Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao 2

14 PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1 Chi Bacillus Chi Bacillus là những trực khuẩn nhỏ Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, sinh nội bào tử với hình thái tế bào đặc trưng là hình que, sản xuất catalase Chúng được tìm thấy ở nhiều môi trường như đất, nước, thảm thực vật và trong hệ tiêu hóa của các loài động vật 15 Các bào tử Bacillus được sản xuất khi vi khuẩn gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt Khi chất dinh dưỡng suy giảm, tế bào sinh dưỡng t.

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Bacillus Chi Bacillus trực khuẩn nhỏ Gram dương, hiếu khí kỵ khí tùy nghi, sinh nội bào tử với hình thái tế bào đặc trưng hình que, sản xuất catalase Chúng tìm thấy nhiều mơi trường đất, nước, thảm thực vật hệ tiêu hóa lồi động vật [15] Các bào tử Bacillus sản xuất vi khuẩn gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt Khi chất dinh dưỡng suy giảm, tế bào sinh dưỡng thay đổi hình thái tạo tiền bào tử bên nang bào tử sau khoảng tiếng, bào tử hoàn chỉnh giải phóng [16] Bào tử Bacillus tế bào khơng hoạt động trao đổi chất có khả chống lại tác động nhiệt, khô hạn, hóa chất độc hại xạ Việc sử dụng loài Bacillus làm thực phẩm bổ sung nghiên cứu rộng rãi nhờ khả kích thích miễn dịch, hoạt động kháng khuẩn đảm bảo tính ổn định sản phẩm [17] 1.2 Bacteriocin Bacteriocin like substance Bacteriocin phong phú, chất protein peptide sản xuất ribosome Bacteriocin có khả ức chế sinh trưởng giết chết vi sinh vật khác [18] [19] Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm khác với bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương, đối tượng nghiên cứu đề tài Bacillus nên đề cập đến bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương 14 1.2.1 Phân loại Các bacteriocin BLS phân loại theo kích thước phân tử, tính đặc hiệu phương thức hoạt động, diện acid amin biến đổi đặc điểm hình thái thành bốn lớp lớp chia thành loại lớp Hình 1.1 Sơ đồ phân loại bacteriocin vi khuẩn Gram dương [20] Các bacteriocin loại I gọi lantibamel, chuỗi peptide ngắn (15 kDa), có chứa cấu trúc domain 15 Bảng 1.1 phân loại số bacteriocin Phân loại Bacteriocin Chủng sản xuất Lớp I Nisin A Lactococcus lactis subsp lactic Nisin U Streptococcus uberis Lớp II Mersacidin Bacillus sp.Y85,54728 Subtilosin A Bacillus subtilis 168 Lactacin F Lactococcin A ABP-118 Lactobacillus spp Lactococcus lactis subsp Cremoris Lactobacillus salivarius subsp salivarius UCC118 Lớp III Caseicin 80 Lactobacillus casei B80 Helveticin J Lactobacillus helveticus 481 1.2.2 Cơ chế tác động Các bacteriocin tổng hợp ribosome vi khuẩn vi khuẩn giải phóng bên ngồi Các bacteriocin ức chế tiêu diệt vi khuẩn khác qua đường: Tạo lỗ: Bacteriocin tác động vào lớp phospholipid sau dẫn đến hình thành lỗ kênh vận chuyển màng gây rò rỉ hợp chất tế bào chất acid amin, ATP, gây điện tích, phá hủy gradient điện hóa từ gây chết tế bào [6] Nuclease: BLS enzyme DNase, 16S rRNase, tRNase có đặc tính phân hủy DNA RNA vi khuẩn đích từ dẫn đến ức chế chép DNA, phiên mã RNA, dịch mã tạo protein [6] Peptidoglycanase: BLS enzyme phân giải tiền chất peptidoglycan dẫn đến vi khuẩn đích khơng thể tổng hợp vách tế bào, làm cho tế bào vi khuẩn trở nên dễ vỡ [6] 16 Hình 1.1 chế tác động bacteriocin 1.2.3 Bacteriocin / bacteriocin like substance chi Bacillus Lồi Bacillus subtilis có khả sinh số bacteriocin như: Subtilin [10], Subtilosin A, Ericin [23],… Một nghiên cứu báo cáo chủng Bacillus subtilis 168 sản xuất 10 loại bacteriocin mơi trường hình thành bào tử (sporulation medium), subtilosin A loại sản xuất giai đoạn đầu trình hình thành bào tử [24] Năm 2011 Syed Iqbal Alam cộng xác định BLS có kích thước từ 3-5 kDa từ chủng Bacillus subtilis BS15 có khả ức chế tiêu diệt Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi Năm 2013 Clarisse S Compaoré cộng phân lập chủng B subtilis H4 từ Bikalga (một loại thực phẩm lên men từ dấm bụt) Tây Phi có khả ức chế Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus Bacillus cereus, người ta nghiên cứu chất kháng khuẩn từ chủng sản xuất pha tăng trưởng Sau phân tích SDS-PAGE UHPLC-TOFMS, dịch nuôi cấy vô bào xác định có chứa protein với kích thước xấp xỉ kDa (tương đương kích thước subtilin subtilosin) [25] Năm 2018 Seul Gi Lee phát loại bacteriocin có tên mejucin từ chủng B subtilis SN7 có tác dụng ức chế B cereus [26] Một số hợp chất kháng khuẩn sản xuất từ Bacillus licheniformis nghiên cứu công bố như: bacteriocin-like peptide gồm lichenin phân lập từ cỏ trâu, bacillocin 490 từ sản phẩm bơ sữa, lichenicidin (, ) thuộc lớp I.3 Lichenin loại bacteriocin sản xuất điều kiện yếm khí B licheniformis 26L-10/3RA phân lập từ cỏ trâu Đây 17 peptide mã hóa gen nhiễm sắc thể, có tính kỵ nước, nhạy cảm với oxy, bền với nhiệt (duy trì hoạt tính sau đun sơi 10 phút) Trọng lượng phân tử lichenin ước tính điện di gel SDS-PAGE sắc ký lọc gel khoảng 1400-1500 Da, trùng với giá trị 1344 Da ước tính từ acid amin hồn chỉnh [27] 1.3 Một số nghiên cứu ngồi nước Bacteriocin, peptide kháng khuẩn hay hợp chất kháng mốc ngày ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp khác nhau: ứng dụng việc kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, ức chế vi sinh vật gây bệnh động vật, thực vật Năm 2006, bacteriocin-like peptides Bacillus licheniformis ZJU12 Lili He cộng phân lập từ đất có phổ đối kháng rộng chống lại loài vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, S aureus ATCC 25923, Enterococcus faecium) vi nấm gây bệnh (Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum, Guignardia sp., Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani) không chống lại vi khuẩn Gram âm trừ Xanthomonas oryzae pv oryzae [28] Năm 2012 Asma Ansari cộng tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis KIBGE IB-17 sản sinh bacteriocin hoạt tính cao Điều kiện lựa chọn thời gian nuôi cấy 24 giờ, pH môi trường điều chỉnh pH 7.0, 37°C, nồng độ NaCl, tryptone, yeast extract bổ sung 0.5%, 1%, 0.5% [29] Năm 2013, Alvarez-Ordóđez cộng xác định khả kháng khuẩn mười chủng Bacillus licheniformis phân lập từ loại sữa bột cho trẻ sơ sinh bán Ireland chống lại loạt vi sinh vật (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Salmonella typhimurium Escherichia coli) Kết thu từ phương pháp phân tích PCR MALDI-TOF MS có bốn chủng B licheniformis sản xuất loại bacteriocin lichenicidin Sáu chủng cịn lại sản xuất loại bacteriocin khác có hoạt tính cao so với chủng sản xuất lichenicidin [30] Năm 2015 Xiaoming Liu cộng phân lập B subtilis EMD4 từ nước tương có khả ức chế mạnh phát triển B cereus B thuringiensis Hoạt tính kháng khuẩn dịch ni cấy ổn định pH từ 3.0-9.0, hoạt tính giữ nguyên sau 15 phút 80°C giảm 50% sau 15 phút 90°C Dựa vào trình tự nucleotide, hợp chất kháng khuẩn từ B subtilis EMD4 xác định Subtilosin A [31] 18 Năm 2015, Khochamit cộng phân lập từ đất địa phương chủng Bacillus subtillis KKU213 có khả ức chế vi khuẩn gồm Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Micrococcus Staphylococcus aureus, dịch ni cấy giữ hoạt tính kháng khuẩn xử lí 60°C-100°C, pH 4.0-10.0 Sau phân tích SDS-PAGE cho thấy protein có hoạt tính kháng khuẩn có kích thước nhỏ 10 kDa, cuối xác định subtilosin A [32] Năm 2015 A Asaturova cộng tiến hành khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng B subtilis BZR 336g B subtilis BZR 517 đối kháng với Fusarium graminearum, yếu tố khảo sát gồm: nhiệt độ, pH, nguồn nitrogen, nguồn carbon Kết mơi trường khảo sát thích hợp chủng B subtilis BZR 336g 30°C pH 6.0 8.0; chủng B subtilis BZR 51 35°C pH 10.0 với nguồn dinh dưỡng molasses corn extract [33] Năm 2018 Đỗ Thị Hiền khảo sát điều kiện nuôi cấy B subtilis để sản sinh bacteriocin có hoạt lực cao, mơi trường sử dụng môi trường Luria Bertani chứa cao nấm men peptone với nồng độ NaCl 3.5%, pH 7.0 Bacteriocin thô thu có khả đối kháng tốt với Vibrio spp nên có tiềm việc thay chất kháng sinh ni tơm [9] Tình hình nghiên cứu nước đề cập cho thấy hướng nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin từ Bacillus cịn nhiều tiềm có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn Vì lý tơi định thực đề tài “Tuyển chọn xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis có khả sản sinh bacteriocin hoạt tính cao” 19 ... oryzae [28 ] Năm 20 12 Asma Ansari cộng tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis KIBGE IB-17 sản sinh bacteriocin hoạt tính cao Điều kiện lựa chọn thời gian nuôi cấy 24 giờ,... kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin từ Bacillus nhiều tiềm có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn Vì lý tơi định thực đề tài ? ?Tuyển chọn xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Bacillus. .. hoạt tính kháng khuẩn có kích thước nhỏ 10 kDa, cuối xác định subtilosin A [ 32] Năm 20 15 A Asaturova cộng tiến hành khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho hai chủng B subtilis BZR 336g B subtilis