Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền liên quan đến khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và đối kháng nấm bệnh của vi khuẩn pseudomonas phân lập tại một số tỉnh miền nam việt nam

ĐẠT HỌC QUÓC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC TỤ NHIÊN CHƯ NGUYÊN THANH NGHIÊN CỦ MỘT SÓ ĐẶC ĐIỂM DI TRƯYÈN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG THÚC ĐÂY TĂNG TRƯỞNG THỤC VẬT VÀ ĐÔI KHÁNG NÁM BỆNH CỦA VI KHUẤN Pseudomonas PHÂN LẬP TẠI MỘT SÓ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM Ngành: Di truyền học Mã số ngành: 62420121 Phản biện 1: PGS TS Lê Đình Đôn Phán biện 2: PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp Phàn biện 3: GS TS Lê Huyền Ái Thúy Phản biện độc lập 1: TS Lê Tiến Dũng Phán biện độc lập 2: TS Huỳnh Hữu Đức Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Văn Lệ TS Hoàng Thị Thanh Minh Tp Hồ Chí Minh - Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Di truyền học, với đề tài “Nghiên cứu số đặc điếm di truyền liên quan đến khả thúc tăng trưó’ng thực vật đối kháng nấm bệnh vi khuẩn Pseudomonas phân lập số tỉnh miền nam Việt Nam” công trinh khoa học Tôi thực hướng dẫn PGS TS Bùi Văn Lệ TS Hoàng Thị Thanh Minh Những kct qua nghiên cứu cua luận án hồn tồn trung thực, xác khơng trùng lắp với cơng trình cơng bố ngồi nước Nghiên cứu sinh (Kỷ tên, ghi họ tên) MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT iv DANH MỤC CÁC BÁNG .V DANH MỤC CÁC HÌNH VÊ, ĐỔ THỊ vi Mở đầu Chương 1:TỔNG QUAN 1.1 Tong quan vi khuan Pseudomonas 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Đặc điêm hình thái, sinh lý, sinh hóa sinh thái 1.1.3 Đặc đicm gcnc 1.2 Sự tương tác Pseudomonas với vùng rễ thực vật 1.2.1 Rhizospheric - Sự xâm chiếm vùng rề thực vật 1.2.2 Endophytic - Sự nội sinh rễ thực vật 10 1.3 Cơ chế thúc đày tăng trường thực vật cũa Pseudomonas .12 1.3.1 Pseudomonas hoạt động loại phân bón sinh học 13 1.3.2 Càm ứng phát triển hệ rề 19 1.3.3 Bào vệ thực vật khỏi tác nhàn gây bênh 22 1.3.4 Bâo vệ thực vật khỏi điều kiện bấtlợi cũa môi trường 27 1.3.5 Vai trò vi khuẩn trợ giúp 28 1.4 Tiếp cận khai thác gcnc nghicn cửu PGPR .29 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 35 1.5.1 Nghiên cứu giới .35 1.5.2 Nghiên cứu nước 36 Chương 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 37 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Mầu đẩt rễ .37 2.1.1 Hạt giống vật liệu thực vật 38 2.1.2 Chúng nẩm bệnh thực vật 39 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử mơi trường ni cấy 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 42 Trang i 2.2.1 Phân lập tuycn chọn vi khuân 43 2.2.2 Giải trình tự gene phân tích bioinfonnatic 47 2.2.3 Nghiên cứu ãnh hưởng vi khuân lên tăng trường thực vật 49 2.2.4 Nghiên cứu ức chế nấm bệnh cua vi khuẩn 53 2.2.5 Phương pháp xử lý thống kè .55 Chương 3: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 56 3.1 Phân lập, tuyển chọn định danh vi khuẩn 56 3.1.1 Phân lập nhận diện vi khuẩn 56 3.1.2 Tuyển chọn chủng thúc tăng trướng thực vật 59 3.1.3 Tuyển chọn chủng đối kháng nấm bệnh 63 3.1.4 Đặc điểm gene vị trí phàn loại cua chững PS01 67 3.1.5 Đặc điêm gene vị trí phân loại cua chủng AF10 76 3.2 Cơ chế thúc tăng trương thực vật cùa PS01 điều kiện không stress 83 3.2.1 Đáp ứng rễ A thalỉana với chung PS01 84 3.2.2 Vai trò IAA vi khuân đáp ứng rề A thaỉiana 87 3.2.3 Ánh hương cua PSOI lên tổng hợp auxin nội sinh phân bo auxin 98 3.2.4 PSO1 thúc đẩy tăng trường cùa bắp vườn ươm 103 3.2.5 Đặc đièm gene cua PS01 liên quan đến thúc tâng trướng thực vật 105 3.3 PS01 thiện tăng trưởng cúa thực vật điều kiện stress mạn 114 3.3.1 Thử nghiệm khả chịu mặn cùa chủng PS01 114 3.3.2 PS01 táng cường tính chống chịu với stress mặn cùa A thalìana .115 3.3.3 PS01 cải thiện thơng số tăng trưởng cua bắp điều kiện stress mặn 124 3.3.4 Đặc diêm gene cùa vi khuấn liên quan đến khả tăng cường tính chống chịu với stress mặn cúa thực vật 127 3.4 Khả đối kháng nấm bệnh cua chủng Pseudomonas 129 3.4.1 Pseudomonas ức chế nảy mam cùa bào tử c acutatum 129 3.4.2 Pseudomonas ức chế tăng trưởng sợi nấm 132 Trang ii 3.4.3 Đặc điểm gene cùa vi khuấn liên quan đến kha đối kháng với nấm bệnh 136 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 58 4.1 Kết luận 146 4.2 Tính luận án 147 4.3 Giới hạn cúa luận án 147 4.4 Kiến nghị 148 DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ 149 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 150 PHỤ LỤC .180 rang iii LỜI CẢM ƠN z Xin gửi lời tri ân sâu săc đên PGS TS Bùi Văn Lệ, người thây kiên nhân f _ r hướng dân suôt thời gian thực luận án Xin cám ơn thây cô môn chia sé kicn thức, kỹ cỏ nhừng đóng góp xây dựng giúp luận án hoàn thành Xin cám ơn TS Hoàng Thị Thanh Minh, người bạn, người thây cộng đăc lực tới ci hành trình Xin cám ơn tất cà cộng Đào Ngọc Điệp, Nguyễn Thị Bạch Lê, Nguyễn Yen Nhi, Trần Thị Hoài Bảo, Nguyễn Hồng Bửu Vinh, Nguyễn Thải Ngọc Dù cho không the đen cuối hành trình, mồi chặng đường có thành kỷ niệm khó quèn Xin cám ơn bạn Thiên Phúc nhiệt tình hỗ trợ dẫn cơng cụ phân tích sinh tin học Xin cám ơn TS Nguyễn Hồng Nhã Trân, TS Trần Minh Tuấn, TS Bùi Hồng Báo Ngọc tận tình giúp đỡ việc chinh sứa công bố báo khoa học Xin cám ơn TS Nguyễn Mỳ Nương đà cỏ mặt kịp thời trợ giúp khúc mắc thủ tục báo vệ luận án Xin cám ơn tât ca ân nhân dã giúp đỡ cách hay cách khác, giúp cho luận • án • hình thành hồn thiện • Cũng khơng qn cám ơn gia đình ln động viên chờ đợi diêm r cuôi cúa hành trinh Xin chân thành cám ơn tât cà DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL: N-acyl-l-homoserine lactone AM: Arbuscular mycorrhiza ANI: Average Nucleotide Identity - độ tương dong nucleotide trung bình BGC: Biosynthetic gene cluster BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Bp: base pair - cặp bazo BSL: Biosafety Level - Cap độ an toàn sinh học CDS: Coding sequence - trình tự mã hố COG: Cluster of Orthologous Group - cụm gene tương tự EPS: exopolysaecharide IAA: Indole Acetic Acid ISR: Induction of Systemic Resistance - Sự cảm ứng hệ thống kháng KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Mbp: Mega base pair NCB1: National Center for Biotechnology Information (US) NST: nhiem sac the PCR: Polymerase chain reaction PE: polyethylene PGPR: Plant growth promoting rhizobactcria QS: Quorum - Sensing RH: root hair - lông rễ Trp: Trytophane VOC: Volatile Organic Compound - hợp chat hữu bay Trang iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Báng 1-1 Đặc điểm gene cua số loài thuộc chi Pseudomonas [37] Bàng 2-1 Thông tin mẫu địa điểm lấy mẫu 37 Báng 2-2 Các chúng nam bệnh sử dụng nghiên cứu 39 Báng 2-3 Trình tự mồi cho A thaliana 41 Bảng 3-1 Kết phân lập định danh ban đầu chùng vi khuẩn 57 Băng 3-2 Kha cố dịnh đạm, hoà tan phosphate sinh tông hợp phytohormone IAA cùa chủng vi khuẩn 61 Bảng 3-3 Khà đối kháng nấm bệnh chung p aeruginosa 65 Báng 3-4 So sánh kết lắp ráp trình tự gone cùa PS01 sử dụng công cụ SPADES VELVET 68 Bảng 3-5 So sánh đặc điếm gene chúng p taiwanensis 72 Báng 3-6 So sánh kết lắp ráp trình tự gene AF10 sử dụng công cụ SPADES VELVET 77 Báng 3-7 Gene sinh tổng hợp 1AA PS01 89 Báng 3-8 Gene sinh tổng hợp số voc cua PS01 93 Bảng 3-9 Gene liên quan đến xâm chiếm định cư tạivùng rề cua PS01 108 Báng 3-10 Gcnc liên quan đến hịa tan khống hóa p cua PS01 110 Bàng 3-11 Gone sinh tổng hợp pyovcrdinc cùa PS01 112 Báng 3-12 Gene mà hoá cho enzyme thuỷ giái cúa PS01 113 Báng 3-13 Gcnc liên quan đến kliá tăng cường tính chống chịu stress mặn thực vật PS01 127 Bâng 3-14 Gene sinh tông hợp chất đối khảng AF10 138 Trang V DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1-1 Anh chụp SEM vi khuân Pseudomonas aeruginosa Hình 1-2 Mơ hình hệ vi sinh vật rễ Hình 1-3 Tóm lược chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật Pseudomonas Hình 1-4 Tổng quan đường sinh tổng hợp 1AA vi khuẩn 21 Hình 1-5 Quá trình tuyển chọn PGPR cho mục đích ứng dụng 31 Hình 1-6 Pan-genome 20 gene Pseudomonas tiêu biểu 34 Hình 2-1 Tóm lược nội dung nghiên cứu thí nghiệm thực 42 Hình 2-2 Quy trình gian lược hướng dẫn xử lý liệu lấp ráp gene 47 Hình 3-1 Ảnh hưởng cua chúng vi khuẩn lên sinh khối A thaliana 60 Hình 3-2 Khà ức chế nấm bệnh cua PS01 64 Hình 3-3 Hiệu kháng nấm phổ rộng cúa Pseudomonas AF10 66 Hình 3-4 Bân phác thảo gene PS01 thê dạng vòng 69 Hình 3-5 Dự đốn diện plasmid bân thào gene PS01 70 Hình 3-6 Độ tương đong trinh tự DNA PS01 chủng p taiwanensis khác 73 Hình 3-7 Trắc đồ chức COG PS01 chùng p taiwanensis khác 74 Hình 3-8 Biểu đồ Venn bốn chủng p taiwanensis 76 Hình 3-9 Bàn phác thào gene AF10 thể dạng vòng 78 Hình 3-10 Dự đốn diện plasmid thảo gene AF10 .79 Hình 3-11 Độ tương đơng trình tự DNA AF10 chúng p aeruginosa khác 81 Hình 3-12 Trắc đồ chức COG cua AF10 chủng p aeruginosa khác 82 Hình 3-13 Ảnh hướng cùa PS01 lên kiến trúc hệ rễ A thaliana 85 Hình 3-14 PSO1 thúc đẩy khởi phát rễ bên A thaliana 86 Hình 3-15 Vai trị hợp chất khuếch tán voc sinh PS01 lên biến đồi kiến trúc rễ A thaliana 91 Trang vi Hình 3-16 Vai trị auxin vi khuẩn sụ biến đổi kiến trúc rc qua trung gian PS01 95 Hình 3-17 Ánh hưởng PS01 lên biếu gene điều hòa phát triển rễ bên phụ thuộc auxin A thaliana .96 Hình 3-18 Ảnh hưởng cua PS01 lên biêu gene sinh tông hợp tryptophan auxin Arabidopsis 99 Hình 3-19 Anh hướng PS01 lên biêu gene tham gia vận chuyển truyền tín hiệu auxin Arabidopsis 100 Hình 3-20 Pseudomonas PS01 làm gia tăng biên độ gradient auxin vùng rễ cua A thaliana 101 Hình 3-21 Vai trị cua q trình vận chuyển auxin biến đồi kiến trúc rễ A thaỉiana qua trung gian PS01 102 Hình 3-22 Hiệu cua việc bố sung vi khuẩn PS01 lên sinh trướng bẳp 104 Hình 3-23 Một số đặc điểm thúc đẩy tăng trường thực vật cùa PS01 106 Hình 3-24 Khá tăng trưởng Pseudomonas PSO1 nồng độ muối khác 115 Hình 3-25 PS01 thiện tỉ lệ mầm hạt A thaliana điều kiện stress mặn 116 Hình 3-26 PS01 gia tăng tỉ lệ sống cày A thaliana điều kiện stress mặn 119 Hình 3-27 Pseudomonas PS01 làm thay đối biổu so gene liên quan đến tinh chổng chịu stress abiotic cua A thaliana 122 Hình 3-28 Pseudomonas PS01 tâng khả chống chịu với stress A thaỉiana giai đoạn trường thành 124 Hình 3-29 PS01 cải thiện tĩ lệ mầm hạt bắp điều kiện stress mặn 125 Hình 3-30 PS01 thúc tăng trướng bắp điều kiện stress mặn 126 Hình 3-31 Các chung Pseudomonas ức chế nảy mầm cùa bào từ nấm c acutatum 130 Trang vii Microbiology Letters, 199(2), 153-160 [379] Kenny, M et al (2012), Germination and growth of Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides isolates from coffee in Papua New Guinea and their pathogenicity' to coffee berries, Australasian Plant Pathology, 41,519 528 [380] Slade, S.J Ct al (1986), The role of a bacterial siderophore and of iron in the germination and appressorium formation by conidia of Colletotrichum acutatum, Microbiology, 132(1), 21-26 [381] Vincent, J.M (1947), Distortion of fungal hyphae in the presence of certain inhibitors, Nature, 159(4051), 850 [382] Hofte, M (2021), The use of Pseudomonas spp as bacterial biocontrol agents to control plant disease, in: Microbial bioprotectants for plant disease management, Burleigh Dodds Science Publishing [383] Laville, J Ct al (1998), Characterization of the hcnABC gene cluster encoding hydrogen cyanide synthase and anaerobic regulation by ANR in the strictly aerobic biocontrol agent Pseudomonas fluorescens CHAO, Journal of Bacteriology, 180( 12), 3187-3196 [384] Siddiqui, LA et al (2006), Role of cyanide production by Pseudomonas fluorescens CHAO in the suppression of root-knot nematode, Meloidogyne javanica in tomato, World Journal of Microbiology and Biotechnology 2005 22:6, 22(6), 641-650 [385] Kang, B.R Ct al (2019), I lydrogen cyanide produced by Pseudomonas chlororaphis 06 is a key aphicidal metabolite, Canadian Journal of Microbiology, 65(3), 185-190 [386] Devi, K.K.; Kothamasi, D (2009), Pseudomonas fluorescens CHAO can kill subterranean termite Odontotermes obesus by inhibiting cytochrome c oxidase of the termite respiratory chain, FEMS Microbiology Letters, 300(2), 195-200 [387] Flury, p et al (2017), Antimicrobial and insecticidal: Cyclic lipopeptides and hydrogen cyanide produced by plant-beneficial Pseudomonas strains CHAO, CMR12a, and PCL1391 contribute to insect killing, Frontiers in Microbiology, 8(FEB), 100 [388] Voisard, c et al (1989), Cyanide production by Pseudomonas fluorescens helps suppress black root rot of tobacco under gnotobiotic conditions, The EMBO Journal, 8(2), 351-358 [389] Mavrodi, D V et al (2006), Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp biosynthesis and regulation Annual Review ofPhytopathology, 44, 417 445 [390] Price-Whelan, A et al (2006), Rethinking “secondary’' metabolism: Physiological roles for phenazine antibiotics, Nature Chemical Biology', 2(2), 71-78 [391] Biessy, A.; Filion, M (2018), Phenazines in plant-beneficial Pseudomonas spp.: biosynthesis, regulation, function and genomics, Environmental Microbiology, 20(11), 3905- Trang 178 PS01(+) AF10(+) Phản ứng oxidase PSO1(+) AF10(+) Phản ứng catalase PSOI AFIO PSOl(-) AFIO(-) Sự sản sinh urease PSO1(+) AF10(+) Phán ứng TSI Phản ứng ODC Phản ứng LDC PSOl(+) AFIO(-) PSOI (-) AFIO(-) AF10(+) Phản ứng ADH PSO1 (-) Phản ứng ON PG AFIO(-) Sự san sinh Indol PSO1(+) AF10(+) Khả làm tan chảy gelatine Hình s_ Một số đặc điếm sinh hoá CO' hản chủng vi khuấn PHỤ LỤC MỘT SÓ HÌNH ẢNH & DỮ LIỆU THÍ NGHIỆM Hình thái khn lạc mơi trường King B Hình thái khn lạc mơi trường Mac Conkey Agar F •» Hình thái tê bào kính hiên vi quang học Hình s_ l Hình thái khuân lạc hình thái tê bào chùng vi khuân Mạch xuôi Mạch ngược Trước xử lý QVtlryttơM «:rox« Hl /rtưrre i Q»itct1r< Sau xù’ lý Hình s_ Kết xử lý trình tự đọc cúa AF10 Biếu đồ thống kê điếm chất lượng theo vị tri cùa tát cá base dục theo trình tự đọc (ỉ - 250 bp) Vùng máu xanh chi rư vị trì base có chát lượng cao Vùng màu hơng chì base chát lượng tháp Mạch xi ộutìrtr, ° ktar tttra ? 1514 30 34 49 4044 75 79 9004 111114 Mạch ngược Ibsranâ 10 tìíKQđnql 1351» 1« 144 105109 r^kíairi 4CfOM 210214 233 230 34 ?