLIINA VE reqL<HUI€ £Cỉ «PC

dựng trong để tài là tương đương với “tiêu chuẩn vàng” là bDNA ở mức độ cao với

độ tin cậy là 99,9%, Trong công trình của Martell và cộng sự (1997), khi so sánh hai phương pháp real-tme RT-PCR và NGIĨ thì hệ số tuyển tính giữa hai phương

pháp này là 0,819 với độ tin cây là 99,9%, hệ số tuyến tính giữa hai phương pháp

real-time RT-PCR va bDNA là 0,725 với độ tin cậy là 95%, Trong một công trình

khác, Barbeau (2004) cho thấy hệ số tuyến tính giữa hai phương pháp real-ime

RT-PCR va PCR ELISA (Amplicor monitor HCV test — Roche Diagnostics) là 0,8898 với độ tìn cậy là 99% Cũng giống như bÖNA, bộ kit “Amplicor monitor

HCV test” được FDA chấp thuận cho việc chẩn đoán định lượng HCV trên người

và được xem là một tiêu chuẩn vàng trong so sánh phương phấp mới White (2002) cho thay hé s6 tuy@n tink gifa real-time RT-PCR va “Amplicor monitor HCV test” là 0,876 vdi độ tin cậy là 99,9%, Nhìn chung, quy trình của chúng tôi cổ sự tương quan rất cao với tiêu chuẩn vàng trong định lượng HCV

Chúng tôi có một số nhận xét khi so sánh giữa hai phương pháp định lượng - Phương phấp bDNA có các ưu điểm so véi real-time RT-PCR Quy trình định lượng hoàn toàn tự động từ bước xử lý mẫu huyết thanh ban đầu cho đến bước

xuất kết quả Với thiết bị thực hiện phan ứng bDNA mới nhất hiện nay tại Medic là

Bayer® System 340 BDNA Analyzer, người ta có thể tiến hành đẳng thời trên 168

mẫu huyết thanh trong thời gian chỉ có 4 đến ã giờ, Phương pháp bÒNA là một

phương pháp đã được chuẩn hóa và được công nhận rộng rãi Các phiên bắn trước diy cia Versant ™ HCV RNA 3.0 Assay chi duce sứ dụng cho nghiền cứu nhưng với phiên bản nây, cơ quan EDA của Mỹ đã chấp thuận cho sử dụng trong việc chẩn đoán định lượng trên người Đây cũng là một tiêu chuẩn vàng mà dựa vào đó

Gt SO SAU TOL DNUOUR Dap Ui Te TIN VY THÓI, UU Ady UE Va Utd Vit GIII đoán thường quy

- Ngược lại, bDNA cũng có các nhược điểm khi so sánh với real-tine RT-

PCR Độ nhạy của bDNA hiện nay là nhược điểm đầu tiên Ngưỡng phát hiện HCV

thấp nhất của bDNA là 7 x 10Ỷ bản sao HCV trong ¡ mÌ máu Tuy nhiên ngưỡng

phát hiện này còn quá cao so với một số kỹ thuật Sinh học phần tử dũng trong chẩn

đoán HCV như RT-PCR, lai phân tử, RT-PCR ELISA Ngưỡng phát biện thấp như

vậy sẽ không cho phép các bác sỹ đánh giá chính xác lĩnh trạng bệnh cũng như đáp

Ứng điều trị ở bệnh nhân Kỹ thuật real-time RT-PCR trong để tài này cho phép

phát hiện dén 101 bdn sao HCV trong 1 mi máu, Nhược điểm thứ hai là giả thành

Sơ bệ tính toán cho thấy, giá của một xét nghiệm định lượng HCV bằng bDNA rất

cao, gấp khoảng từ 2 đến 3 lần xét nghiệm định lượng bang real-time RT-PCR

Phương pháp bDNA chỉ cho phép định lượng HCV trên kiểu bệnh nhẩm là huyết

tương (plasma) hoặc huyết thanh (serum) trong khi với kỹ thuật tách chiết RNA

trong quy trình real-diine RT-PCR HCV chúng tôi có thể tiến hãnh trên cá mẫu sính thiết gan Ngoài ra, theo hướng dẫn của bộ kit DONA, nếu hàm lượng protein tổng

sổ lớn hơn 9 g/100 mi huyết thanh, hầm lượng bilrubin lớn hơn 10 mg/100 mì huyết

thanh thì tính chính xác sẽ bị giảm đi, thường là hầm lượng HCV định lượng nhỗ

hơn hàm lượng thực tế Như trên nhược điểm này có thể được để đàng loại bỏ với

kỹ thuật tách chiết RNA theo Boom và cộng sự (1990) như trong quy trình Cuối

cũng, bộ kit hiện nay chỉ cho phép định lượng HCV với các genotype la, 1b, 2a, 2b,

3a, 4a, 5a và 6a, trong khi đó, cặp pdimer RÝŸHCVEf-RTHCVr được thiết kế ở vùng bảo tên trên bộ gen của HCV gitta cfc genotype cla HCV đã được phân loại và

giải mã trình tự nucleotide cho đến nay, Điều này cho phép việc định lượng trên tất cd cdc genotype HCV cho đến nay

Mặc đồ cô các du điểm như trên nhưng vấn đề lớn nhất của phương pháp

định lượng các tác nhãn gây bệnh ở người dựa trên kỹ thuật real-time PCR nói

chung vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện, chưa được chấp thuận bởi các cơ quan có thấm quyền và vì thế chưa được thương mại hóa rộng rãi

đưởi đạng các bộ kí Vì vậy, việc chuẩn hóa (standardizauon) là cần thiết để mau chóng đưa chúng vào ứng dụng trong thực tế,

5 Đánh giá tại các cơ sử y tế

Ÿ.f Xây dựng quy trừnh định lượng dưới dạng bộ kit thi nghiệm

Chúng tôi tiến hành các bước ổn định các kỹ thuật trong quy trình, pha chế các hóa chất dưới đạng sử dụng ngay (ready-to-go), soan thảo bảng hướng dẫn sử dụng bộ kit di kém, nghiên cứu các phương pháp, điều kiện bảo quản, đóng gói

đưới dạng bộ kí và chuyển giao cho các cơ sở y tế để đánh giá hiệu quả sứ dụng

Giá thành ước tỉnh cho một phản ứng khoảng 1§0 000đ8VN.

Hình 16: Bộ ki định lượng HCV thử nghiệm

Nếu người sử đụng đáp ứng các yêu cầu trong bằng hướng dẫn sử dụng thì bộ kit thử nghiệm định lượng HCV có thể được bảo quản và hoạt động tốt trong

thời gian là 6 tháng, Đây cũng là thời gian mà đa số các bộ kH thương mại để nghị

Cơ sở y tế chúng tôi chọn để đánh giá bộ ki thử nghiệm định lượng HCV là

phòng thí nghiệm Y sinh thuộc trường Đại học Y dược Thành phố Hỗ Chỉ Minh Số lượng mẫu thứ nghiệm thực tế là 500 mẫu (phụ lục 22) Trong số đó, trên 30 mẫu bệnh phẩm được định lượng bing quy trinh real-time RT-PCR HCV, nhém

nghiền cứu của PTN Y sinh cũng tiến hành các xét nghiệm khác như chẩn đoán

lâm sàng, miễn dịch, sinh hóa nhằm có đánh giá chung về quy trình rela-ime RT-

PCR H©CV (phụ lục 23)

Theo bản đánh giá cho thấy quy trình dưới đạng bộ kit có chất lượng ổn định

giữa các lô hóa chất, độ nhạy tốt (ngưỡng phát hiện đến 10), phạm vi do chính xác rộng, kết quả thu nhận được từ quy trình định lượng phù hợp với bệnh cảnh lâm sàng

Sand Sk

KET LUAN

Bé primer-Taqman probe - amplicon thiét k@ cho phan tng real-time

RT-PCR định lượng HCV họat động tốt, đặc hiệu và nhạy

Ô Äiột sổ điều kiện cần cho họat động hiệu qua cita phan itng real-time RT-PCR nhu néng dé MeCl, la 3,5 mM, nẵng dé Taqman probe la 300 nM

, Gác đặc tính của phần tng real-time RT-PCR nhu hé sé bién thién adi

phần tứng là 0,76-2,05, liên phân ứng là 1,9-6,1 và độ nhạy là 10° ban

sao HCVII mỉ mâu ; phù bợp với các công trình dé công bố

Ô Quy trình được sử dụng trên S00 bệnh phẩm tại hai cơ sẽ y tế về cho thấy có thể sử dụng được cho chẩn đóan định lượng HCV trong huyết

thanh

TAI LIEU THAM KHAO

Tiếng nước ngoài

1 Peter A White et af, 2002 Quantification of hepatitis C virus in haman liver and serum samples by using LightCycler Reverse transcriptase PCR Journal of clinical microbiology 4@ (1 1):4346-4348

2 Christian G Schuttler ef al 2004 Variable ratio of Hepatitis C virus RNA to viral

core antigen in patient sera Journal of clinical microbiology 42 (5), 1977-1981

3 Matthias Schroter ef al 2001 Quantitative detection of Hepatitis C virus by LightCycler PCR and comparision with two different PCR assay Journal of clinical microbiology 39 (2): 765-768

4 Dieter Ratge et al 2000 High-speed detection of blood-borne hepatitis C virus RNA by single-tube real-time fluorescent reverse transcription-PCR with the LightCycler Clinical Chemistry 46(12): 1987-1989,

5 Joerg Kleiber et al, 2000 Performance characteristics of a quantitative, homogeneous Taqman RT-PCR test for HCV RNA Journal of Molecular

inagnastics, 2G): 138-166

6 Maria Martell et af 1999 High-throughput real-time reverse transcription ~PCR

quantitation of Hepatitis C Virus RNA Journal of clinical microbiology 37 (2): 327-

332

7 James M Barbeau 2004 Performance characteristics of a quantitative Taqman Hepatitis C virus RNA Analyte-specific reagent Journal of clinical microbiology 43(8)}: 3739-3746

34

% Evelyn Melzl et al 2004 Rapid quantification of Hepatitis B virns DNA by automated sample preparation and real-time PCR Journal of clinical micrabiology 42(6): 2445-2449

G, Bustin 8 A 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays Journal of Malecular Endocrinology 25 169-193

10 Bayer Corporation 2001 Versant™ HCV RNA 3.0 assay (bDNA) United States

13 Detmer J et al 1996, Accurate quatification of Hepatitis C Virus RNA from all HCV genotypes by using branched-DNA technology Journal of Clinical! Microbialagy 34 (4): 901-907

14 Freeman WM et al 1999 Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential

L7 Kiein D, 2002 Quantification using real-time PCR technology: applications and

limitations TRENDS in Molecular Medicine 8 (6) 257-260

IS Liaw YF et af, 1997 Response of patients with dual Hepatis B Virus and C virus to interferon therapy Journal of interferon and Cytokine Research, UP 449- 452

19 Gtalietti A er af, 2001 An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cyiokine gene expression Methods 25: 385-401,

20 Mackay 1 M er al 2002 Real-time PCR im virology Nucleic Acid Research 30: 1292-1305.

PHU LUC