Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao 4

25 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3 1 Định danh Bacillus Khảo sát sơ bộ chế phẩm sinh học được cung cấp cho thấy có thể có sự tạp nhiễm các chủng vi khuẩn khác nhau trong mẫu nên chúng tôi quyết định phân lập lại mẫu chế phẩm sinh học trên môi trường LB agar, sau đó tiến hành nhuộm Gram, nhuộm bào tử và test hóa sinh nhằm mục đích có được các chủng vi khuẩn thuần khiết và xác định được chúng thuộc chi Bacillus Ngoài ra, các chủng Bacillus thuần khiết sau đó cũng được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thu.

3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định danh Bacillus Khảo sát sơ chế phẩm sinh học cung cấp cho thấy có tạp nhiễm chủng vi khuẩn khác mẫu nên định phân lập lại mẫu chế phẩm sinh học mơi trường LB agar, sau tiến hành nhuộm Gram, nhuộm bào tử test hóa sinh nhằm mục đích có chủng vi khuẩn khiết xác định chúng thuộc chi Bacillus Ngoài ra, chủng Bacillus khiết sau định danh đến mức độ loài kỹ thuật sinh học phân tử 3.1.1 Đặc điểm Hình thái đại thể, vi thể Từ mẫu chế phẩm sinh học, phân lập chủng vi khuẩn khác đặt tên NN KN Khuẩn lạc chủng NN có màu trắng đục, trịn, bờ khơng sau 24 nuôi cấy môi trường LB agar nhiệt độ phòng, xuất màng nhăn từ sau 48 ni cấy (Hình 3.1 A) Khuẩn lạc chủng KN sau 12 ni ủ có màu trắng, trong, trịn, nhầy, sau 48 có xuất khuẩn lạc vệ tinh màu trắng trong, khuẩn lạc trung tâm xuất màng nhăn, mép hình cưa (Hình 3.1 B) Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng NN (A) chủng KN (B) Đặc điểm vi thể chủng vi khuẩn tiếp tục xác định phương pháp nhuộm Gram nhuộm bào tử Các tiêu nhuộm thực sau 48 ni cấy quan sát vật kính X100 Kết nhuộm Gram (Hình 3.2) cho thấy tế bào hai chủng vi khuẩn có hình que, có hai đầu tròn tồn dạng riêng lẻ chuỗi ngắn thuộc nhóm Gram dương bắt màu tím Kết nhuộm bào tử (Hình 3.3) cho thấy hai chủng vi khuẩn có khả tạo bào tử (bắt màu lục) tế bào sinh dưỡng bắt màu hồng 25 Hình 3.2 Kết nhuộm Gram chủng vi khuẩn NN (A) KN (B) Hình 3.3 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn NN (A) KN (B) Từ đặc điểm vi thể, đại thể trên, kết luận chủng vi khuẩn phân lập vi khuẩn Gram dương có khả sinh bào tử thuộc chi Bacillus 3.1.2 Đặc điểm sinh hố Ngồi đặc điểm đại thể vi thể, chủng Bacillus phân lập được kiểm tra thêm đặc điểm sinh hóa theo khóa phân loại Bergey [34] Kết thể Hình 3.4 3.5 cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh amylase, cho phản ứng VP dương tính, khơng có khả sinh indole, có khả di động, sinh catalase Đây cá đặc điểm điển hình chi Bacillus 26 Hình 3.4 Kết test sinh hóa chủng Bacillus NN (A) KN (B) 3.1.3 Định danh công cụ sinh học phân tử Để định danh chủng Bacillus mức độ lồi, phương pháp giải trình tự 16S-rRNA sử dụng Kết giải trình tự kiểm tra phần mềm Seaview so sánh với trình tự gen ngân hàng liệu NCBI thông qua công cụ BLASTn Kết cho thấy chủng Bacillus NN có mức độ tương đồng 99.04% với chủng Bacillus subtilis, chủng nghiên cứu đặt tên Bacillus subtilis NN (Hình 3.6A) Chủng vi khuẩn KN có tương đồng 100% với chủng thuộc lồi Bacillus licheniformis, chủng nghiên cứu đặt tên Bacillus licheniformis KN (Hình 3.6B) Tóm lại hai loài vi khuẩn B subtilis B licheniformis thuộc nhóm Bacillus subtilis [35] [36] Hình 3.5 Kết định danh chủng Bacillus NN (A) KN (B) 27 Để xác định mối quan hệ di truyền chủng nghiên cứu lồi Bacillus có họ hàng gần, phát sinh loài vẽ phần mềm Mega theo phương pháp Neighbor-joining Kết thể Hình 3.6 Hình 3.6 Cây phát sinh lồi theo phương pháp N-J dựa trình tự 16S-rRNA 3.2 Khả kháng khuẩn kháng mốc Chủng B subtilis NN B licheniformis KN nuôi cấy môi trường LB dịch nuôi cấy sau ly tâm sử dụng để xác định khả kháng khuẩn kháng mốc phương pháp khuếch tán giếng thạch Sáu chủng vi khuẩn chủng nấm mốc sử dụng thử nghiệm đối kháng gồm: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Salmonella enteritica subsp Enteritica, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, Aspergillus sp., Aspergillus fumigatus, Penicillium chermesinum, Neoscytalidinum dimidiatum 3.2.1 Khả kháng khuẩn kháng mốc Bacillus subtilis NN Kết Hình 3.7 cho thấy dịch ni cấy B subtilis NN có khả ức chế vi khuẩn Gram dương Gram âm Bacillus cereus Salmonella enteritica subsp enteritica, ba loại nấm mốc Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, Penicillium chermesinum Khi so sánh khả đối kháng VSV Bacillus subtilis, năm 2011 Syed Iqbal Alam cộng xác định chủng Bacillus subtilis BS15 có khả đối kháng với Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi Năm 2013 Clarisse S Compaoré 28 cộng phân lập chủng B subtilis H4 có khả ức chế Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus Bacillus cereus Năm 2002 Wang San-Lang cộng phân lập từ đất hai chủng Bacillus subtilis có chứa hợp chất kháng mốc Fusarium oxysporum, vào năm 2007 Ting Zhang cộng xác định chủng Bacillus subtilis B-FS06 có khả kháng Aspegillus flavus Hình 3.7 Khả kháng khuẩn kháng mốc dịch nuôi cấy B subtilis NN Sau khảo sát khả kháng vi sinh vật dịch từ B subtilis NN, đối tượng chọn làm vi sinh vật đối kháng cho thí nghiệm B cereus 3.2.2 Khả kháng khuẩn kháng mốc Bacillus licheniformis KN Kết Hình 3.8 cho thấy dịch nuôi cấy B licheniformis KN ức chế với vi khuẩn Gram dương B cereus không ức chế S aureus Bên cạnh đó, vi khuẩn Gram âm E coli, S typhi P aeruginosa không bị ức chế dịch nuôi cấy S enteritica subsp enteritica bị ức chế Ngồi dịch hoạt động ức chế loại nấm khác Fusarium sp (gây bệnh héo rũ cà chua), Fusarium equiseti (gây bệnh héo là) Penicillium chermesinum (gây hư hỏng thực phẩm) Các hợp chất kháng vi sinh vật từ B licheniformis KN có phổ ức chế hẹp so với chủng, loài Bacillus khác Kết tương đồng với nghiên cứu Luca Martirani cộng (2002) chủng B licheniformis với khả ức chế B cereus lại không ức chế phát triển S aureus [37] Đối với khả kháng nấm mốc, chủng nghiên cứu có khác biệt với chủng B licheniformis MKU3 nghiên cứu N Kayalvizhi cộng (2008) Dịch ni cấy vơ bào chủng có khả ức chế Aspergillus fumigatus lại khơng có khả ức chế Penicillium sp [38] 29 Hình 3.8 Khả kháng khuẩn kháng mốc B licheniformis KN Sau khảo sát khả kháng vi sinh vật hợp chất từ B licheniformis KN, đối tượng chọn làm vi sinh vật đối kháng cho thí nghiệm B cereus 3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng Để xác định tuổi giống thích hợp cho thí nghiệm sau, đường cong tăng trưởng B subtilis NN B licheniformis KN mơi trường LB nhiệt độ phịng xây dựng phương pháp đo mật độ quang bước sóng 600 nm 24 vẽ phần mềm Graphpad Prism (San Diego, USA) 30 3.3.1 Đường cong tăng trưởng Bacillus subtilis NN Dựa vào Hình 3.9 thấy sau khoảng 16 ni cấy, B subtilis NN tiến vào pha cân bằng, thời điểm 16 lựa chọn làm tuổi giống cho thí nghiệm nghiên cứu Hình 3.9 Đường cong tăng trưởng Bacillus subtilis NN 3.3.2 Đường cong tăng trưởng Bacillus licheniformis KN Dựa vào Hình 3.10, từ thời điểm 16 ni cấy, B licheniformis KN bước vào pha cân Chính thế, thời điểm 12-15 chọn thời gian tăng sinh B licheniformis KN cho khảo sát Hình 3.10 Đường cong tăng trưởng B licheniformis KN 31 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy lên khả sinh bacteriocin Để sinh trưởng phát triển vi sinh vật cần có nhu cầu môi trường sống khác Nhiệt độ, thời gian hai yếu tố ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng phát triển chúng nghiên cứu khả sinh bacteriocin thô B subtilis NN B licheniformis KN mức nhiệt độ khác nhau: 25°C, 28°C, 33°C, 37°C, 45°C khảo sát thời gian 24 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus subtilis NN 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 25°C 28°C 12 18 Thời gian (h) 33°C 37°C 24 45°C Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả kháng B cereus B subtilis NN Kết cho thấy đến thời điểm nuôi cấy 25°C 28°C dịch thu bắt đầu có hoạt tính kháng khuẩn sau tăng dần cao thời điểm 18 nuôi cấy điều kiện 28°C Trong nhiệt độ 33°C, 37°C dịch bắt đầu có hoạt tính từ ni cấy sau tiếp tục tăng dần đạt giá trị cao thời điểm 18 nuôi cấy Sau 18 giờ, tất mốc nhiệt độ từ 28°C-45°C, hoạt tính kháng khuẩn dịch nuôi cấy giảm nhẹ không đổi Ở 25°C sau 24 ni cấy, hoạt tính kháng khuẩn tăng nhiên nhìn chung thấp nhiều so với mốc nhiệt độ khác Từ nhận thấy 18 ni cấy 33°C-37°C điều kiện thích hợp khả sinh bacteriocin Bacillus subtilis NN Kết thống kê phương pháp ANOVA (mức độ tin cậy 95%) cho thấy hoạt tính ức chế B cereus cao dịch nuôi cấy B subtilis NN nhiệt độ từ 33°C-37°C 18 32 Kết có khác biệt so với nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả kháng khuẩn từ Bacillus subtilis Đỗ Thị Hiền (2018) Bacillus subtilis KIBGE IB-17 Asma Ansari (2012) với thời gian nhiệt độ ni cấy thích hợp 24 37°C, từ thấy ưu chủng Bacillus subtilis NN so với chủng thời gian nuôi cấy ngắn sau 18 [9] [29] Đường kính vịng ức chế (mm) 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus licheniformis KN 7.0 6.0 5.0 25°C 4.0 28°C 3.0 33°C 2.0 37°C 1.0 45°C 0.0 12 15 Thời gian (giờ) 18 21 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả kháng B cereus B licheniformis KN Kết cho thấy nhiệt độ thời gian có ảnh hưởng lớn đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn B licheniformis KN môi trường LB Dịch nuôi cấy điều kiện nhiệt độ khác thể tính đối kháng với B cereus thời điểm khác với mức độ khác Dịch nuôi cấy thời điểm nhiệt độ 37C có ức chế vi khuẩn đối kháng, tăng dần đến 15 giảm dần sau Khả ức chế B cereus có tương đương dịch nuôi cấy 45C khả ức chế xuất thời điểm sau nuôi cấy Nhiệt độ 25C 28C, ức chế vi khuẩn đối kháng bắt đầu có hoạt tính cao 15 sau ni cấy giảm xuống khơng đáng kể sau Ở nhiệt độ 33C, khả ức chế B cereus tăng dần qua thời điểm nuôi cấy cao 18 giảm dần từ thời điểm 21 Tại 15 giờ, ức chế B cereus cao 37C 45C gấp 1.5 lần so với 33C gấp lần so với 25C 28C 33 Theo kết thống kê với mức tin cậy 95%, nhiệt độ 37C 45C 15 có khả kháng B cereus dịch ni cấy B licheniformis KN cao Do đó, nhiệt độ 37C chọn nhiệt độ nuôi cấy B licheniformis KN sinh tổng hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính ức chế B cereus thời điểm 15 Trong nghiên cứu Cladera-Olivera cộng (2004) khảo sát cho thấy nhiệt độ 30C 24 BLS từ B licheniformis P40 có hoạt tính kháng tốt [39] Một nghiên cứu khác T Anthony cộng (2009) chủng B licheniformis AnBa9 tạo hợp chất kháng cao nuôi nhiệt độ 43°C 24 [40] 3.5 Ảnh hưởng giá trị pH môi trường ban đầu lên khả sinh bacteriocin Cùng với nhiệt độ thời gian nuôi cấy, pH môi trường ban đầu yếu tố tác động đến khả phát triển sinh tổng hợp hợp chất kháng vi sinh vật vi khuẩn Trong nghiên cứu này, giá trị pH môi trường ban đầu điều chỉnh khác (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) nhằm tìm giá trị pH phù hợp cho trình sinh bacteriocin từ B subtilis NN B licheniformis KN Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) 3.5.1 Ảnh hưởng giá trị pH môi trường ban đầu lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus subtilis NN 10.0 8.0 9.0 7.0 6.7 6.8 5.5 6.0 4.0 2.0 0.0 0.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Giá trị pH mơi trường ban đầu Hình 3.13 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy từ B subtilis NN Kết cho thấy hoạt tính kháng khuẩn dịch nuôi cấy từ B subtilis NN giữ ổn định pH môi trường từ 4.0-5.0 tăng tối đa pH 6.0, sau hoạt tính giảm dần hồn tồn hoạt tính kháng khuẩn pH 9.0 So sánh với nghiên cứu Đỗ Thị Hiền (2018) Asma Ansari (2012) giá trị pH lựa chọn 7.0 nhiên pH môi trường 6.0 giá trị pH 34 môi trường phổ biến cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn nói chung, từ thấy chủng B subtilis có số đặc tính khác khác biệt không đáng kể [9][29] Đường kính vịng ức chế (mm) 3.5.2 Ảnh hưởng giá trị pH môi trường ban đầu lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus licheniformis KN 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 3.3 2.8 3.0 3.0 3.3 3.3 pH môi trường ban đầu Hình 3.14 Ảnh hưởng pH mơi trường ban đầu đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy B licheniformis KN Qua hình 3.14, thấy giá trị pH môi trường ban đầu không ảnh hưởng đáng kể đến khả sinh hợp chất có hoạt tính kháng B cereus B licheniformis Khi xử lý phân tích số liệu hàm ANOVA yếu tố kết cho thấy khơng có khác biệt thống kê giá trị pH mức tin cậy 95% Chính vậy, pH 7.0 chọn làm giá trị pH ban đầu môi trường cho thí nghiệm giá trị pH phổ biến cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Kết nghiên cứu có tương đồng với kết Jung Sung-Sub cộng (2009) chọn pH 7.0 điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất hợp chất kháng khuẩn từ B licheniformis [41] Ngoài ra, giá trị pH tối ưu cho việc sản xuất hợp chất kháng khuẩn chủng B licheniformis nghiên cứu khác báo cáo khoảng pH 6.5 đến pH 7.0 [27][37] [39] 35 3.6 Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả sinh bacteriocin Hầu hết vi khuẩn cần nguồn sinh dưỡng phức tạp để sinh trưởng tổng hợp nitrogen nguyên tố quan trọng trình sống sinh tổng hợp chất vi khuẩn Trong nghiên cứu hai nguồn nitrogen vô hữu khảo sát gồm: NH4Cl, NH4NO3, NaNO3, urea, peptone, yeast extract để chọn nguồn nitrogen thích hợp cho trình sản sinh bacteriocin B subtilis NN B licheniformis KN với nguồn carbon glucose 3.6.1 Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus subtilis NN Hình 3.15 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy từ B subtilis NN Kết cho thấy B subtilis NN có khả sử dụng nguồn nitrogen vô lẫn hữu sản sinh hợp chất kháng khuẩn Khi bổ sung nguồn nitrogen có gốc NO 3¯ nhận thấy hoạt tính kháng khuẩn dịch nuôi cấy không cao Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy yeast extract peptone hoạt tính kháng khuẩn đạt giá trị cao khơng có khác biệt mang ý nghĩa thống kê (ANOVA với mức độ tin cậy 95%) Từ kết kết luận yeast extract peptone nguồn nitrogen thích hợp cho q trình sản sinh hợp chất kháng khuẩn B subtilis NN Kết phù hợp với nghiên cứu Đỗ Thị Hiền (2018) Asma Ansari (2012) thí nghiệm lựa chọn nguồn nitrogen cho khả sinh bacteriocin Bacillus subtilis yeast extract [9][29] 36 3.6.2 Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả sinh bacteriocin từ Bacillus licheniformis KN Hình 3.16 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy B licheniformis KN Kết theo thống kê ANOVA với mức độ tin cậy 95%, nguồn nitrogen khảo sát, nguồn hữu thích hợp cho sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn so với nguồn vơ Hoạt tính kháng khuẩn thấp nguồn NH4Cl, nguồn peptone NH4NO3, sau NaNO3 YE Khi nguồn nitrogen urea B licheniformis KN sản xuất hợp chất kháng khuẩn có hốt tính kháng B cereus cao Khi so sánh cặp urea cho kết khác biệt hồn tồn so với biến cịn lại khác biệt có ý nghĩa thơng kê Chính thế, urea chọn làm nguồn nitrogen cố định để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon đến khả kháng dịch nuôi cấy vô bào B cereus Trong nghiên cứu Thangamani Anthony cộng (2009) khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả sản xuất peptide kháng khuẩn (ABP) B licheniformis AnBa9, môi trường lên men tối ưu hố có bổ sung 45.0 g/l YE (tăng 40 g/l so với môi trường ban đầu) 4.5 g/l NH4NO3 (giảm 0.5 g/l so với mơi trường ban đầu) cho hoạt tính ABP mạnh [40] Trong nghiên cứu khác, nguồn peptone YE bổ sung vào môi tường gồm MgSO4, KNO3, K2HPO4 để sản xuất hợp chất kháng khuẩn có khối lượng phân tử nhỏ từ B licheniformis MKU3 [38] 37 3.7 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh bacteriocin Các vi khuẩn có khả chịu nồng độ NaCl khác nhau, để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sản sinh bacteriocin tiến hành bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ NaCl gồm: 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% từ chọn nồng độ muối thích hợp Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) 3.7.1 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh bacteriocin từ Bacillus subtilis NN 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 8.7 8.3 8.7 8.0 7.3 0.5 1.0 1.5 Nồng độ NaCl (%) 2.0 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy B subtilis NN Kết cho thấy, bổ sung 0.5% NaCl vào mơi trường hoạt tính kháng khuẩn dịch giảm xuống (so với mẫu không bổ sung), sau hoạt tính tăng nồng độ NaCl tăng đạt cao 1.0%-1.5% bắt đầu giảm bổ sung 2% NaCl Tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn mẫu 0% mẫu 1.0% khơng có khác biệt đáng kể Với kết trên, định không bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy cho sinh tổng hợp bacteriocin B subtilis NN So sánh với kết Vera Pingitore năm 2009, bổ sung NaCl 0.5%-1.0% vào môi trường nuôi cấy Lactobacillus salivarius CRL 1328 thu dịch có hoạt tính cao cao gấp lần so với mơi trường khơng có bổ sung [13] 38 3.7.2 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh bacteriocin từ Bacillus licheniformis KN Đường kính vịng ức chế (mm) 10.0 8.0 7.3 6.0 6.0 5.0 4.7 4.0 2.0 0.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ NaCl (%) Hình 3.18 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả kháng B cereus dịch nuôi cấy từ B licheniformis KN Trong nồng độ NaCl khảo sát hoạt tính kháng khuẩn xuất hầu hết nồng độ Khi tiến hành phân tích ANOVA nồng độ 1.0% 1.5% cho hoạt tính cao nhất, hai nồng độ 0.5% 2.0% Chủng B licheniformis KN nuôi môi trường không bổ sung NaCl phát triển tốt bị hoàn toàn khả kháng B cereus Với kết trên, 1.0% NaCl nồng độ muối chọn để nuôi cấy B licheniformis KN Trong nghiên cứu Thangamani Anthony cộng (2009) khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sản xuất peptide kháng khuẩn (ABP) B licheniformis AnBa9, mơi trường lên men tối ưu hố có bổ sung 4.5 g/l NaCl (giảm 0.5 g/l so với môi trường ban đầu, không vượt 1.0%) cho hoạt tính ABP mạnh 3.8 Khảo sát nhiệt độ bảo quản thích hợp cho dung dịch bacteriocin thơ Nhiệt độ thời gian bảo quản hai yếu tố quan trọng để đánh giá mức độ ứng dụng bacteriocin thô từ Bacillus Dung dịch bacteriocin thô từ chủng B subtilis NN B licheniformis KN thu nuôi cấy điều kiện thích hợp xác định thí nghiệm trước ủ nhiệt độ khác nhau: -60C, -20C, 4°C 33C (nhiệt độ phòng) Các dịch bacteriocin thơ kiểm tra hoạt tính phương pháp khuếch tán giếng thạch sau 10 ngày, 30 ngày 39 3.8.1 Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho dung dịch bacteriocin thơ từ Bacillus subtilis NN Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 10 20 30 Thời gian (ngày) -60°C -20°C -4°C 33°C Hình 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ B subtilis NN Dựa vào kết thấy bảo quản dịch bacteriocin nhiệt độ phịng, hoạt tính kháng khuẩn dịch bacteriocin thô giảm mạnh theo thời gian, giảm 60% sau 10 ngày hoàn toàn hoạt tính sau 30 ngày Trong nhiệt độ lạnh (4°C, -20°C, -60°C) hoạt tính dịch gần ổn định giảm nhẹ suốt 30 ngày Khi bảo quản -20 -60°C hoạt tính giữ tương đương (độ tin cậy 95%) cao bảo quản nhiệt độ 4°C So sánh với kết nghiên cứu Nurul Lyana Md Sidek năm 2018 sau thu nhận bacteriocin từ Pediococcus acidilactici kp10 ủ nhiệt độ 4C sau 24 hoạt tính giữ nguyên, nhiên ủ -20C sau 24 hoạt tính bị giảm nửa [14] Từ thấy bateriocin thơ từ B subtilis NN có hoạt tính ổn định 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh sâu 40 3.8.2 Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho dung dịch bacteriocin thô từ Bacillus licheniformis KN Hình 3.20 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ B licheniformis KN Kết cho thấy nhiệt độ bảo quản có ảnh hưởng đến khả kháng khuẩn bacteriocin từ B licheniformis KN khoảng thời gian bảo quản dài Bacteriocin sau 10 ngày bảo quản, nhiệt độ 33C 4C cịn hoạt tính gần 50% so với ban đầu cịn nhiệt độ -20C -60C giữ nguyên hoạt tính kháng khuẩn Tại nhiệt độ -20C -60C sau thời gian 20 ngày bảo quản, bacteriocin cịn hoạt tính đến 77%-82% Ở ngày thứ 30, nhiêt độ 33C ức chế vi khuẩn đối kháng hoàn toàn hoạt tính nhiệt độ mát âm sâu hoạt tính giữ cịn khoảng gần 45% Theo kết thống kê với mức tin cậy 95%, nhiệt độ -20C -60C nhiệt độ bảo quản tốt cho khả kháng B cereus dịch nuôi cấy B licheniformis KN khoảng thời gian dài Từ thấy bateriocin thơ từ B licheniformis KN có hoạt tính ổn định 10 ngày bảo quản nhiệt độ -20C -60C Có thể thấy hoạt tính bacteriocin từ B licheniformis KN bền nhiều so với hoạt tính bacteriocin từ B subtilis NN Cụ thể bảo quản nhiệt độ lạnh sâu bacteriocin từ B licheniformis KN ổn định sau 10 ngày giảm mạnh sau đó, hoạt tính bacteriocin từ B subtilis NN ổn định tối thiểu 30 ngày 41 ... 95%) cho thấy hoạt tính ức chế B cereus cao dịch nuôi cấy B subtilis NN nhiệt độ từ 33°C-37°C 18 32 Kết có khác biệt so với nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho khả kháng khuẩn từ Bacillus subtilis. .. khuẩn có khả sinh amylase, cho phản ứng VP dương tính, khơng có khả sinh indole, có khả di động, sinh catalase Đây cá đặc điểm điển hình chi Bacillus 26 Hình 3 .4 Kết test sinh hóa chủng Bacillus. .. 25°C sau 24 ni cấy, hoạt tính kháng khuẩn tăng nhiên nhìn chung thấp nhiều so với mốc nhiệt độ khác Từ nhận thấy 18 ni cấy 33°C-37°C điều kiện thích hợp khả sinh bacteriocin Bacillus subtilis