Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH ——oOo BÁO CÁO TỐNG KẾT ĐÈ TÀI CHƯONG TRÌNH SINH VIÊN NCKH NĂM 2020 TÊN ĐÈ TÀI: ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VIRUS DỊCH TÃ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM Mã số đề tài: Chủ nhiệm đề tài: Đặng Ngọc Trân Giảng viên hướng dẫn: TS Thân Văn Thái Khoa: Công nghệ Sinh học Các thành viên tham gia: STT Họ tên Đặng Ngọc Trân MSSV 1711545286 TP Hồ Chỉ Minh, thảng 10 năm 2020 Lóp 17DSH1A MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Khả ứng dụng đề tài CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Địa điểm thực 2.2 Nội dung nghiên cứu .9 2.3 Đối tượng nghiên cứu 2.4 Vật liệu nghiên cứu 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 2.4.2 Hóa chất, thuốc thử 10 2.5 Phương pháp nghiên cứu .10 2.5.1 Thu mẫu 10 2.5.2 Tách chiết DNA 10 2.5.3 PCR phát 11 2.5.4 Phương pháp điện di 13 2.5.5 Giải trình tự, xây dựng phả hệ 14 2.5.6 So sánh độ nhạy cặp mồi phản ứng PCR 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC 16 3.1 Ket thu mẫu 16 3.2 Kết PCR phát 16 3.3 Ket so sánh độ nhạy cặp mồi 18 3.4 Ket giải trình tự gen 21 3.5 Ket xây dựng phát sinh loài 23 CHƯƠNG KÉT LUẬN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT ASFV: Tác nhân gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus') PRRS: Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine reproductive and respiratoy syndrome) CSF: Bệnh sốt lợn cổ điển (Classical Swine Fever) PCR: Phản ứng chuồi Polymerase dNTP: Deoxynucleoside triphosphate ddNTP: Dideoxynucleotide triphosphate Nu: Nucleotide NCBI: Nation center for Biotechnology information DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Ket phản ứng PCR phát mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với mồi OIE-F/R 17 Hình 3.2 Ket phản ứng PCR phát mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với mồi PPA-1/2 17 Hình 3.3 Độ nhạy phản ứng PCR sử dụng cặp moi OIE-F/R 20 Hình 3.4 Độ nhạy phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PPA-1/2 20 Hình 3.5 Ket giải trình tự tốt 22 Hình 3.6 Ket giải trình tự nhiễu 22 Hình 3.7 Kết sau BLAST trình tự cặp mồi OIE-F/R 23 Hình 3.8 Kết sau BLAST trình tự cặp mồi PPA-1/2 23 Hình 3.9 Cây phát sinh lồi mô tả mối quan hệ gen B646L ASFV .25 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu 10 Bảng 2.3 Danh mục hóa chất thuốc thử 10 Bảng 2.4 Primers sử dụng phản ứng PCR 12 Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng PCR 12 Bảng 2.6 Trình tự cặp mồi chu trình nhiệt tương ứng 13 Bảng 3.1 Thống kê kết PCR phát cặp mồi 18 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ DNA (ng/pl) 19 Bảng 3.3 Giới hạn phát ASFV cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 .21 CHƯƠNG TƠNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Ngày nhu cầu thịt lợn người ngày tăng cao, tạo hội cải thiện sống cho người có thu nhập thấp thông qua chăn nuôi, chế biến, thương mại sản phẩm từ chăn nuôi Tuy nhiên, năm gần bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) tác nhân African swine fever virus (ASFV) gây xuất lây lan nhanh sang nhiều khu vực gây thiệt hại nghiêm trọng cho nước bị nhiễm bệnh ASFV lây truyền trực tiếp thông qua tiếp xúc với lợn bị nhiễm bệnh, hay qua đường máu, qua vết thương, v.v ASF lần đầu xuất trang trại, khu vực tỷ lệ chết lên đến 100 % Vào năm 2019, Việt Nam thức cơng bố xuất ASFV lần Hưng Yên, sau lây qua Thái Bình, Hải Phịng, Thanh Hóa, Hà Nội, Hà Nam Theo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi tái phát 155 xã 20 tỉnh, thành phố, buộc tiêu hủy gần 4.000 lợn Nguy dịch bệnh tiếp tục tái phát, lây lan diện rộng lớn, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn Việt Nam Dù có nhiều nước cơng bố tình trạng ASFV, bệnh lại xuất lần đầu Việt Nam nên nghiên cứu nước cịn Do khơng có vaccine phịng điều trị bệnh, nên việc kiểm soát dịch chủ yếu dựa vào chẩn đốn phịng thí nghiệm thực biện pháp an toàn sinh học Hơn nữa, dịch tả lợn Châu Phi gây tổn thương triệu chứng lâm sàng tương tự với số bệnh gây lợn dịch tả lợn cổ điển, hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (bệnh PRRS), nên việc chẩn đốn phịng thí nghiệm để phân biệt ASF từ lợn bị nhiễm bệnh cần thiết để kịp thời hạn chế dịch lây lan Do đó, u cầu chẩn đốn phịng thí nhiệm phải có quy trình nhanh xác cho việc phát ASFV Xuất phát từ lý trên, đề xuất thực đề tài: “ứng dụng phản ứng PCR phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn Việt Nam” 1.2 Mục tiêu đề tài ứng dụng phản ứng PCR để phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn Việt Nam 1.3 Khả ứng dụng đề tài ứng dụng phản ứng PCR để phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn diện rộng CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Địa điểm thực Đe tài thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng 06-09/2020 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phát ASFV mẫu bệnh phẩm phản ứng PCR - So sánh độ đặc hiệu độ nhạy cặp mồi với mẫu ASFV gây bệnh lợn Việt Nam - Giải trình tự phân tích đặc điểm phần đoạn gen B646L virus 2.3 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu thực đối tượng African swine fever virus (ASFV) gây bệnh lợn Việt Nam 2.4 Vật liệu nghiên cứu 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu STT Thiết bị STT Thiết bị Máy ly tâm Máy hấp Máy PCR Lò vi sóng Máy vortex Máy cất nước Máy spindown 10 Thiết bị điện di Tủ lạnh 11 Máy soi gel Tủ -20 °C Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu STT Dụng cụ STT Dụng cụ Khẩu trang Eppendorf 1,5 ml Găng tay y tế Eppendorf ml Khay đựng eppendorf Eppendorf PCR Đầu tuýp loại 10 Bình xịt Hộp đựng đầu tuýp 11 Bút lông Micropipet 12 Đèn 2.4.2 Hóa chất, thuốc thử Bảng 2.3 Danh mục hóa chất thuốc thử STT Hóa chất STT Hóa chất Cồn 70° Primer PCR Cồn 96° DW (nước dùng cho PCR) Agarose 3X Gelred loading dye buffer Tris - acetate EDTA (TAE) Hyper Ladder 10 kb Mytaq Mix 2X 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Thu mẫu Các mẫu phân thu dựa triệu chứng lợn bệnh Hà Nội, Hưng Yên, Phú Thọ Các mẫu DNA tách chiết cung cấp Học viện Nông nghiệp Việt Nam (n=10) 2.5.2 Tách chiết DNA Mầu tách chiết cách sử dụng Kit tách chiết (bộ Kit sản xuất phân phối công ty ABT) Chi tiết bước tách chiết DNA sau: 10 Tiếp tục hút pl từ eppendorf có độ pha lỗng 10'1 cho vào pl nước cất có hút sẵn eppendorf, sau vortex làm lắng máy spindow, độ pha loãng 10’2 Lặp lại trình tương tự cho độ pha lỗng sau (10'3 đến 1O-10) Quy trình thực PCR: Chuẩn bị ống eppendorf cần chạy PCR, dùng pipet hút thành phần chuẩn bị vào ống eppendorf Các thành phần phản ứng PCR tương tự phản ứng PCR phát Sau đó, đậy nắp trộn dung dịch máy vortex, lắng hỗn hợp máy spindow Sau đặt hỗn hợp vào máy PCR cài đặt theo chu trình nhiệt tương tự phản ứng PCR phát Sau phản ứng PCR kết thúc, DNA kiểm phương pháp điện di gel agarose Khi điện di kết thúc, soi gel quan sát chụp hình 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ SẢN PHẤM ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Ket thu mẫu Mầu phân lợn nghi nhiễm ASFV thu nhận Hà Nội, Hưng Yên Phú Thọ Thu 10 mẫu dựa triệu chứng bệnh ASF lợn sốt cao, da sung huyết đến tím bầm xuất huyết vùng bụng, chảy dịch mũi trắng, đặc có lẫn máu, ngồi bị bón tiêu chảy có máu Các mẫu đánh ký tự, trữ dung dịch PBS bảo quản - 20 °C suốt trình nghiên cứu 3.2 Kết PCR phát Sau DNA virus tách chiết cách sử dụng Kit tách chiết TopPURE GENOMIC DNA công ty ABT, Việt Nam theo hướng dẫn nhà sản xuất Chúng tơi có 10 mẫu DNA nghi ngờ nhiễm ASFV chạy PCR với cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 Theo nghiên cứu Yuki Luo cộng sự, sản phẩm PCR khuếch đại hai cặp mồi có kích thước 278 bp 257 bp Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng cặp moi OIE-F/R kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,2 % (Hình 3.1, Bảng 3.1) Ket điện di sản phẩm PCR cho thấy có mẫu (số 8, 10, 11, 12, 18, 19) lên band, band sáng rõ có kích thước tương đương khoảng 278 bp (Hình 3.1) Các mẫu lại (số 3, 4, 22, 23) cho kết âm tính Cặp moi OIE-F/R sử dụng nghiên cứu Yuki Luo cộng 16 M 10 11 12 18 19 22 23 Hình 3.1 Ket phản ứng PCR phát mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với moi OIE-F/R Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi PPA-1/2 đuợc kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,2 % (Hình 3.2, Bảng 3.1) Ket điện di hình 3.2 có mẫu DNA (số 8, 10, 11, 12, 18) lên band, band lên đậm sáng, rõ có kích thước khoảng 257 bp Mầu DNA số 3, lên band, band lên mờ Các mẫu lại (mẫu DNA số 19, 22, 23) cho kết âm tính Cặp mồi PPA-1/2 sử dụng nghiên cứu Yuki Luo cộng M 10 11 12 18 19 22 23 2500 2000 1500 1000 800 400 200 Hình 3.2 Kết phản ứng PCR phát mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với mồi PPA-1/2 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng hai cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 cho kết dưong tính với ASFV 6/10 7/10 Cả hai cặp mồi lên band sáng rõ mẫu DNA số 8, 10, 11, 12, 18 Ở mẫu DNA số 3, 4, 22 23 cặp mồi OIEF/R mẫu DNA số 19, 22 23 cặp mồi PPA-1/2 cho kết âm tính Tuy 17 nhiên, cặp môi OIE-F/R đặc hiệu mâu sô 19 (Hình 3.1) cặp mơi PPA-1/2 đặc hiệu mẫu số (Hình 3.2) Từ kết cho thấy cặp moi OIE-F/R PPA-1/2 đặc hiệu với chủng ASFV luu hành nuớc ta Để so sánh mức độ đặc hiệu hai cặp mồi cần phải thực số luợng mẫu ASFV nhiều Bảng 3.1 Thống kê kết PCR phát cặp mồi PCR mẫu STT -OIE-F/R PPA-1/2 - + - + + + 10 + + 11 + + 12 + + 18 + + 19 + - 22 - - 23 - - Tỷ lệ thành công 6/10 7/10 (+): duơng tính, (-): âm tính 3.3 Ket so sánh độ nhạy cặp mồi Sau có kết PCR phát xác định độ đặc hiệu, tiến hành so sánh độ nhạy sau đo nồng độ DNA mẫu (Bảng 3.2) Theo nghiên 18 cứu M Agủero cộng l, phản ứng PCR chạy với cặp mồi OIE-F/R PPA1/2 thực độ pha loãng số 10 liên tiếp 10 lần từ mẫu DNA số 18 chuẩn bị Bảng 3.2 Kết đo nồng độ DNA (ng/pl) Mầu Nồng độ DNA (ng/pl) Mầu 0,699 Mầu 10 3,873 Mầu 11 6,455 Mầu 12 4,713 Mầu 18 4,969 Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi OIE-F/R kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,2 % Ket cho thấy band sáng tưong đương với kích thước 278 bp mẫu gốc số 18 có nồng độ DNA 4,969 ng/pl (Hình 3.3) độ pha lỗng 10'1 10‘2 lên band sáng, rõ Các band lên bắt đầu mờ dần từ độ pha loãng 10'3 10'4 Cịn độ pha lỗng 10’5 đến 10‘10 khơng lên band Từ kết điện di (Hình 3.3) xác định giới hạn phát phản ứng PCR với cặp mồi OIE-F/R đến độ pha loãng 10'4 Tuy nhiên, độ pha loãng 10‘2 lên band sáng rõ giếng 10’1, dù lượng DNA hon so với ban đầu sau hịa lỗng bậc 10 Do đó, độ pha lỗng 10’2 nồng độ tốt cho phản ứng PCR chạy với moi OIE-F/R Cặp mồi OIE-F/R sử dụng nghiên cứu M Agủero cộng b 19 M ASFV-18 10'1 10'2 10'3 lo’* 10 s lo'6 10'7 10*® 10‘9 10'1° Hình 3.3 Độ nhạy phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OIE-F/R Sản phẩm PCR (khuếch đại cặp mồi PPA-1/2) kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,2 % Ket điện di cho thấy band thu có kích thước tương đương 257 bp (Hình 3.4), Ở độ pha lỗng 10’1, 10'2 10'3 band lên đậm, sáng, rõ Các band bắt đầu mờ dần độ pha loãng 10"4 10’5 Từ độ pha loãng 10’6 trở khơng lên band Từ kết điện di (Hình 3.4), xác định giới hạn phát phản ứng PCR với mồi PPA-1/2 độ pha loãng 10’5 độ pha loãng 10‘3 lên band sáng rõ giếng 10'1 10'2, dù lượng DNA so với ban đầu sau hịa lỗng bậc 10 Do đó, độ pha lỗng 10"3 nồng độ tốt cho phản ứng PCR chạy với mồi PPA-1/2 Cặp mồi PPA-1/2 sử dụng nghiên cứu M Agủero cộng * M ASFV-18 10'1 10'2 10'3 104 105 10® 10'7 1O‘S 10'9 1O10 Hình 3.4 Độ nhạy phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PPA-1/2 20 Khi so sánh kết điện di, ta thấy giới hạn phát phản ứng PCR cùa hai cặp mồi khác Bảng 3.3 Giới hạn phát ASFV cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 Mẩu OIE-F/R Mầu 18 PCR -PPA-1/2 IO'4 10'5 Độ nhạy xét nghiệm PCR ASFV sử dụng hai cặp moi OIE-F/R PPA-1/2, mẫu DNA số 18 chiết xuất từ dung dịch pha loãng nối tiếp chủng ASFV dựa gen B646L sử dụng làm mẫu phản ứng Ket điện di với cặp moi OIE-F/R (Hình 3.3) xác định giới hạn phát đến độ pha loãng 10'4 tử nồng độ DNA 4,969 ng/pl Cặp mồi PPA-1/2 (Hình 3.4) cho kết giới hạn phát đến độ pha lỗng 10'5 Từ đó, kết luận phản ứng PCR có độ nhạy cao sử dụng với cặp mồi PPA-1/2 Hai cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 khuếch đại gen B646L Gen B646L mã hóa cho protein p72 thuộc protein vỏ ASFV Đây gen sử dụng để xác định ASFV nhiều nghiên cứu trước M Agủero cộng (năm 2003) cung cấp phương pháp PCR có độ nhạy cao để phát nhanh chóng cụ the virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) sử dụng xét nghiệm chẩn đốn thưịng quy cho ASFV chương trình giám sát, kiểm soát diệt trừ b Yuzi Luo cộng (năm 2016) cho thấy xét nghiệm PCR cải tiến có độ xác cao, đặc hiệu, nhạy xét nghiệm PCR OIE xác nhận xét nghiệm 14 chủng ASFV đại diện cho bốn kiểu gen (I, V, VIII IX) từ khu vực địa lý khác Như nghiên cứu chúng tơi có kết tương tự với nghiên cứu giới báo cáo trước 3.4 Ket giải trình tự gen Sản phẩm khuếch đại mẫu số 18 từ cặp moi OIE-F/R PPA-1/2 giải trình tự hai chiều cơng ty 1st Base, Malaysia Trình tự thơ sau giải trình tự 21 hiệu chỉnh chưong trình BioEdit 7.2.6.1 Các trình tự loại bỏ hai đầu chứa nucleotide mơ hồ có tín hiệu bị nhiễu Trình tự có peak tín hiệu đều, khơng bị chồng lắp lên trình tự đủ chất lượng để sử dụng cho phân tích Hai trình tự giải theo hai chiều forward reverse consensus thành trình tư chương trình SeqMan 6.0 y tót íBa!!?««[» fit x» IíV kiwixkxw M Hình 3.5 Kết giải trình tự tốt ^MSeqmAligmMtEùr - fit Edit lit# Zwm Hrâtlilkiìt Flit AttwyApfiatioii SNA UHm X Hdp Hình 3.6 Ket giải trình tự nhiễu Trình tự gen B646L mã hóa p72 hiệu chỉnh, chép qua phần mềm EditSeq lưu dạng file text Các trình tự định danh bang BLAST NCBI (National Center for Biotechnology Information) Ket thu trình tự 22 khuếch đại hai cặp mồi OIE-F/R PPA-1/2 xác định ASFV, mức độ tương đồng 100 % với trình tự MN207061.1 sở liệu NCBI Ũ select all sequences selected GenBank Max Total Graphics Queiy Distance tree of'esuIts E Per Score Score Cover value Ident Description Q □ □ □ □ □ Accession African swine fever VTUS isolate HBNH-2019 structural protein p72 ÍB646L) gene complete cds 514 514 100% Ie-141 100.00% MWffiU African swine fever Virus isolate ASFV Wuhan 2019-1 ■ complete genome 514 514 100% le-141 100.00% MH398476.1 African swine fever virus isolate HBŨ2-ĨQ19 maiiy caosxi protein p72 (864ÔL) oene partial gls 514 514 100% Ie-141 100.00% MH175975.1 African swine fever virus strain ASFV HU 2018 complete genome 514 514 100% Ie-141 100.00% MH715134.1 African swine fever virus strain ASFVWCh:na;CAS19-O1.'2O19 complete genome 514 514 100% Ie-141 100.00% MH172388.1 African swine fever virus isolate ASFV.'lTU'MtM, complete genome 514 514 100% Ie-141 100.00% MK828478.1 Hình 3.7 Kết sau BLAST trình tự cặp mồi OIE-F/R ũ select all ỉ sequences selected GenBank Distance tree of results Total Query E Per Score Score Cover value Idem Max Description Graphics Accession fl African swine fever virus isolate HBNH-2019 structural protein p72 ỈB646L) gene complete cds 475 475 100% 4e-130 □ African swine fever virus isolate ASFV Wuhan 2019-1 complete genome 475 475 100% 4e-130 10000% MN39347Ộ1 n African swine fever virus strain ASFV HU 2018 complete ạenọme 475 475 100% 4e-130 100.00% MN715134.1 475 475 100% 4e-130 100.00% MN172368.1 475 475 100% 4e-130 10000% MK628478.1 475 475 100% 4e-130 100.00% LR7226QO.1 □ □ 10000% HN2Q7Q61.1 Hình 3.8 Kết sau BLAST trình tự cặp mồi PPA-1/2 3.5 Kết xây dựng phát sinh loài Dựa vào kết giải trình tự BLAST sở liệu NCBI vẽ phát sinh loài chủng ASFV phân lập, sử dụng chủng tham chiếu ASFV có kiểu gen khác từ I đến XXII Các chủng tham chiếu chủng phân lập thể hiện, phân nhóm thích phát sinh (Hình 3.9) Cây phát sinh vẽ dựa phần mềm MEGA 6.0 phương pháp Neighbor Joining Tree với model Kimura 2-parameter với bootstrap 1000 lan Cây phát sinh loài xây dựng dựa gen B646L ASFV, sử dụng 28 chủng tham chiếu Trong có chủng tham chiếu ASFV thuộc kiểu gen II, 21 chủng tham chiếu ASFV tương ứng với kiểu gen I, III kiểu gen XXII 23 Các chủng tham chiếu ASFV dòng phân lập từ Uganda (Uga 3/95 AF449476.1) thuộc kiểu gen X, phân lập từ Zimbabwe (ZIM/92/1 - DQ250119.1) thuộc kiểu gen XVII, phân lập từ Malawi (Ten 1/60 - AF301541.1) thuộc kiểu gen V, phân lập từ South Africa (Spec 245 - DQ250117.1) thuộc kiểu gen XXII, nhiều chủng khác phân lập từ nhiều nước giới 24 I— RSA 2/96/VP72/South Africa/1996/DQ250126.1 I— RSA 1/99/W /VP72 /South Africa /1999 /AF449477.1 LRSA 1/95/VP72/South Africa/1995/DQ250123.1 RSA 1/96/VP72/South Africa/1996/DQ250125.1 I - Ten 1/60 /VP72 /Malawi /1960/AF301541.1 Ba-! - Moz 1/94/VP72/Mozambique/1994/AF270711.1 Bot /99/VP72/Botswana/1999/AF504886.1 57 XIX ► —► IV > XX —► XXI —► V —► VI —► III - RSA 1/98/VP72/South Africa/1998/AF302818.1 ► VII I - Spec 245/VP72/South Africa/1992/DQ250117.1 ► XXII |- Moz 1/03/VP72/Mozambique/2003/FJ175199.1 |— • VN-20/VP72/Vietnam/2020 57 Moz 2/02/VP72/Mozambique/2002/AY351518.1 52 Moz 1/05/VP72/Mozambique/2005/FJ175200.1 Georgia 2007 /VP72 /Georgia /2007 /AM999764.1 Mad 1/98/VP72/Madagascar/1998/AF270706.1 Lus a/93/VP72/Zambia/1991/AY351563.1 75 Moz 1/02/VP72/Mozambique/2002/AY351517.1 |— Lisbon/57/VP72/Portugal/1957/AF301537.1 67I - ZIM/92/1/VP72/Zimbabwe/1992/DQ250119.1 Nam 1/95/VP72/Namibia/1995/DQ250122.1 - NYA/12/VP72/Zambia/1986/AY351555.1 I Tan 1/01/VP72/Tanzania/2001/AY494552.1 L Tan 1/03/VP72/Tanzania/2003/AY494550.1 56 I * XVII * XVIII ♦ XIV * XV ► XVI Sum/1411/VP72/Zambia/1983/AY351542.1 * XIII MFUE 6/1 /VP72/Zambia/1982/AY351561.1 ♦ XII I Moz 1/01/VP72/Mozambique/2001/AY351516.1 T- Kab/62/VP72/Zambia/1983/AY351522.1 Uga 1/95/VP72/Uganda/1995/AF449475.1 100 * Uga 3/95/VP72/Uganda/1995/AF449476.1 > VIII * XI ♦ IX ► X 0.005 Chú thích: Kiểu gen biểu thị số la mã I - XXII Hình 3.9 Cây phát sinh lồi mơ tả mối quan hệ gen B646L ASFV 25 Phân tích trình tự gen B646L mã hóa cho p72 sử dụng để phân tích kiểu gen chủng ASFV Cho đến nay, xác định 22 kiểu gen từ kiểu gen I đến XXII ASFV cách phân tích vùng gen virus Ket so sánh phần trình tự gen B646L từ mẫu phân lập đặt tên VN-20 với phân lập khác kiểu gen biết, xác định trình tự VN20 nằm gen B646L thuộc kiểu gen II Chủng nghiên cứu gần với dòng phân lập từ Châu Phi phân lập từ Zambia (Lus 1/93 - AY351563.1) phân lập từ lợn nhà sau bùng phát dịch ASF năm 1991, dòng từ Mozambique (Moz 1/03 FJ175199.1, Moz 2/02 - AY351518.1, Moz 1/05 - FJ175200.1, Moz 1/02 AY351517.1), phân lập từ Madagascar (Mad 1/98 - AF270706.1) thu vào năm 1998, dòng phân lập từ Georgia (Georgia 2007 - AM999764.1) Từ đó, kết luận cặp mồi PCR phát đặc hiệu với chủng ASFV lim hành Việt Nam Trong nghiên cứu này, phát sinh lồi (Hình 3.9) xây dựng dựa gen B646L chủng ASFV Vùng gen B646L sử dụng marker phân tử để xác định kiểu gen ASFV nhiều nghiên cứu trước 4-6 Rebecca J Rowlands cộng (2007) mô tả đặc điểm di truyền chủng ASFV liên quan đến đọt bùng phát dịch bệnh năm 2007 Georgia kết phân tích cho thấy nhóm phân lập Georgia kiểu gen II dựa gen B646L Padmasayee Papineni cộng (2015) phát virus ASF kiểu gen II Zimbabwe dựa gen B646L, tái xuất ASF quốc gia gọi ý kiểu gen virus lây lan qua miền đơng miền nam Châu Phi5 Lê Văn Phan cộng (2019) lần công bố nghiên cứu ASFV gây bệnh lợn Việt Nam phưong pháp real-time RT-PCR giải trình tự gen, nhóm tác giả cho thấy ASFV thuộc p72 có kiểu gen II, mức độ tương đồng trình tự gen 100 % với chủng ASFV phân lập Trung Quốc năm 2018 Georgia năm 2007 26 CHƯƠNG KÉT LUẬN Đe tài thu nhận 10 mẫu nhiễm ASFV gây bệnh lợn Hà Nội, Hưng Yên Phú Thọ thông qua triệu chứng bệnh lợn Phản ứng PCR phát sử dụng cặp mồi PPA-1/2 (tỷ lệ mẫu dương tính 7/10) cặp mồi OIE-F/R (tỷ lệ mẫu dương tính 6/10) 10 mẫu đặc hiệu với chủng ASFV lưu hành Việt Nam Phản ứng PCR độ pha loãng nối tiếp 10 lần sử dụng cặp mồi PPA-1/2 có độ nhạy cao cặp moi OIE-F/R Phân tích phát sinh lồi dựa gen B646L xác định chủng virus nghiên cứu thuộc kiểu gen II chủng ASFV 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO M Agũero, J Fernandez, L Romero, c Sanchez Mascaraque, M Arias, Sanchez Vizcaíno aJM Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples Journal of clinical microbiology 2003;41(9):4431 4434 Yuzi Luo, Stella A Atim, Lina Shao, et al Development of an updated PCR assay for detection of African swine fever virus Archives of virology 2017; 162(1): 191199 Van Phan Le, Dae Gwin Jeong, Sun-Woo Yoon, et al Outbreak of African Swine Fever, Vietnam, 2019 Emerging Infectious Diseases 2019;25(7) Shengqiang Ge, Jinming Li, Xiaoxu Fan, et al Molecular Characterization of African Swine Fever Virus, China, 2018 Emerging Infectious Diseases 2018;24(ll):2131-2133 Juanita van Heerden, Kerstin Malan, Biko M Gadaga, Spargo RM Reemergence of African Swine Fever in Zimbabwe, 2015 Emerging Infectious Diseases 2017;23(5):860-861 Rebecca J Rowlands LKD African Swine Fever Virus Isolate, Georgia, 2007 Emerging Infectious Diseases 2008; 14(12) 28 Chủ nhiệm đề tài Giảng viên hướng dẫn (Kỷ ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) 29 ... việc phát ASFV Xuất phát từ lý trên, đề xuất thực đề tài: ? ?ứng dụng phản ứng PCR phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn Việt Nam? ?? 1.2 Mục tiêu đề tài ứng dụng phản ứng PCR để phát virus dịch. .. phản ứng PCR để phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn Việt Nam 1.3 Khả ứng dụng đề tài ứng dụng phản ứng PCR để phát virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh lợn diện rộng CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ... Hà Nam Theo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi tái phát 155 xã 20 tỉnh, thành phố, buộc tiêu hủy gần 4.000 lợn Nguy dịch bệnh tiếp tục tái phát,