Tuyển chọn và khảo sát đặc điểm đối kháng colletotrichum siamense của vi khuẩn bacillus spp

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Tuyển chọn khảo sát đặc điểm đối kháng Colletotrichum siamense vi khuẩn Bacillus spp Mã số đề tài: 21.2SHTP01 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Diệu Hạnh Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm Tp Hồ Chí Minh – 3/2023 Tp Hồ Chí Minh, … LỜI CÁM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn: - Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM hỗ trợ kinh phí cho đề tài - Phịng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế hỗ trợ chúng tơi việc hồn thành hồ sơ đề cương nghiệm thu đề tài - Ban lãnh đạo phận quản lý Phịng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM tạo điều kiện để thí nghiệm thực - Phịng thí nghiệm Vi sinh vật học, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM cung cấp giống vi sinh vật cho nghiên cứu - Các em Học viên – Sinh viên nghiên cứu học tập Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM tham gia thực thí nghiệm đề tài PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn khảo sát đặc điểm đối kháng Colletotrichum siamense vi khuẩn Bacillus spp 1.2 Mã số: 21.2SHTP01 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Ngọc Ẩn Mã Thị Anh Thư Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Chủ nhiệm đề tài thực nội dung: - Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả đối kháng C siamense - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn - Viết đề cương chi tiết - Chịu trách nhiệm tổng thể tất thí nghiệm đề tài - Viết báo cáo tổng kết đề tài, viết báo khoa học Viện CNSH&TP - - Kiểm tra hiệu ức chế C Trường ĐHCN Tp siamense dịch vi khuẩn điều kiện in situ HCM - Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C siamense Viện CNSH&TP - - Tuyển chọn chủng vi Trường ĐHCN Tp khuẩn thuộc chi Bacillus có khả đối kháng C HCM siamense - Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C siamense - Xử lý số liệu - Khảo sát ảnh hưởng CHSH9A- Viện CNSH&TP -Trường yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng ĐHCN Tp HCM dịch ni cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn Viện CNSH&TPTrường ĐHCN Tp HCM 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng có 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 20 triệu đồng (Hai mươi triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Anthracnose hay gọi bệnh thán thư, loại bệnh thường gặp trồng loại ăn xoài, dâu tây, quýt, long số gia vị ớt, điều, theo James C Mertely mô tả lại bệnh thán thư xuất dâu tây bị bệnh, thường xuất tổn thương dạng đốm đen nâu, trũng vị trí bệnh thường xuất thời tiết ẩm ướt [1], triệu chứng chung cho nhiễm bệnh thán thư hầu hết loại trồng bị nhiễm bệnh Tại Trung Quốc, theo Y.-Z Diao báo cáo loài nấm gây bệnh thán thư làm tổn hại đến 30 chi thực vật, có ớt, làm tổn hại đến suất tới 40% [2] Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Hưng phân loại chi nấm Colletotrichum gây tổn hại đến ớt đồng sơng Hồng có lồi C truncatum, C fructicola, C gloeosporioides, C aeschynomenes C siamense [3], Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển nên bệnh thán thư xuất nhiều, theo Lê Hoàng Lệ Thủy báo cáo vào năm 2008 loài gây hại xoài sầu riêng đồng sông Cửu Long Colletotrichum acutatum gây hại lá, hoa xoài Colletotrichum gloeosporioides gây hại xoài lẫn sầu riêng [4] Ngoài ra, bệnh thán thư Việt Nam gây hại cà phê, theo báo cáo Nguyễn Thanh Hà năm 2011 [5], lồi mơ tả loại chủ chốt nông nghiệp nước ta, ảnh hưởng bệnh thán thư làm ảnh hưởng lớn đến suất ảnh hưởng nhiều đến kinh tế, việc tìm biện pháp nhằm ngăn ngừa điều trị bệnh thán thư trồng vơ cần thiết Đối với phương pháp phịng bệnh thơng thường tỉa cành giảm bớt phần thiệt hại bệnh gây khơng triệt để mầm bệnh lan nhanh rộng găp điều kiện ẩm ướt Bên cạnh đó, phát bệnh, nhiều nơng dân sử dụng biện pháp dùng thuốc trừ sâu diệt cỏ dại mà rõ nguồn gốc gây bệnh nấm mốc nên hiệu Các thuốc diệt nấm thường khó phân hủy tích tụ, gây ô nhiễm môi trường sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe người động vật Ngoài ra, thuốc diệt nấm có chất hóa học bị lạm dụng gây nên đột biến kháng thuốc chủng nấm mốc [6, 7] Trong năm gần đây, chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh thực vật quan tâm nhằm bảo vệ, phòng diệt trừ nấm bệnh trồng trọt lợi ích thân thiện mơi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe có hiệu cao Nhiều nghiên cứu thực để ứng dụng vi sinh vật ức chế bệnh thán thư Colletotrichum gây Wilasinee Konsue nghiên cứu việc sử dụng nấm men điều trị bệnh thán thư xoài, hay ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis OE-04 đối kháng Colletotrichum gossypii gây bệnh bông, Bacillus velezensis CE 100 ức chế bệnh Colletotrichum gloeosporioides óc chó, Bacillus safensis sp QN1NO-4 chống lại bệnh thán thư dâu tây Colletotrichum fragariae, hay Bacillus subtilis HM1 kiểm soát sau thu hoạch táo để ngăn ngừa nấm mốc Colletotrichum acutatum, hay vi khuẩn Bacillus methylotrophicus, Bacillus thuringiensis ức chế phát triển Fusarium oxysporum, Botryosphaeria sp., Trichoderma atroviride, Colletotrichum gloeosporioides, and Penicillium expansum sơn trà [8-13] Như vậy, qua báo cáo ghi nhận, chi vi khuẩn Bacillus nghiên cứu ứng dụng bật việc ức chế loại bệnh nấm mốc gây ra, đặc biệt Colletotrichum Trên sở đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài "Tuyển chọn khảo sát đặc điểm đối kháng Colletotrichum siamense vi khuẩn Bacillus spp." nhằm hướng tới việc sản xuất chế phẩm sinh học có khả ức chế nấm C siamense gây bệnh trồng, mang lại nhiều lợi ích mặt kinh tế, bảo vệ sức khỏe cộng đồng môi trường tự nhiên Mục tiêu a Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus xác định đặc điểm đối kháng với nấm Colletotrichum siamense gây bệnh thán thư b Nội dung đề tài - Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả đối kháng C siamense - Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn lên hệ sợi tơ nấm C siamense - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng dịch ni cấy chủng vi khuẩn - Kiểm tra hiệu ức chế C siamense dịch vi khuẩn điều kiện in situ mơ hình xồi Phương pháp nghiên cứu 3.1 Nhân giống bảo quản chủng vi khuẩn, nấm mốc Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (35 chủng) chủng nấm mốc Colletotrichum siamense gây bệnh thán thư sử dụng làm đối tượng nghiên cứu lưu trữ sưu tập giống Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh, điều kiện -70C Các chủng vi khuẩn Bacillus spp hoạt hố qua đêm mơi trường Luria-Bertani broth (LB broth) (Himedia-India, tryptone 10,0 g; cao nấm men 5,0 g; NaCl 10,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) 37C, 150 vòng/phút chủng nấm mốc kiểm định nuôi cấy môi trường PGA (Khoai tây 200 g, chiết dịch; Glucose 20,0 g; Agar 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) nhiệt độ phòng ngày trước thực nghiên cứu 3.2 Đánh giá khả đối kháng nấm mốc kiểm định chủng vi khuẩn Bacillus spp Khả đối kháng nấm mốc kiểm định C siamense 35 chủng vi khuẩn Bacillus spp đánh giá dựa phương pháp khuếch tán giếng thạch [14] Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB broth, lắc 150 vòng/phút, 37°C 16 để chuẩn bị cho việc đánh giá khả đối kháng nấm mốc Bên cạnh đó, chủng nấm mốc C siamense ni cấy mơi trường PGA nhiệt độ phịng Các mảnh thạch có chứa hệ sợi tơ nấm mốc ngày tuổi có đường kính 5,0 mm đặt vào tâm đĩa Petri có chứa mơi trường PGA Sau ngày, đĩa Petri đục giếng thạch cách mép đĩa 1,0 cm nhỏ 100 μL dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Các đĩa tiếp tục ủ nhiệt độ phòng quan sát phát triển hệ sợi tơ nấm sau ngày nuôi ủ Khả đối kháng chủng vi khuẩn đánh giá thông qua khả ức chế phát triển hệ sợi tơ nấm dựa quan sát hệ sợi tơ nấm từ tâm đĩa Petri đến lỗ thạch chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn so với vị trí khác Mức độ mạnh yếu hoạt tính đối kháng với nấm C siamense chủng Bacillus tùy thuộc vào khoảng cách ức chế hệ sợi tơ nấm chủng vi khuẩn, hay cịn gọi bán kính kháng mốc đo từ mép khuẩn lạc vi khuẩn đến vi trí tơ nấm bị ức chế 3.3 Khảo sát khả sinh enzyme chitinase Bacillus spp Khả sản sinh enzyme ngoại bào chitinase kiểm tra thơng qua vịng phân giải chất mơi trường thạch tương ứng Các đĩa mơi trưởng LB có chứa 10g chất chitin, sử dụng để kiểm tra khả sinh tổng hợp enzyme chitinase Chủng vi khuẩn Bacillus spp tăng sinh môi trường lỏng LB qua đêm cấy vào đĩa môi trường kiểm định Sau ngày ủ 37℃, vòng phân giải cho hoạt tính chitinase kiểm tra thuốc thử lugol [15] 3.4 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy Bacillus spp lên hệ sợi tơ nấm mốc Ảnh hưởng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp lên hệ sợi tơ nấm mốc kiểm tra cách ủ hệ sợi tơ nấm nuôi môi trường PGB (Khoai tây 200 g, chiết dịch; Glucose 20,0 g; nước cất đủ 1000 ml; pH 7,0-7,2) thời gian ngày với dịch vi khuẩn tăng sinh 37°C, 150 vòng/phút 16 (dịch tăng sinh vi khuẩn ly tâm 4000 vòng 15 phút, thu dịch nổi, dịch sau lọc qua màng lọc 0,45 µm) Sự phát triển hệ sợi tơ nấm mốc mơi trường PGB có khơng có dịch vi khuẩn kiểm tra sau ngày ủ cách quan sát kính hiểu vi quang học độ phóng đại 1000 lần [16] 3.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, điều kiện pH proteinase K lên hoạt tính kháng C siamense Bacillus spp Độ bền nhiệt dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp lên hoạt tính kháng mốc C siamense khảo sát cách ủ dịch nuôi cấy vi khuẩn nhiệt độ khác 60°C, 70°C, 80°C 90°C khoảng thời gian phút, 10 phút 15 phút, sau kiểm tra hoạt tính kháng mốc cịn lại dịch nuôi cấy vi khuẩn phương pháp khuếch tán giếng thạch Độ bền pH dịch nuôi cấy vi khuẩn kiểm tra tương tự cách điều chỉnh pH dịch nuôi cấy dung dịch NaOH HCl hấp khử trùng cho pH dịch nuôi cấy đạt giá trị 3,0 đến 10,0 ủ giờ, sau kiểm tra hoạt tính kháng mốc cịn lại dịch ni cấy vi khuẩn phương pháp khuếch tán giếng thạch Hoạt tính kháng mốc thể phần trăm hoạt tính ức chế tơ cịn lại nghiệm thức so với hoạt tính dịch ni cấy vi khuẩn ban đầu [17] Ảnh hưởng proteinase K lên hoạt tính kháng mốc khảo sát cách ủ dịch nuôi cấy vi khuẩn với proteinase K nồng độ 1,0 mg/ml 37°C, sau kiểm tra hoạt tính phương pháp khuếch tán giếng thạch [18] Hoạt tính kháng mốc cịn lại dịch ni cấy sau xử lý điều kiện khác tính bán kính kháng mốc mẫu thực nghiệm chia cho bán kính kháng mốc mẫu đối chứng Kết trình bày theo tỷ lệ phần trăm (%) 3.6 Khảo sát khả đối kháng C siamense vi khuẩn Bacillus spp xoài Khả đối kháng vi khuẩn Bacillus spp lên nấm mốc C siamense thực vật kiểm tra với mơ hình xồi Quả xồi cát lựa chọn vừa chín khơng có vết thương Các xồi rửa nước cất vơ trùng, rửa với clorin 100 ppm, rửa lại với nước cất vô trùng sát trùng cồn 70° Các xoài tạo vết thương vị trí kim tiêm thân xoài với độ sâu 0,2-0,3 cm Dịch huyền phù sợi nấm C siamense chuẩn bị cách nuôi hệ sợi tơ nấm môi trường PGB sau ngày, phối trộn với môi trường LB vơ trùng theo tỷ lệ 1:1 tiêm 10 µl vào xoài tạo mẫu đối chứng (+) Hỗn hợp dịch huyền phù sợi nấm dịch nuôi cấy vi khuẩn (tăng sinh 37°C, 150 vòng/phút 16 giờ) phối trộn theo tỷ lệ 1:1 tiêm 10 µl vào xồi tạo mẫu thử nghiệm Mẫu đối chứng (-) thực cách tiêm 10µl mơi trường LB vơ trùng Quả xồi sau để khơ dịch tiêm đặt vào buồng ẩm khử trùng trước Kết theo dõi sau ngày quan sát mức độ biểu bệnh Mức độ biểu bệnh tính tốn cách đo diện tích bề mặt mẫu có biểu bệnh phần mềm QuPath v0.4.0 [19] Phần trăm biểu bệnh tính mức độ biểu bệnh mẫu thực nghiệm chia cho mức độ biểu bệnh mẫu đối chứng (-) 3.6 Định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Bacillus định danh mức phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA phịng thí nghiệm Cơng nghệ động vật (Trường Đại học Konkuk, Seoul, Hàn quốc) với cặp mồi sử dụng 27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3' [20] Kết giải trình tự so sánh với sở liệu 16SrRNA vi khuẩn có sẵn National Center for Biotechnology Information (NCBI) Các trình tự gene tương đồng truy xuất từ Genbank (NCBI, [htpp://www/ncbi.nlm.nhi.gov]) gióng Clustal X2.1 Cây phát sinh loài xây dựng dựa thuật toán UPGMA với Bootstrap 1000 lần lập phần mềm Mega5 [21] 3.7 Phương pháp thống kê xử lý số liệu Giá trị kết thí nghiệm trung bình lần lặp lại Số liệu tính tốn, vẽ biểu đồ Microsoft Excel 2013 xử lý thống kê phương pháp ANOVA phần mềm Statgraphics Centurion 18 Tổng kết kết nghiên cứu Kết nghiên cứu đề tài đạt số hiệu mặt khoa học đào tạo sau: - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả đối kháng C siamense - Quan sát biến đổi hệ sợi tơ nấm C siamense tác động dịch nuôi chủng vi khuẩn tuyển chọn - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, protease lên hoạt tính đối kháng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn lên phát triển hệ sợi tơ nấm mốc - Xác định hiệu ức chế mức độ biểu bệnh mơ hình xồi dịch nuôi cấy vi khuẩn - Công bố báo khoa học Tạp chí Cơng nghệ IUH Đánh giá kết đạt kết luận Qua trình thực nghiên cứu, kết thu sau: - Từ 35 chủng vi khuẩn Bacillus, sàng lọc chủng vi khuẩn D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II N9 có hoạt tính đối kháng Colletotrichum siamense tốt - Hầu hết chủng cho khả phân giải chitin cao làm ảnh hưởng đến cấu trúc vách tế bào nấm chitin thành phần có tơ nấm mốc, khả phân giải chitin cao chủng TH14 (1,83cm); TH5 (1,77cm); khả phân giải chitin yếu chủng N9 (1,27cm) - Hầu hết hợp chất kháng mốc dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn bền khoảng pH rộng (pH 3,0-10,0) (hoạt tính cịn lại 60%) bền nhiệt lên đến 80°C 15 phút (hoạt tính cịn lại 40%) - Khi kiểm tra tác động proteinase K đến hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cho thấy chủng D7, D19, TH5, TH24, N9 bị ảnh hưởng giảm hoạt tính kháng mốc so vơi đối chứng, chủng D18, TH14, II cho thấy hoạt tính kháng mốc gia tăng - Thử nghiệm mơ hình in situ xồi, chủng vi khuẩn cho kết giảm mức độ biểu bệnh nấm mốc xoài lên đến ~ 90% Như vậy, với kết đạt được, chủng vi khuẩn Bacillus D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II N9 đối tượng tiềm cho việc kiểm soát sinh học nấm mốc C siamense, hạn chế bệnh thán thư nhiều loại trồng, đặc biệt ngành trồng trọt kinh doanh xồi Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Bệnh thán thư nấm mốc Colletotrichum làm giảm suất thu hoạch nhiều loại trồng Việc kiểm soát loại bệnh phương pháp sinh học giảm sử dụng hóa chất ngày quan tâm, chủng vi khuẩn Bacillus đối tượng tiềm Trong nghiên cứu này, 35 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus kiểm tra khả đối kháng với nấm mốc Colletotrichum siamense kết cho thấy 28/35 chủng vi khuẩn xác nhận có khả đối kháng với nấm mốc C siamense Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cho hoạt tính đối kháng cao D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II N9 tác động lên vách tế bào hệ sợi tơ nấm C siamense với biểu trương phình, đứt gãy, gấp khúc, phân hủy tế bào hệ sợi tơ nấm C siamense Đồng thời chủng vi khuẩn thể khả sinh tổng hợp enzyme phân hủy vách tế bào nấm chitinase Hoạt tính kháng nấm dịch ni cấy vi khuẩn thể khả bền nhiệt, bền pH bền với hoạt động protease K mức độ khác Thử nghiệm khả đối kháng mô hình xồi cho thấy dịch ni cấy vi khuẩn kiểm nghiệm làm giảm 90% mức độ biểu bệnh gây nấm mốc C siamense Từ khóa: Bệnh thán thư, Bacillus amyloliquefaciens, kháng mốc, Colletotrichum siamense, xồi 10 A B C Hình 3.5: Độ bền nhiệt dịch nuôi cấy vi khuẩn nhiệt độ 60°C, 70°C, 80°C, 90°C mốc thời gian phút (A), 10 phút (B), 15 phút (C) 32 Kết sơ ban đầu cho thấy đa số dịch ni cấy vi khuẩn cho hoạt tính đối kháng nấm suy giảm theo thời gian (giảm dần từ đến 15 phút) mốc nhiệt độ khác nhau, đó, mốc 90°C dịch ni cấy vi khuẩn trì hoạt tính đối kháng thấp đáng kể so với mẫu đối chứng Kết phân tích ANOVA phần mềm Statgraphics rằng, chủng vi khuẩn có thay đổi khác biệt mốc 90°C 15 phút so với mốc 60°C, 70°C, 80°C phút 10 phút Cụ thể mốc 90oC 15 phút, hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn D7, TH24, N9, TH14 giảm từ 100% xuống 27,78%, 37,33%, 31,75%, 26,67% tương ứng Trong chủng D19, D18, TH5, II cho độ giảm hoạt tính xuống 43,59%, 51,28%, 53,33%, 48,48% tương ứng Kết kiểm tra độ bền nhiệt mốc 80°C cho thấy rõ hoạt tính đối kháng số chủng cao sau phút 10 phút ủ nhiệt, điều cho thấy khả bền nhiệt chủng vi khuẩn mốc 80°C D19 sau 15 phút ủ hoạt tính cịn lại đến 76,92%, chủng lại cho độ giảm hoạt tính dao động từ 38-51% Các kết hình ảnh đối kháng bị suy giảm Ngồi ra, quan sát điều kiện xử lý 60oC 15 phút, hoạt tính đối kháng cịn lại có giá trị thấp so với xử lý nhiệt độ cao thời gian, điều đặt giả thuyết có nhiều hoạt chất đối kháng nấm có dịch nuôi cấy ảnh hưởng nhiệt độ lên hợp chất khác nhau, điều kiện 60°C 15 phút xử lý, số hoạt chất bị biến tính, làm giảm hoạt tính kháng nấm, điều kiện nhiệt độ cao hơn, số hoạt chất kích hoạt thể hoạt tính đối kháng mạnh mẽ Một số nghiên cứu cho thấy trong dịch nuôi cấy vi khuẩn có hợp chất bay thể hoạt tính đối kháng sinh học, vậy, nhiệt độ cao kích thích q trình hình thành giải phóng hợp chất bay hiệu hơn, dẫn đến việc gia tăng hoạt tính đối kháng Tuy nhiên, nhiệt độ tăng cao tốc độ bay nhanh hoạt tính đối kháng quan sát thấy giảm mạnh điều kiện xử lý nhiệt độ 90°C (Hình 3.5C) [45-47] Độ bền nhiệt dịch nuôi cấy số vi khuẩn lên khả đối kháng nấm mốc quan sát thấy nghiên cứu trước dịch nuôi cấy vi khuẩn B subtilis NN12 trì 60% hoạt tính sau xử lý nhiệt độ 70-80°C, khoảng 40% hoạt tính sau xử lý nhiệt độ 90°C nấm mốc Fusarium equiseti [17], hoạt tính đối kháng nấm mốc A niger dịch vi khuẩn B subtilis PY-1 trì sau xử lý 121°C 15 phút 33 [48], dịch nuôi cấy từ B subtilis B-FS06 ức chế A flavus sau xử lý nhiệt độ 100℃ 121℃ [49] 3.5 Độ bền pH dịch ni cấy vi khuẩn lên hoạt tính kháng mốc C siamense Độ bền pH dịch nuôi cấy vi khuẩn kiểm định lên hoạt tính kháng mốc kiểm tra sau ủ dịch vi khuẩn điều kiện pH khác 3,0 – 10,0 Hoạt tính kháng mốc cịn lại sau xử lý so với đối chứng trình bày bảng 3.4 hình 3.6 Bảng 3.4: Khả đối kháng dịch nuôi cấy vi khuẩn xử lí với mốc pH khác (%) Kết sơ thể hình 3.6 cho thấy hoạt tính đối kháng nấm mốc dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn bị ảnh hưởng điều kiện pH khác Hoạt tính kháng mốc chủng vi khuẩn thể độ bền khoảng pH 6,0 -8,0 (>80%), riêng chủng D18 TH24 cho thấy độ bền pH rộng 5,0 – 10,0 Các chủng D7, D18, D19, TH5 cho thấy hoạt tính kháng mốc bị ảnh hưởng điều kiện pH thấp (pH = 3,0) với hoạt tính cịn lại sau xử lý tương ứng 62,5%, 68,75%, 64,71%, 57,14%, chủng TH24, TH14, II, N9 cho thấy kết bền với pH acid với hoạt tính tương ứng 90,48%, 85,71%, 70,0%, 80,0% Bên cạnh đó, điều kiện pH cao (pH = 10,0), hoạt tính kháng C siamense chủng D7, TH5, II, N9 cho thấy giảm hoạt tính 58,82%, 58,33%, 56,25%, 61,54%, chủng D18, TH24, TH14, D19 thể kết 34 bền với điều kiện pH với hoạt tính kháng mốc cịn lại tương ứng 96,0%, 89,38%, 80,0%, 81,25% Các kết tương tự quan sát thấy nghiên cứu khả đối kháng C gossypii vi khuẩn B licheniformis strain OE4 với khả bền pH khoảng pH 5,0-9,0 [10] Ngoài ra, nghiên cứu Zhang cộng (2008) Gong cộng (2006), hoạt tính kháng mốc tương ứng B subtilis B-FS06 B subtilis PY-1 A flavus A niger trì khoảng 80% khơng đổi xử lý khoảng pH 5,0-12 [48, 49] Hình 3.6: Độ bền pH dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hoạt tính đối kháng C siamense 35 3.6 Ảnh hưởng proteinase K lên hoạt tính kháng mốc C siamense dịch nuôi cấy vi khuẩn Các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm thể khả sinh tổng hợp chitinase phân giải vách tế bào hệ sợi tơ nấm Tuy nhiên, để làm rõ chất thành phần tham gia vào hoạt tính kháng mốc chủng vi khuẩn này, dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn xử lý với proteinase K kiểm tra hoạt tính đối kháng cịn lại Kết thể bảng 3.5 hình 3.8 Bảng 3.5: Khả ức chế phát triển hệ sợi tơ nấm C siamense dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí với proteinase K (%) Chủng vk ĐC D7 D18 D19 TH5 TH14 TH24 II N9 Khả kháng mốc (%) 100,00 ± 0,00a 89,71 ± 2,01b 104,76 ± 3,71d 53,33 ± 6,72c 63,33 ± 11,37c 120,83 ± 2,81e 78,89 ± 6,99f 122,22 ± 7,42e 87,78 ± 5,75f Hình 3.8: Hoạt tính kháng nấm C siamense dịch ni cấy vi khuẩn sau xử lí với proteinase K Sau xử lý với proteinase K, dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn D7, D19, TH5, TH24, N9 thể hoạt tính đối kháng giảm so với mẫu đối chứng với hoạt tính ghi nhận 36 tương ứng 89,71%, 53,33%, 63,33%, 78,89%, 87,78% điều đưa giả thiết thành phần tham gia vào hoạt tính kháng mốc chủng vi khuẩn có chất protein bị tác động proteinase K, enzyme chitinase Trong đó, hoạt tính đối kháng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn D18, II, TH14 có phần tăng so với đối chứng, với hoạt tính ghi nhận tương ứng 104,76%, 122,22%, 120,83% Điều giải thích ngồi thành phần chitinase tham gia vào hoạt tính kháng mốc, thành phần có chất protein khác dịch ni cấy bị tác động proteinase K phân hủy thành peptide mạch ngắn bổ sung thêm vào hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy, gia tăng hoạt tính kháng C siamense so với đối chứng 3.7 Khả giảm mức độ biểu bệnh mơ hình xồi Bacillus spp Mơ hình xoài sử dụng để kiểm tra khả ức chế biểu bệnh thán thư C siamense chủng Bacillus kiểm định điều kiện in situ Biểu bệnh quan sát thông qua tượng thay đổi màu sắc, thối nhũn sau ngày xử lý kết thể bảng 3.6 hình 3.9, 3.10 Kết kiểm sốt sinh học tính đối kháng xồi cho thấy chủng tuyển chọn có khả kháng mốc cao giảm triệu chứng bệnh vòng ngày, chủng D7, D19, D18, II, N9, TH14 giảm khả gây bệnh ≥ 90%, chủng TH5 TH24 cho khả giảm bệnh khoảng ~ 90%, chủng TH24 giảm khả gây bệnh 87,36% Hiệu giảm mức độ biểu chủng vi khuẩn ghi nhận cao thử nghiệm tương tự nhóm tác giả Yu-Shen Liang với chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens PMB04 với khả giảm 85% [50] Bên cạnh đó, khả ức chế bệnh thán thư C acutatum mơ hình thực vật khác ớt vi khuẩn B tequilensis GYUN-300 nhóm tác giả Hyeok-Tae Kwon báo cáo với hiệu tương tự xử lý hóa chất đạt 60% hiệu bảo vệ hiệu điều trị bệnh [51] Với kết thu nhận được, chủng vi khuẩn Bacillus nghiên cứu thể khả giảm biểu bệnh thán thư C siamense tốt điều kiện in situ mơ hình xồi ứng cử viên cho ứng dụng kiểm soát sinh học để bảo vệ ngành trồng trọt kinh doanh xoài 37 Bảng 3.6: Khả giảm mức độ biểu bệnh C siamense chủng vi khuẩn (%) Chủng D7 D19 D18 TH5 TH14 TH24 II N9 Giảm biểu hiệu bệnh (%) 90,97 ± 1,21 90,44 ± 1,27 90,06 ± 0,38 89,26 ± 0,3 90,78 ± 0,34 87,36 ± 1,09 92,06 ± 0,85 92,12 ± 1,16 Hình 3.9 Hoạt tính đối kháng C siamense chủng vi khuẩn xồi Đc (-) dịch LB mơi trường nuôi cấy; Đc (+) dịch huyền phù sợi nấm C siamense mẫu C-*** dịch phối trộn dịch huyền phù nấm gây bệnh dịch vi khuẩn đối kháng Hình 3.10 Mức độ giảm biểu bệnh xoài chủng vi khuẩn 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực nghiên cứu, kết thu sau: - Từ 35 chủng vi khuẩn Bacillus, chúng tơi sàng lọc 28/35 chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng C siamense, chủng vi khuẩn D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II N9 có hoạt tính đối kháng Colletotrichum siamense tốt - Hầu hết chủng cho khả phân giải chitin cao làm ảnh hưởng đến cấu trúc vách tế bào nấm chitin thành phần có tơ nấm mốc, khả phân giải chitin cao chủng TH14 (1,83cm); TH5 (1,77cm); khả phân giải chitin yếu chủng N9 (1,27cm) - Hầu hết hợp chất kháng mốc dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn bền khoảng pH rộng (pH 3,0-10,0) (hoạt tính cịn lại 60%) bền nhiệt lên đến 80°C 15 phút (hoạt tính cịn lại 40%) - Khi kiểm tra tác động proteinase K đến hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn cho thấy chủng D7, D19, TH5, TH24, N9 bị ảnh hưởng giảm hoạt tính kháng mốc so vơi đối chứng, chủng D18, TH14, II cho thấy hoạt tính kháng mốc gia tăng - Thử nghiệm mơ hình in vitro xồi, chủng vi khuẩn cho kết giảm mức độ biểu bệnh nấm mốc xoài lên đến ~ 90% Như vậy, với kết đạt được, chủng vi khuẩn Bacillus D7, D18, D19, TH5, TH14, TH24, II N9 đối tượng tiềm cho việc kiểm soát sinh học nấm mốc C siamense, hạn chế bệnh thán thư nhiều loại trồng, đặc biệt ngành trồng trọt kinh doanh xoài 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học có vai trị kháng mốc C siamense dịch nuôi cấy loại vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao - Thử nghiệm quy mơ pilot vi sinh có hoạt tính tốt giúp ngăn ngừa bệnh thán thư ngành trồng trọt kinh doanh xoài 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Mertely JC, Forcelini BB, Peres NA: Anthracnose Fruit Rot of Strawberry Plant Pathology Department PP-207 2018, 1-5 Diao YZ, Zhang C, Liu F, Wang WZ, Liu L, Cai L, Liu XL: Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China Persoonia 2017, 38:20-37 Hưng ND, Cường HV, Lằm HC, Huy NĐ: Xác định nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sơng Hồng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - số 12(85)/2017 2017 Thủy LHL, Kim PV: Phân loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư xồi sầu riêng đồng sơng Cửu Long thử hiệu lực sáu loại thuốc lồi nấm Tạp chí Khoa học 2008, 10: 31-40 Nguyen TH, Hoang TN, Thi THN, Pham XH: Study on pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides on coffee in north of VietNam Tạp chí SINH HỌC 2011, 33(1): 67-73 Woodward JE, Brenneman TB, Kemerait Jr RC: Chemical control of peanut diseases: targeting leaves, stems, roots, and pods with foliar-applied fungicides Fungicides–showcases of integrated plant disease management from around the world Rijeck, Crotatia: InTech 2013:55-76 Ma Z, Luo Y, Michailides TJ: Resistance of Botryosphaeria dothidea from pistachio to iprodione Plant disease 2001, 85(2):183-188 Konsue W, Dethoup T, Limtong S: Biological Control of Fruit Rot and Anthracnose of Postharvest Mango by Antagonistic Yeasts from Economic Crops Leaves Microorganisms 2020, 8(3): 317 Choub V, Ajuna HB, Won S-J, Moon J-H, Choi S-I, Maung CEH, Kim C-W, Ahn YS: Antifungal activity of Bacillus velezensis CE 100 against anthracnose disease (Colletotrichum gloeosporioides) and growth promotion of walnut (Juglans regia L.) trees International journal of molecular sciences 2021, 22(19):10438 Nawaz HH, Rajaofera MN, He Q, Anam U, Lin C, Miao W: Evaluation of antifungal metabolites activity from Bacillus licheniformis OE-04 against Colletotrichum gossypii Pesticide biochemistry and physiology 2018, 146:33-42 Li X, Zhang M, Qi D, Zhou D, Qi C, Li C, Liu S, Xiang D, Zhang L, Xie J: Biocontrol ability and mechanism of a broad-spectrum antifungal strain Bacillus safensis sp QN1NO-4 against strawberry anthracnose caused by Colletotrichum fragariae Frontiers in microbiology 2021, 12 He C-N, Ye W-Q, Zhu Y-Y, Zhou W-W: Antifungal activity of volatile organic compounds produced by Bacillus methylotrophicus and Bacillus thuringiensis against five common spoilage fungi on loquats Molecules 2020, 25(15):3360 Kim H-M, Lee K-J, Chae J-C: Postharvest biological control of Colletotrichum acutatum on apple by Bacillus subtilis HM1 and the structural identification of antagonists Journal of Microbiology and Biotechnology 2015, 25(11):1954-1959 Lim KB, Balolong MP, Kim SH, Oh JK, Lee JY, Kang DK: Isolation and Characterization of a Broad Spectrum Bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens RX7 Biomed Res Int 2016, 2016:8521476 Han J-H, Shim H, Shin J-H, Kim KS: Antagonistic activities of Bacillus spp strains isolated from tidal flat sediment towards anthracnose pathogens Colletotrichum acutatum and C gloeosporioides in South Korea The plant pathology journal 2015, 31(2):165 40 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 An NN, Thao HHM, Yen HNH, Hanh NTD, HOA NLH, TIEN TTT, LUYEN BT, VIET PT: Isolation, identification and characterization of bacterial antagonists of the dragon fruit fungal pathogen Neoscytalidium dimidiatum Journal of Science and Technology-IUH 2020, 44(02) Pham TV, Dinh NT-N, Le LT-N, Nguyen HT-K, Le HT-V, Nguyen HT-D, Nguyen N-A: Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả ức chế Fusarium oxysporum Fusarium equiseti Bacillus subtilis NN12 Journal of Science and Technology-IUH In Press Lim KB, Balolong MP, Kim SH, Oh JK, Lee JY, Kang D-K: Isolation and characterization of a broad spectrum bacteriocin from Bacillus amyloliquefaciens RX7 BioMed research international 2016, 2016 Bankhead P, Loughrey MB, Fernández JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, McQuaid S, Gray RT, Murray LJ, Coleman HG et al: QuPath: Open source software for digital pathology image analysis Scientific Reports 2017, 7(1):16878 Mizrahi Y: THIRTY-ONE YEARS OF RESEARCH AND DEVELOPMENT IN THE VINE CACTI PITAYA IN ISRAEL In: Improving Pitaya Production and Marketing: 2015; Kaoshiung, Taiwan Fredriksson NJ, Hermansson M, Wilén B-M: The choice of PCR primers has great impact on assessments of bacterial community diversity and dynamics in a wastewater treatment plant PloS one 2013, 8(10):e76431 Sharma G, Maymon M, Freeman S: Epidemiology, pathology and identification of Colletotrichum including a novel species associated with avocado (Persea americana) anthracnose in Israel Scientific Reports 2017, 7(1):15839 Perfect SE, Hughes HB, O'Connell RJ, Green JR: Colletotrichum: a model genus for studies on pathology and fungal–plant interactions Fungal genetics and Biology 1999, 27(2-3):186-198 Moraes SRG, Tanaka FAO, Massola Júnior NS: Histopathology of Colletotrichum gloeosporioides on guava fruits (Psidium guajava L.) Revista Brasileira de Fruticultura 2013, 35:657-664 EFSA E: The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016 EFSA J 2018, 16(2):e05182 Rattanakreetakul C, Keawmanee P, Bincader S, Mongkolporn O, Phuntumart V, Chiba S, Pongpisutta R: Two Newly Identified Colletotrichum Species Associated with Mango Anthracnose in Central Thailand Plants 2023, 12(5):1130 Arauz LF: Mango anthracnose: Economic impact and current options for integrated managaement Plant disease 2000, 84(6):600-611 Ajay Kumar G: Colletotrichum gloeosporioides: biology, pathogenicity and management in India J Plant Physiol Pathol 2014, 2(2):2-11 Uddin M, Shefat S, Afroz M, Moon N: Management of anthracnose disease of mango caused by Colletotrichum gloeosporioides: A review Acta Scientific Agriculture 2018, 2(10):169-177 Nelson SC: Mango anthracnose (Colletotrichum gloeosporiodes) 2008 Beladjal L, Gheysens T, Clegg JS, Amar M, Mertens J: Life from the ashes: survival of dry bacterial spores after very high temperature exposure Extremophiles 2018, 22:751-759 Baron S: Medical microbiology 1996 41 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Kadaikunnan S, Rejiniemon TS, Khaled JM, Alharbi NS, Mothana R: In-vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens Annals of clinical microbiology and antimicrobials 2015, 14(1):111 Ul Hassan Z, Al Thani R, Alnaimi H, Migheli Q, Jaoua S: Investigation and application of Bacillus licheniformis volatile compounds for the biological control of toxigenic Aspergillus and Penicillium spp ACS omega 2019, 4(17):17186-17193 Dessalegn Y, Ayalew A, Woldetsadik K: Integrating plant defense inducing chemical, inorganic salt and hot water treatments for the management of postharvest mango anthracnose Postharvest biology and technology 2013, 85:83-88 Sarwar M: Practices for integrated control of mango (Mangifera indica L.) diseases to protect in preharvest as well as postharvest phases Biosci Bioeng 2015, 1(3):5762 Q NH: Đánh giá khả phịng trị xạ khuẩn bệnh thán thư xồi nấm Colletotrichum sp gây Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2016 (CĐ Nông nghiệp 2016):120-127 Dũng PĐ, Nghĩa ĐH, Hiệt HĐ, Thắng NT, Lệ BV: Nghiên cứu khả kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư ớt (Capsicum frutescens L.) chế phẩm oligochitosan-nano silica (SiO2) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2017(48):66-70 Quyết TĐĐ: Nghiên Cứu Sản Xuất Các Chế Phẩm Sinh Học Phòng Trừ Nấm Gây Bệnh Thối Xám (Botrytis cinerea) Và Bệnh Thán Thư (Colletotrichum gloeosporioides) Trên Một Số Loại Hoa, Rau, Quả Konsue W, Dethoup T, Limtong S: Biological control of fruit rot and anthracnose of postharvest mango by antagonistic yeasts from economic crops leaves Microorganisms 2020, 8(3):317 Verma K, Garg N: Detection of Chitinase on Chitin Agar Plates In: 2019 Liên NT, Như NTY, Mai TTX, Pha NT: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn từ đất vùng rễ ớt có khả đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư ớt Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2016, 47 (2016): 16-23 Rosa MM, Tauk-Tornisielo SM, Rampazzo PE, Ceccato-Antonini SR: Evaluation of the biological control by the yeast Torulaspora globosa against Colletotrichum sublineolum in sorghum World Journal of Microbiology and Biotechnology 2010, 26(8):1491-1502 Prapagdee B, Kuekulvong C, Mongkolsuk S: Antifungal potential of extracellular metabolites produced by Streptomyces hygroscopicus against phytopathogenic fungi International journal of biological sciences 2008, 4(5):330-337 Zhao P, Li P, Wu S, Zhou M, Zhi R, Gao H: Volatile organic compounds (VOCs) from Bacillus subtilis CF-3 reduce anthracnose and elicit active defense responses in harvested litchi fruits AMB Express 2019, 9:1-13 Zhang D, Yu S, Yang Y, Zhang J, Zhao D, Pan Y, Fan S, Yang Z, Zhu J: Antifungal effects of volatiles produced by Bacillus subtilis against Alternaria solani in potato Frontiers in Microbiology 2020, 11:1196 Gao H, Li P, Xu X, Zeng Q, Guan W: Research on volatile organic compounds from Bacillus subtilis CF-3: biocontrol effects on fruit fungal pathogens and dynamic changes during fermentation Frontiers in microbiology 2018, 9:456 Gong M, Wang JD, Zhang J, Yang H, Lu XF, Pei Y, Cheng JQ: Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in vitro and identification of its 42 49 50 51 antifungal substance (iturin A) Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2006, 38(4):233-240 Ting Zhang Z-QS, Liang-Bin Hu, Luo-Gen Cheng & Fei Wang Antifungal compounds from Bacillus subtilis B-FS06 inhibiting the growth of Aspergillus flavus World Journal of Microbiology and Biotechnology 2008, 24(6):783–788 Liang Y-S, Fu J-Y, Chao S-H, Tzean Y, Hsiao C-Y, Yang Y-Y, Chen Y-K, Lin Y-H: Postharvest Application of Bacillus amyloliquefaciens PMB04 Fermentation Broth Reduces Anthracnose Occurrence in Mango Fruit Agriculture 2022, 12(10):1646 Kwon H-T, Lee Y, Kim J, Balaraju K, Kim HT, Jeon Y: Identification and characterization of Bacillus tequilensis GYUN-300: an antagonistic bacterium against red pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum in Korea Frontiers in Microbiology 2022:614 43 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM (tất văn có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lý hợp đồng với phịng kế tốn Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) 44 Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình .) Sản phẩm 1: Các chủng vi khuẩn định danh 45 Sản phẩm 2: Bài báo khoa học: 46