Cà chua là một trong những loại cây thực phẩm quan trọng nhất trên thế giới. Bệnh do virus gây ra là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất cà chua trên toàn thế giới. Virus khảm đốm cà chua Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) là một loại virus mới xuất hiện trên cà chua được xác định lần đầu tiên ở Mexico vào năm 2013, hiện nay đã được công nhận cùng với sự phân bố địa lý rộng khắp thế giới. Việc phát hiện sớm và chính xác sự có mặt của virus ToMMV trên cây cà chua để phòng trừ hiệu quả là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, một quy trình real time RTPCR phát hiện ToMMV đã được phát triển trên cà chua bằng cách sử dụng đầu dò TaqMan. Xét nghiệm này được thiết kế để phát hiện ToMMV bằng cách khuếch đại gen mã hóa protein chuyển động của ToMMV song song với gen đối chứng nội mã hóa protein actin của cà chua. Đoạn cDNA của gen mã hóa protein chuyển động của virus và gen actin cà chua được khuếch đại bằng RTPCR và được tạo dòng vào plasmid pJET1.2. Mẫu plasmid sau đó được sử dụng làm mẫu đối chứng dương chuẩn cho phản ứng real time RTPCR. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phản ứng được xác định lần lượt là 10 và 100 bản saophản ứng. Phương trình đường chuẩn của phản ứng real time RTPCR là y = 3,4921x + 39,711, với hệ số tương quan R2 = 0,999. Quy trình real time RTPCR được phát triển trong nghiên cứu này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp sử dụng trong chẩn đoán virus ToMMV.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG QUANG TOẢN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - tháng 6/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG QUANG TOẢN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn Khoa học: TS HUỲNH VĂN BIẾT Thành phố Hồ Chí Minh - tháng 6/2023 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS ToMMV (Tomato mottle mosaic virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR TRƯƠNG QUANG TOẢN Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: TS LÊ THỊ DIỆU TRANG Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Thư ký: TS BIỆN THỊ LAN THANH Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN VŨ PHONG Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Phản biện 2: TS HÀ TRẦN MINH DŨNG Trường Đại học Tôn Đức Thắng Ủy viên: TS NGUYỄN XUÂN DŨNG Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Trương Quang Toản sinh ngày 26 tháng 09 năm 1997 huyện Đồng Xuân, tỉnh Phú Yên Tốt nghiệp PTTH Trường Trung học phổ thông Lê Lợi, tỉnh Phú Yên năm 2019 tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ quy trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Q trình cơng tác: Nghiên cứu viên Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 09 năm 2019 tới Tháng 10 năm 2020 theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Điạ liên lạc: Phường Linh Trung – Tp Thủ Đức – Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 0368880967 Email: truongquangtoan.bio@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công bố luận văn trung thực phần đề tài cấp sở mã số CS-CB22-VienCNSH-01 TS Huỳnh Văn Biết làm chủ nhiệm Những số liệu luận văn phép công bố với đồng ý chủ nhiệm đề tài Trương Quang Toản iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban Giám hiệu nhà Trường, phòng đào tạo sau Đại học, ban Chủ nhiệm Khoa với thầy cô Khoa Khoa học Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo hội học tập truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt thời gian học tập trường Em xin chân thành cảm ơn Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện để em thực hồn thành luận văn Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy TS Huỳnh Văn Biết – người thầy kính yêu hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn chị ThS Phạm Thị Hồng Phi bạn phòng Sinh học Phân tử – Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường đồng hành giúp đỡ em suốt thời gian thực luận văn Cuối xin gửi lời biết ơn chân thành, sâu sắc đến cha mẹ, người ni nấng, tạo điều kiện để học tập rèn luyện thân ngày hơm Xin chân thành cảm ơn! iv TĨM TẮT Cà chua loại thực phẩm quan trọng giới Bệnh virus gây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất cà chua toàn giới Virus khảm đốm cà chua Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) loại virus xuất cà chua xác định lần Mexico vào năm 2013, công nhận với phân bố địa lý rộng khắp giới Việc phát sớm xác có mặt virus ToMMV cà chua để phòng trừ hiệu cần thiết Trong nghiên cứu này, quy trình real time RT-PCR phát ToMMV phát triển cà chua cách sử dụng đầu dò TaqMan Xét nghiệm thiết kế để phát ToMMV cách khuếch đại gen mã hóa protein chuyển động ToMMV song song với gen đối chứng nội mã hóa protein actin cà chua Đoạn cDNA gen mã hóa protein chuyển động virus gen actin cà chua khuếch đại RT-PCR tạo dòng vào plasmid pJET1.2 Mẫu plasmid sau sử dụng làm mẫu đối chứng dương chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phản ứng xác định 10 100 sao/phản ứng Phương trình đường chuẩn phản ứng real time RTPCR y = -3,4921x + 39,711, với hệ số tương quan R2 = 0,999 Quy trình real time RT-PCR phát triển nghiên cứu có độ nhạy độ đặc hiệu cao, phù hợp sử dụng chẩn đốn virus ToMMV Từ khóa: Tomato mottle mosaic virus, ToMMV, real time RT-PCR, TaqMan v SUMMARY Tomato is one of the most important vegetable crops in the world Diseases caused by viruses are one of the most critical factors affecting tomato production worldwide Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) is an emerging virus on tomato first identified in Mexico in 2013, which has now been recognized with a broad geographic distribution around the world It is necessary to detect early and accurately the presence of viruses on tomato for effective control In this study, a new method real time RT-PCR detection of for ToMMV on tomato using TaqMan probe was developed This assay was designed to detect ToMMV by amplifying the movement protein gene in a duplex assay with the internal control tomato actin protein gene The viral movement protein gene and tomato actin protein gene fragment were amplied by RT-PCR and cloned in to pJET1.2 plasmid The plasmids were used as the standard positive sample for the real time RT-PCR reaction Limit of detection (LOD) and limit of quantication (LOQ) of the amplication reaction were 10 and 100 copies/reaction respectively The real time RT-PCR presents a calibration curve y = -3.4921x + 39.711, the correlation coefficient R2 = 0.999 The real time RT-PCR assay developed in this study was high sensitivity and specificity, suitable for use in the diagnosis of ToMMV virus Keywords: Tomato mottle mosaic virus, ToMMV, real time RT-PCR, TaqMan vi MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v SUMMARY vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH HÌNH x DANH SÁCH BẢNG xi MỞ ĐẦU Chương .3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cà chua (Solanum lycopersicum L.) 1.1.1 Nguồn gốc vị trí loại cà chua 1.1.2 Hình thái học cà chua 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng 1.1.4 Tình hình canh tác 1.1.5 Bệnh hại cà chua 1.2 Tổng quan virus ToMMV 1.2.1 Nguồn gốc virus ToMMV 1.2.2 Vị trí phân loại virus ToMMV 1.2.3 Cấu trúc gen virus ToMMV 1.2.4 Phổ ký chủ 1.2.5 Triệu chứng 1.2.6 Phương thức lây truyền 1.2.7 Phân bố khu vực xuất virus ToMMV giới 1.2.8 Phương pháp chẩn đoán ToMMV 1.3 Tình hình nghiên ToMMV giới 1.4 Real time PCR ứng dụng chẩn đoán bệnh trồng 13 1.4.1 Tổng quan real time PCR 13 1.4.2 Real time PCR chẩn đoán bệnh trồng 14 Chương 16 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu 16 2.2.1 Mẫu thực vật 16 2.2.2 Thiết bị 17 2.2.3 Dụng cụ 17 2.2.4 Hóa chất 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phân tích trình tự gen thiết kế primer, Taqman probe đặc hiệu 17 2.3.2 Khảo sát thực nghiệm primer probe thiết kế 19 2.3.2.1 Thử nghiệm primer probe gen actin 19 2.3.2.2 Thử nghiệm primer probe gen ToMMV 22 vii 2.3.2.3 Thử nghiệm primer probe gen actin ToMMV .22 2.3.2.4 Kiểm tra độ đặc hiệu primer probe gen ToMMV 23 2.3.3 Tạo mẫu chuẩn dương cho quy trình phát ToMMV 23 2.3.4 Xây dựng quy trình phát ToMMV kỹ thuật real time 27 2.3.4.1 Khảo sát nồng độ primer 27 2.3.4.2 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 28 2.3.4.3 Xây dựng đường chuẩn 29 2.3.5 Ứng dụng quy trình real time RT-PCR để phát ToMMV 29 Chươnsg KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân tích gen virus ToMMV thiết kế primer, Taqman probe 30 3.2 Kết thử nghiệm primer probe thiết kế cho quy trình real time RT-PC 36 3.2.1 Kết thử nghiệm primer probe gen actin 36 3.2.2 Kết thử nghiệm primer probe gen CP ToMMV 37 3.2.3 Kết thử nghiệm primer probe gen MP ToMMV 39 3.2.4 Kết thử nghiệm primer probe gen actin MP ToMMV 40 3.3 Kết tạo mẫu chuẩn dương cho quy trình phát ToMMV 41 3.4 Kết xây dựng quy trình phát ToMMV kỹ thuật real time 44 3.4.1 Kết khảo sát nồng độ primer 44 3.4.2 Kết xây dựng phương trình đường chuẩn, xác định giới hạn 46 3.5 Kết ứng dụng quy trình real time RT-PCR để phát ToMMV 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 PHỤ LỤC 59 viii Hình 3.23 Kết xây dựng đường chuẩn gen MP a) Lần lặp lại 1; b) Lần lặp lại 2; c) Lần lặp lại Bảng 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn gen MP Log nồng độ 10 Ct 5,03 8,29 12,22 14,79 18,61 22,40 26,22 29,98 33,36 36,09 Ct 4,95 8,20 12,08 15,02 18,29 22,07 25,84 29,10 33,32 38,51 43,33 Ct 5,25 8,39 12,01 14,43 18,22 22,02 25,32 28,66 32,45 38,55 - TB 5,08 8,29 12,10 14,74 18,37 22,16 25,79 29,25 33,04 37,72 - SD 0,13 0,08 - 0,09 0,24 0,17 0,17 0,37 0,55 0,42 1,15 Ký hiệu (-): Khơng liệu Phương trình tương quan xây dựng dựa chu kỳ ngưỡng trung bình lần lặp lại mười mức nồng độ từ 1010 đến 101 y = -3,5739x + 40,311 với hệ số tương quan R² = 0,9979 Ba mức nồng độ thấp 102, 101 100 lặp lại thử nghiệm 10 lần, kết thể bảng 3.3 hình 3.24 Bảng 3.3 Kết xác định giá trị LOD LOQ Mức nồng độ Lần lặp lại Nồng độ 102 Nồng độ 101 Nồng độ 100 Ct Copies Ct Copies Ct Copies 33,12 103 37,73 - - 33,43 84 39,14 - - 32,95 115 37,34 - - 33,09 105 35,3 25 - - 32,88 120 37,2 - - 33,01 110 35,78 19 - - 32,83 124 35,08 29 38,89 - 32,83 124 35,88 17 38,64 - 32,80 126 35,22 27 - - 47 - 10 33,16 100 36,44 12 38,40 - Ký hiệu (-): Khơng liệu a) b) c) Hình 3.24 Kết xác định giá trị LOD LOQ a) Nồng độ 102 ; b) Nồng độ 101; c) Nồng độ 100 Hiện chưa có phương pháp tiêu chuẩn sử dụng để xác định giá trị LOD LOQ phản ứng real time PCR Trong nghiên cứu giá trị LOD LOQ xác định theo phương pháp Kralik ctv năm 2017, 48 giá trị LOD nồng độ nhỏ có tỉ lệ khuếch đại thành công 95% giá trị LOQ nồng độ nhỏ có giá trị biến thiên số copies nhỏ 25% Theo phương pháp Kralik ctv năm 2017 khơng có quy định số lần lặp lại thí nghiệm tối thiểu, tác giả cho thấy số lần lặp lại cao độ xác xác định giá trị LOD LOQ cao Trong điều kiện có hạn nghiên cứu này, số lần lặp lại thí nghiệm 10 lần Kết 10 lần lặp lại mức nồng độ 102, 101 100 cho thấy: tỉ lệ khuếch đại thành công hai mức nồng độ 102 101 100%, mức nồng độ 100 33,33% Độ biến thiên giá trị copies mức nồng độ 102 11,40%, mức nồng độ 101 61,22% Như theo kết thí nghiệm giá trị LOD 101 giá trị LOQ 102 Phương trình đường chuẩn xây dựng với điểm nồng nhỏ giá trị LOQ (102) là: y = -3,4921x + 39,711, hệ số tương quan R2 = 0,999 (Hình 3.25) y = -3,4921x + 39,711 R² = 0.999 Phương trình đường chuẩn 40,00 35,00 30,00 Ct 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 10 11 Log nồng độ Hình 3.25 Đồ thị đường chuẩn định lượng gen MP ToMMV Kết xây dựng phương trình đường chuẩn tuyến tính cao (R2 = 0,999), khoảng tuyến tính rộng (102 – 109) Vì phương trình đường chuẩn sử dụng việc định lượng virus ToMMV mẫu có nồng độ từ 102 – 109 49 3.5 Kết ứng dụng quy trình real time RT-PCR để phát ToMMV mẫu thực địa T7 T9 T3 T2 + T1 - T5 T6 ĐC NỘI T10 T4 T8 T15 T13 + T12 T17 T19 T20 T18 T14 ĐC NỘI T11 T16 - + T23 T30 T25 T24 ĐC NỘI T21 - Hình 3.26 Kết kiểm tra mẫu thực địa phản ứng real time RT- PCR (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; T1-T30: Mẫu T1 – T30 50 L + - T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 1000 bp 295 bp 200 bp L + - T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 - T21 T23 T24 T26 T27 T28 T29 T30 1000 bp 295 bp 200 bp L + T22 T25 1000 bp 295 bp 200 bp Hình 3.27 Kết kiểm tra mẫu thực địa phản ứng RT- PCR L: ladder; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; Giếng T1-T30: Mẫu T1 – T30 51 Bảng 3.4 Kết so sánh phương pháp real time RT-PCR RT-PCR Phương pháp real time RT-PCR STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Ký hiệu mẫu T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 ĐC + ĐC - T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 ĐC + ĐC - T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 ĐC + ĐC - Chu kỳ ngưỡng (Ct) 19,46 24,90 24,62 26,63 27,02 16,00 24,10 26,61 16,13 32,80 25,69 K 21,12 31,40 29,60 23,67 29,42 14,92 32,91 26,50 35,99 26,32 26,08 K 20,53 K 29,01 24,46 36,84 K K K K 29,99 25,81 K Giá trị định lượng (bản sao) 629636 17430 20964 5570 4307 6164491 29538 5644 5658096 95 10353 K 210732 240 786 39220 885 12565121 89 6069 12 6834 8005 K 310945 K 1160 23296 K K K K 608 9565 K 52 Phương pháp RT-PCR Định tính Định tính + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - ĐC +: đối chứng dương; ĐC -: đối chứng âm; K: khơng có liệu; -: khơng phát hiện; +: phát Kết bảng 3.4 cho thấy quy trình real time RT-PCR xây dựng cho kết định tính 30 mẫu thực địa hồn tồn trùng khớp với kết phương pháp RT-PCR Sui ctv công bố năm 2013 Trong 30 mẫu thực địa có 25 mẫu có phát đoạn gen virus ToMMV chiếm 83,33% mẫu không phát chiếm 16,67% Hai mươi mẫu thu thập từ hai vườn cà chua cho kết phát hiện, kết phù hợp với hình thái mẫu có triệu chứng bệnh khảm biến dạng ToMMV gây mô tả bảng 2.1 phụ lục Bên cạnh đó, mười mẫu hạt cung cấp phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học Mơi trường có mẫu phát đoạn gen virus ToMMV hình thái hạt bình thường khơng có triệu chứng bệnh, điều cho thấy xác định có mặt virus ToMMV thơng qua quan sát hình thái hạt giống Ngồi kết định tính, phương pháp real time RT-PCR có ưu điểm vượt trội xác định số lượng đoạn gen có phản ứng, dựa vào tính tốn nồng độ virus nhiễm mẫu cao hay thấp Điều hỗ trợ nhiều công tác đánh giá tình trạng bệnh kịp thời đưa biện pháp xử lý, phòng ngừa Bên cạnh đó, kết hình 3.26 3.27 cho thấy, mẫu có nồng độ virus thấp (T9 T25) băng điện di cho kết mờ gây nhầm lẫn đọc kết mắt, kết đường khuếch đại phản ứng real time PCR rõ ràng, chu kỳ ngưỡng Ct xác định máy, điều giúp tránh tượng âm tính giả sai sót xét nghiệm chẩn đốn 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Nghiên cứu xây dựng thành công quy phát virus ToMMV kỹ thuật real time RT-PCR Trong đó: Các primer probe sử dụng có quy trình thiết kế đạt kết khuếch đại tốt độ đặc hiệu cao Nồng độ primer probe tối ưu cho phản ứng xác định 300 nM primer với 100 nM probe Đối chứng dương gen MP virus ToMMV sử dụng cho quy trình dịng hóa vào plasmid pJET1.2 có tính ổn định cao Phương trình đường chuẩn sử dụng cho định lượng gen MP ToMMV xác định y = -3,4921x + 39,711, hệ số tương quan R2 = 0,999 Giá trị giới hạn phát (LOD) 101 copies giới hạn định lượng (LOQ) 102 copies Quy phát virus ToMMV kỹ thuật real time RT-PCR ứng dụng thành công mẫu thực địa với kết định tính tương đồng hoàn toàn với kết sử dụng phương pháp Sui ctv cơng bố năm 2013 Ngồi quy trình cịn định lượng số copies phản ứng dựa vào tính tốn nồng độ virus nhiễm mẫu cao hay thấp Điều hỗ trợ nhiều cơng tác đánh giá tình trạng bệnh kịp thời đưa biện pháp xử lý, phịng ngừa Đề nghị: Kiểm tra quy trình xây dựng nhiều hệ thống real time PCR, hóa chất nhiều mẫu khác nhằm xác định tính ổn định hiệu quy trình Phát triển quy trình thành kỹ thuật real time RT-PCR bước (one step) nhằm tiết kiệm thời gian chi phí thực 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aoki K., Yano K., Suzuki A., Kawamura S., Sakurai N., Suda K., Kurabayashi A., Suzuki T., Tsugane T., and Watanabe M., 2010 Large-scale analysis of fulllength cDNAs from the tomato (Solanum lycopersicum) cultivar Micro-Tom, a reference system for the Solanaceae genomics BMC genomics 11: 1-16 Ahmed L., Martin-Diana A B., Rico D., and Barry-Ryan C., 2011 The antioxidant properties of whey permeate treated fresh-cut tomatoes Food Chemistry 124 (4): 1451-1457 Ambros S., Martinez F., Ivars P., Hernandez C., de la Iglesia F., and Elena S F., 2017 Molecular and biological characterization of an isolate of Tomato mottle mosaic virus (ToMMV) infecting tomato and other experimental hosts in eastern Spain European Journal of Plant Pathology 149: 261-268 Armstrong P M., Prince N., and Andreadis T G., 2012 Development of a multitarget TaqMan assay to detect eastern equine encephalitis virus variants in mosquitoes Vector-Borne and Zoonotic Diseases 12 (10): 872-876 Bakker D., Bruinsma M., Dekter R., Toonen M., Verhoeven J T J., and Koenraadt H., 2015 Detection of PSTV d and TCDVd in seeds of tomato using real‐time RT‐PCR EPPO Bulletin 45 (1): 14-21 Boonham N., Pérez L G., Mendez M., Peralta E L., Blockley A., Walsh K., Barker I., and Mumford R., 2004 Development of a real-time RT-PCR assay for the detection of Potato spindle tuber viroid Journal of virological methods 116 (2): 139-146 Botermans M., Van de Vossenberg B., Verhoeven J T J., Roenhorst J., Hooftman M., Dekter R., and Meekes E., 2013 Development and validation of a real-time RT-PCR assay for generic detection of pospiviroids Journal of virological methods 187 (1): 43-50 Brault A C., Fang Y., Dannen M., Anishchenko M., and Reisen W K., 2012 A naturally occurring mutation within the probe-binding region compromises a molecular-based West Nile virus surveillance assay for mosquito pools (Diptera: Culicidae) Journal of medical entomology 49 (4): 939-941 Chitra T., Prakash H., Albrechtsen S., Shetty H., and Mathur S., 2002 Indexing of leaf and seed samples of tomato and bell pepper for tobamoviruses Indian phytopathology 55 (1): 84-86 10 Choudhary N., Wei G., Govindarajulu A., Roy A., Li W., Picton D D., Nakhla M., Levy L., and Brlansky R., 2015 Detection of Citrus leprosis virus C using specific primers and TaqMan probe in one-step real-time reverse-transcription polymerase chain reaction assays Journal of virological methods 224: 105-109 55 11 Chow C.-K., Qin K., Lau L.-T., and Cheung-Hoi Yu A., 2011 Significance of a single-nucleotide primer mismatch in hepatitis B virus real-time PCR diagnostic assays Journal of clinical microbiology 49 (12): 4418-4419 12 Dam B v., Goffau M d., Lidth de Jeude J v., and Naika S., 2005 Cultivation of tomato: production, processing and marketing Agrodok 13 Delanoy M., Salmon M., Kummert J., Frison E., and Lepoivre P., 2003 Development of real-time PCR for the rapid detection of episomal Banana streak virus (BSV) Plant disease 87 (1): 33-38 14 Diaz-Lara A., Stevens K., Klaassen V., Golino D., and Al Rwahnih M., 2020 Comprehensive real-time RT-PCR assays for the detection of fifteen viruses infecting Prunus spp Plants (2): 273 15 Garson J A., Ferns R B., Grant P R., Ijaz S., Nastouli E., Szypulska R., and Tedder R S., 2012 Minor groove binder modification of widely used TaqMan probe for hepatitis E virus reduces risk of false negative real-time PCR results Journal of virological methods 186 (1-2): 157-160 16 Heinze C., Lesemann D.-E., Ilmberger N., Willingmann P., and Adam G., 2006 The phylogenetic structure of the cluster of tobamovirus species serologically related to ribgrass mosaic virus (RMV) and the sequence of streptocarpus flower break virus (SFBV) Archives of virology 151: 763-774 17 Jacobi V., Bachand G., Hamelin R., and Castello J., 1998 Development of a multiplex immunocapture RT-PCR assay for detection and differentiation of tomato and tobacco mosaic tobamoviruses Journal of virological methods 74 (2): 167-178 18 Kralik P., and Ricchi M., 2017 A basic guide to real time PCR in microbial diagnostics: definitions, parameters, and everything Frontiers in microbiology 8: 108 19 Kimura S., and Sinha N., 2008 Tomato (Solanum lycopersicum): a model fruitbearing crop Cold Spring Harbor Protocols 2008 (11): pdb emo105 20 Körbelin J., Willingmann P., Adam G., and Heinze C., 2012 The complete sequence of tobacco mosaic virus isolate Ohio V reveals a high accumulation of silent mutations in all open reading frames Archives of virology 157: 387-389 21 Kumar K S., Paswan S., and Srivastava S., 2012 Tomato-a natural medicine and its health benefits Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry (1): 33-43 22 Kumar S., Udaya Shankar A., Nayaka S., Lund O., and Prakash H., 2011 Detection of Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus in pepper and tomato by multiplex RT–PCR Letters in Applied Microbiology 53 (3): 359-363 23 Letschert B., Adam G., Lesemann D.-E., Willingmann P., and Heinze C., 2002 Detection and differentiation of serologically cross-reacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP Journal of virological methods 106 (1): 1-10 56 24 Lovelock D., Kinoti W., Bottcher C., Wildman O., Dall D., Rodoni B., and Constable F., 2020 Tomato mottle mosaic virus intercepted by Australian biosecurity in Capsicum annuum seed Australasian Plant Disease Notes 15: 1-2 25 Li Y., Wang Y., Hu J., Xiao L., Tan G., Lan P., Liu Y., and Li F., 2017 The complete genome sequence, occurrence and host range of Tomato mottle mosaic virus Chinese isolate Virology journal 14: 1-9 26 Li R., Gao S., Fei Z., and Ling K.-S., 2013 Complete genome sequence of a new tobamovirus naturally infecting tomatoes in Mexico Genome announcements (5): e00794-00713 27 Liu W., Zhao X., Zhang P., Mar T T., Liu Y., Zhang Z., Han C., and Wang X., 2013 A one step real-time RT-PCR assay for the quantitation of Wheat yellow mosaic virus (WYMV) Virology journal 10: 1-9 28 Mason G., Caciagli P., Accotto G P., and Noris E., 2008 Real-time PCR for the quantitation of Tomato yellow leaf curl Sardinia virus in tomato plants and in Bemisia tabaci Journal of virological methods 147 (2): 282-289 29 Mutari A., and Debbie R., 2011 The effects of postharvest handling and storage temperature on the quality and shelf of tomato African Journal of food science (7): 446-452 30 Osman F., Hodzic E., Kwon S.-J., Wang J., and Vidalakis G., 2015 Development and validation of a multiplex reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for the rapid detection of Citrus tristeza virus, Citrus psorosis virus, and Citrus leaf blotch virus Journal of virological methods 220: 64-75 31 Osman F., Dang T., Bodaghi S., and Vidalakis G., 2017 One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts Journal of virological methods 245: 40-52 32 Salem N., Mansour A., Ciuffo M., Falk B., and Turina M., 2016 A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan Archives of virology 161: 503-506 33 Srivastava S., and Kulshrestha K., 2013 Nutritional content and significance of tomato powder Annals of Arid Zone 52 (2): 121-124 34 Sui X., Zheng Y., Li R., Padmanabhan C., Tian T., Groth-Helms D., Keinath A P., Fei Z., Wu Z., and Ling K.-S., 2017 Molecular and biological characterization of tomato mottle mosaic virus and development of RT-PCR detection Plant disease 101 (5): 704-711 35 Tiberini A., Manglli A., Taglienti A., Vučurović A., Brodarič J., Ferretti L., Luigi M., Gentili A., and Mehle N., 2022 Development and Validation of a OneStep Reverse Transcription Real-Time PCR Assay for Simultaneous Detection and Identification of Tomato Mottle Mosaic Virus and Tomato Brown Rugose Fruit Virus Plants 11 (4): 489 57 36 Hải T T H., and Thanh T T., 2017 Đánh giá khả sinh trưởng, phát triển cho suất số giống ớt cay F1 nhập nội vụ đông xuân 2015– 2016 Thừa Thiên Huế Hue University Journal of Science: Agriculture and Rural Development 126 (3C): 43–53-43–53 37 Turina M., Geraats B., and Ciuffo M., 2016 First report of Tomato mottle mosaic virus in tomato crops in Israel New Dis Rep 33 (1): 2044-0588.2016 38 Willcox J K., Catignani G L., and Lazarus S., 2003 Tomatoes and cardiovascular health Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43, 1-18 39 Zhan B.-h., Ning C., WANG K.-n., and ZHOU X.-p., 2018 Detection and characterization of an isolate of Tomato mottle mosaic virus infecting tomato in China Journal of Integrative Agriculture 17 (5): 1207-1212 40 Kamau E., Agoti C N., Lewa C S., Oketch J., Owor B E., Otieno G P., Bett A., Cane P A., and Nokes D J., 2017 Recent sequence variation in probe binding site affected detection of respiratory syncytial virus group B by real-time RT-PCR Journal of Clinical Virology 88: 21-25 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự vùng gen MP ToMMV >MP GGTTTTGTTTAGAAGTTTGTTTATCAATGGCTCTAACTGTTAGTGGTAAG GTTAGAATTAGCGAGTTTATCGACTTGTCTAAGTCAGAAAGGTTGCTGC CGTCTATGTTCACTCATGTTAAAAGCGTCTCTGTCTCAAAGGTTGACAAG GTCATGGTTAATGAAGAAGATTCTTTGTCAGAAGTCAACTTGTTGAAGG GCGTTAAACTTATAGATGGTGGTTACGTTTGTCTGGCTGGTCTAGTAGTG TCCGGTGAGTGGAATCTTCCAGACAATTGTCGTGGTGGTGTCAGCGTCT GCTTGGTCGATAAAAGAATGCAAAGAGCGGATGAAGCGACACTTGGAT CGTATTATACTGGAGCTGCAAAGAAAAGGTTCCAGTTTAAGATCGTTCC AAACTACGCAATTACAACTAAGGATGCAGAAAAGAACATATGGCAAGT CCTAGTTAATATTAGGAATGTCAAGATGGCTGGGGGTTTCTGTCCCCTGT CGTTAGAATTTGTGTCTGTGTGTATAGTTTATAAAAATAATATAAAATTG GGTTTGAGGGAGAAGATTACAAGAGTGGATGACGCAGGTCCCATTGAA CTTACCGAAGAAGTTGTTGATGAGTTCATGGAGAGTGTGCCTATGTCAG TCAGGCTTGCTAAATTTCGAACCAAATCCTCAAAAAGAGGTCCGAAACA TAATAGTAATAATACTAATGAAAGAAAGGGGCGGTCTAATTTCCGTAAG AAACAAGACCAGGAGAGTTATGGAGTTAGTGATAGTTTAGATAATTTGA TTGAAGATGATACCGAGACGTCAGTCGCGGGATCTGATTCGTATTAAAT ATGTCTTACGCTATTACTTCTCCGTCACAA Phụ lục 2: Trình tự vùng gen actin cà chua >ACT AGGCCAACAGAGAGAAGATGACCCAGATTATGTTTGAGACATTTAATGT TCCTGCTATGTATGTTGCTATCCAGGCTGTGCTTTCTCTGTATGCTAGCG GTCGTACCACTGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGTTAGTCACACT GTCCCTATCCATGAAGGTTATGCTTTACCACATGCCATTCTTCGTTTGGA CCTTGCTGGTCGTGACCTTACTGATAGCTTGATGAAGATCCTCACCGAG AGAGGTTACATGTTCACCACTACTGCTGAACGGGAAATTGTACGTGACA TGAAGGAAAAGCTTGCTTATGTGGCTCTTGACTACGAGCAGGAACTTGA AACCGCTAGGAGCAGTTCCTCCATTGAAAAGAACTATGAGTTGCCAGAT GGACAGGTTATTACCATTGGTGCTGAGAGGTTCCGTTGCCCAGAGGTAC TCTTCCAACCATCAATGATTGGAATGGAAGCTGCGGGTATCCATGAGAC TACATACAACTCCATCATGAAATGTGATGTAGATATTAGGAAGGACCTC TATGGTAACATTGTTCTCAGTGGTGGCTCCACCATGTTCCCTGGTATTGC TGATCGGATGAGCAAGGAAATCACTGCTTTGGCTCCAAGCAGCATGAAA ATTAAGGTTGTTGCACCACCTGAGAGGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAG 59 GATCCATTCTTGCATCCCTCAGCACATTCCAGCAGATGTGGATCTCAAA GGGCGAGTATGATGAGTCTGGTCCTTCCATTGT Phụ lục 3: Hình 30 mẫu thực địa TN1 T4 T2 T3 T5 T6 T7 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 60 T8 T17 T20 T18 T19 T21 T24 T22 T23 T25 T28 T26 T27 T29 T30 T1 – T20: mẫu thực địa cà chua số – 20; T21 – T27 mẫu thực địa hạt cà chua số 21 – 27; T28 – T30 mẫu thực địa hạt ớt số 28 – 30 61