Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa dạng nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR.pdf

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT QUỐC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 Cơng trình đƣợc hồn thành Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.BS Phạm Hùng Vân Luận v n thạc s đƣợc ảo vệ Hội đồng ch m ảo vệ Luận v n thạc s Trƣờng Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày16 tháng n m 2022 Thành phần Hội đồng đánh giá luận v n thạc s gồm: TS Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng TS Lao Đức Thuận - Phản iện TS Trần Thị Huyền - Phản iện TS Trần Quỳnh Hoa - Ủy viên TS Mai Bích Dung - Thƣ ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TS NGUYỄN THỊ KIM ANH VIỆN TRƢỞNG VIỆN CNSH&TP BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN VIỆT QUỐC MSHV: 19000191 Ngày, tháng, n m sinh: 18/03/1982 Nơi sinh: Trà Vinh Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) đa dạng mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định tên đề tài - Xây dựng phƣơng pháp nghiên cứu - Thu thập mẫu nghiên cứu - Xây dựng hồn thiện quy trình phát ASFV ằng kỹ thuật real-time PCR  Kiểm tra thiết kế primer – pro e đƣợc OIE khuyến cáo in silico  Tổng hợp hố học trình tự primer – pro e phát ASFV  Tổng hợp hố học trình tự primer – pro e cho chứng nội ổ sung vào phản ứng real-time PCR  Thẩm định thông số kỹ thuật ộ sinh phẩm - Xác định tỷ lệ lƣu hành ệnh  Xử lý mẫu tiền ly trích  Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử  Thực phản ứng real – time PCR phát ASFV  Thống kê tỷ lệ dƣơng tính - Xác định yếu tố nguy lây nhiễm mẫu môi trƣờng, ề mặt  Xử lý mẫu tiền ly trích  Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử  Thực phản ứng real – time PCR phát ASFV  Thống kê tỷ lệ dƣơng tính yếu tố nguy mơi trƣờng ch n nuôi - Xác định genotype ASFV  Khuếch đại trình tự 478 p vùng ảo tồn gen mã hố VP72  Giải trình tự gen ảo tồn đƣợc khuếch đại - Xây dựng phƣơng pháp kiểm sốt yếu tố nguy để phịng, chống ệnh ASF II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 29/9/2021 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 16/6/2022 IV NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng năm 2022 NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TS.BS PHẠM HÙNG VÂN VIỆN TRƢỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn thầy cô Viện công nghệ Sinh học Thực phẩm Trƣờng Đại học Công nghiệp TP HCM truyền đạt cho kiến thức chuyên ngành suốt thời gian học tập trình làm luận v n thạc s Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa hỗ trợ kinh phí tạo điều kiện thuận để tơi thực hoàn thành đề tài Đồng cảm ơn t t anh chị phòng Kiểm tra Ch t lƣợng, phịng RD phịng Sinh học Phân tử Cơng ty TNHH Dịch vụ Thƣơng mại Nam Khoa giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, vợ gái tơi hỗ trợ động viên suốt trình học tập nghiên cứu Thành tựu khơng thể có đƣợc khơng có họ Xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) ệnh dịch gây chết gần nhƣ hoàn toàn lợn ị nhiễm Cho đến chƣa có vắc xin thuốc điều trị đặc hiệu, ác s thú y chƣa thể phân iệt xác ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) với ệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) thông qua th m khám iểu lâm sàng mổ tử thi Chính vậy, việc phát triển ộ xét nghiệm sử dụng kỹ thuật real-time PCR phát sớm ệnh đƣợc xem cơng cụ hỗ trợ nhiệm vụ phòng chống dịch quốc gia Trong nghiên cứu này, ộ xét nghiệm sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng gen VP72 ASFV đƣợc khuyến cáo ởi OIE, đồng thời sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng gen đặc hiệu vi rút gây ệnh đốm trắng làm chứng nội Kết đánh giá thơng số kỹ thuật thu đƣợc có độ nhạy 1.854 ản sao/ phản ứng (95%CI: 1.073 – 3.205), độ đặc hiệu 100%, độ lặp lại độ tái lập r t tốt với CV ≤ 10%, có khả n ng chống ức chế Tỷ lệ lƣu hành ASF 7713 mẫu chiếm 7.47% (538/6665 mẫu ệnh phẩm dƣơng tính với ASFV chiếm 8,07% 38/1048 mẫu môi trƣờng ch n nuôi để xác định yếu tố nguy có tỷ lệ nhiễm 3,63%) Trong phân tích so sánh tỷ lệ lƣu hành ệnh mẫu nhƣ máu, nội tạng dịch thể trực tiếp từ lợn cho th y tỷ lệ nhiễm ASFV trại có quy mơ vừa nhỏ lên đến 23.93%, trại lớn 6.41% Tƣơng tự, xác định yếu tố nguy lây nhiễm mẫu quệt môi trƣờng, quệt chuồng, ề mặt chuồng, đ t, nƣớc sinh hoạt nƣớc thải ghi nhận tỷ lệ phát ASFV trại vừa nhỏ chiếm 7.37% nhƣng trại lớn 1.69% Mặt khác phân tích trình tự 13 mẫu dƣơng tính với ASFV cho th y t t thuộc genotype II Tóm lại, xây dựng ứng dụng thành công ộ xét nghiệm real-time PCR để phát ASFV (NK ASFVquant PCR kit) đối tƣợng mẫu thử khác phòng xét nghiệm Tuy nhiên để đƣợc sử dụng rộng rải ộ xét nghiệm cần đƣợc khảo nghiệm ởi đơn vị có thẩm quyền đƣợc c p phép lƣu hành ởi Cục Thú Y ii ABSTRACT African Swine Fever (ASF) is a high mortality rate epidemic, which leads to severe economic damage and a lack of worldwide food supplies No vaccine or drug is available to treat ASF Additionally, veterinarians have not been able to distinguish African Swine Fever (ASF) from Classical Swine Fever (CSF) based solely on clinical manifestations and necropsies Hence, real-time PCR tests could be an important tool for supporting the country's disease prevention A real-time PCR reaction was conducted in this study using the OIE-recommended primer pair to amplify the VP72 gene while the White Spot Syndrome Virus specific primer was used as an internal control The obtained parameters indicate that the sensitivity is 1,854 copies per reaction (95%CI: 1,073 - 3,205), the specificity is 100%, repeatability is good, and reproducibility is with a coefficient of variation of 10%; PCR inhibition was avoided Infection rates of ASFs were observed on 7713 samples for 7.47% (538/6665 ASF positive samples represented 8.07% and 38/1048 farm-related samples demonstrated a 3.63% infection rate) Furthermore, a positive rate of specimens (related to body fluids or organs) collected from small and average farms equals 23.93%, while that of large farms is 6.41% We also measured the risk of infection from the environment by sampling the cage floor, cage surface, soil, and domestic water and wastewater ASFV accounted for 7.37% of small and medium-sized farms, and 1.69% of large farms We also sequenced 13 positive samples of ASFV using DNA sequencing and found that all these samples belonged to genotype II strains As a result, a real-time PCR kit has been developed to detect ASFV (NK ASFV quant PCR kit) on various specimens received in the laboratory It is important, though, that this test kit be tested by a competent unit before it can be widely used It also needs to be licensed by the Department of Veterinary Medicine to circulate iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận v n tốt nghiệp: ―NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR‖ cơng trình nghiên cứu ản thân Việc tham khảo nguồn tài liệu luận v n đƣợc nêu rõ phần tài liệu tham khảo đƣợc thực trích dẫn quy định Các số liệu, kết trình ày luận v n hồn tồn trung thực, khơng chép từ nguồn dƣới t kỳ hình thức Học viên (Chữ ký) Nguyễn Việt Quốc iv t kỳ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH x DANH MỤC BẢNG BIỂU xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv MỞ ĐẦU .1 Đặt v n đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu .3 Ý ngh a thực tiễn đề tài .4 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 African Swine Fever Virus (ASFV) 1.1.1 Phân loài ASFV .5 1.1.2 C u trúc ASFV 1.1.2.1 Hình thể cấu trúc phân tử ASFV 1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen ASFV 1.1.3 Quá trình xâm nhiễm ASFV 10 1.2 Các đƣờng lây nhiễm ASFV 13 1.2.1 Chu trình lây nhiễm hoang dại 13 1.2.2 Chu trình lây nhiễm ve – lợn .14 1.2.3 Chu trình lây nhiễm lợn ni .15 1.2.4 Khả n ng tồn vi rút ASF 15 1.3 Diễn iến lâm sàng ệnh ASF 17 v 1.3.1 Quá c p 18 1.3.2 C p tính 18 1.3.3 Á c p 19 1.3.4 Mãn tính .20 1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán cận lâm sàng có .20 1.4.1 Phát vi rút .20 1.4.1.1 Phát hệ gen ASFV phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) 20 1.4.1.2 Phân lập vi rút 23 1.4.1.3 Phát kháng nguyên ASF thử nghiệm kháng thể phát quang trực tiếp (FAT – Direct fluorescent antibody test) 24 1.4.1.4 1.4.2 1.4.2.1 Phát kháng nguyên thử nghiệm ELISA kháng nguyên 24 Phát kháng thể ASF .25 Phát kháng thể thử nghiệm ELISA 25 1.4.2.2 Phát kháng thể ASF thử nghiệm kháng thể phát quanh gián tiếp (IFA – indirect fluorescent antibody test) 26 1.4.2.3 Phát kháng thể thử nghiệm hố mơ miễn dịch xúc tác peroxidase (IPT – indirect immunoperoxidase test) 27 1.5 Kiểm soát phòng chống ệnh ASF 27 1.6 Vắc xin 28 1.7 Tình hình nghiên cứu 29 1.7.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 29 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 31 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32 2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 2.1.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu .32 2.1.2 Hoá ch t .32 2.1.2.1 Hố chất xử lý tiền ly trích .32 2.1.2.2 Hoá chất tách chiết DNA tổng số .33 2.1.2.3 Hoá chất thực phản ứng PCR 33 2.1.2.4 Hoá chất khuếch đại trình tự gen VP72 ASFV 34 2.1.2.5 Hoá chất điện di .34 vi ... đoan luận v n tốt nghiệp: ―NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR‖ cơng trình nghiên cứu ản thân Việc tham khảo... TÀI: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) đa dạng mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định tên đề tài - Xây dựng phƣơng pháp nghiên cứu. .. THẠC SĨ Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) ệnh dịch gây chết gần nhƣ hoàn toàn lợn ị nhiễm Cho đến chƣa có vắc xin thuốc điều trị đặc hiệu, ác s thú y chƣa thể phân iệt xác ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF)