Tuyển chon xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ Enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn P3.

MẪU 14KHCN 26 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Phân lập và thuần khiết các chủng xạ khuẩn Từ nhiều mẫu đất khác nhau, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 20 chủng xạ khuẩn Các chủng này được quan sát đặc điểm hình thái trên môi trường thạch Gause I sau khi ủ 7 ngày ở 37C Dựa vào sự khác nhau về hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty và sắc tố khuếch tán trên môi trường thạch nuôi cấy Gause I, các chủng xạ khuẩn phân lập được kí hiệu lần lượt là RBXK2, RBXK3, RBXK4, RBXK5, RBXK7, RBXK8, R.

CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập khiết chủng xạ khuẩn Từ nhiều mẫu đất khác nhau, phân lập khiết 20 chủng xạ khuẩn Các chủng quan sát đặc điểm hình thái mơi trường thạch Gause I sau ủ ngày 37C Dựa vào khác hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty sắc tố khuếch tán môi trường thạch nuôi cấy Gause I, chủng xạ khuẩn phân lập kí hiệu RBXK2, RBXK3, RBXK4, RBXK5, RBXK7, RBXK8, RBXK9, RBXK10, RBXK16, RBXK17, RBXK21, RBXK22, RBXK23, VTXK10, VTXK11, VTXK17, VTXK19, VTXK20, VTXK21, VTXK22 thể bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái đại thể chủng xạ khuẩn phân lập môi trường Gause I STT Tên xạ khuẩn Kích thước khuẩn lạc (mm) Khuẩn ty Khuẩn ty sinh dưỡng khí sinh Sắc tố tiết RBXK2 2,0a±0,16 Trắng vàng Vàng nhạt Không RBXK3 4,0b±0,41 Trắng vàng Vàng nhạt Nâu nhạt RBXK4 6,0c±0,82 Đỏ tím Đỏ tím Đỏ tím RBXK5 1,0d±0,0 Trắng đục Trắng đục Không RBXK7 3,0e±0,41 Trắng đục Trắng đục Không RBXK8 0,93d±0,09 Nâu nhạt Nâu đen Nâu RBXK9 2,0a±0,24 Nâu nhạt Trắng ngà Nâu nhạt RBXK10 1,0d±0,0 Trắng ngà Trắng Không RBXK16 4,0b0,82 Trắng Trắng đục Không 10 RBXK17 2,07a±0,09 Trắng Vàng cam Không 11 RBXK21 2,0a±0,82 Vàng cam Trắng Không 12 RBXK22 1,0d±0,0 Trắng đục Trắng đục Không 13 RBXK23 1,0d±0,0 Nâu nhạt Nâu đậm Nâu 14 VTXK10 1,0d±0,0 Cam Trắng Vàng nhạt 15 VTXK11 1,0d±0,0 Trắng Trắng Trắng 26 16 VTXK17 2,07a±0,09 Vàng nhạt Trắng Không 17 VTXK19 2,0a±0,82 Trắng vàng Trắng Nâu nhạt 18 VTXK20 2,0a±0,0 Vàng Vàng nâu Không 19 VTXK21 2,33f±0,85 Trắng Trắng Không 20 VTXK22 3,0e±0,82 Vàng nhạt Trắng Nâu vàng Hình 3.1: Hình thái khác chủng xạ khuẩn môi trường Gause I 3.2 Tuyển chọn xạ khuẩn có khả sinh enzyme amylase ngoại bào Các chủng xạ khuẩn sau phân lập tiến hành khảo sát khả sản sinh amylase ngoại bào dựa phân hủy chất tinh bột nhận diện thuốc thử lugol Căn vào vòng phân giải tinh bột đường kính khuẩn lạc, hoạt tính amylase chủng xạ khuẩn xác định sơ thể hình 3.2, 3.3 bảng 3.2 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn sau 10 ngày ni cấy Xạ khuẩn Độ lớn vịng phân giải tinh bột (mm) RBXK2 23,0a±0,2 RBXK3 35,0b±0,2 RBXK7 17,0c±0,3 RBXK16 26,0a±0,3 RBXK17 21,0a±0,3 27 RBXK23 10,0d±0,2 VTXK10 11,0d±0,3 VTXK11 5,0e±0,1 VTXK17 4,0e±0,1 VTXK20 11,0d±0,1 Trong số 20 chủng xạ khuẩn phân lập kiểm tra sơ hoạt tính amylase, 10 chủng xạ khuẩn thể khả phân giải tinh bột mức độ mạnh yếu khác Các chủng xạ khuẩn RBXK2, RBXK3, RBXK16, RBXK17 thể hoạt tính amylase mạnh mẽ với đường kính vịng phân giải từ 21,0±0,3 mm đến 35,0±0,2 mm, chủng RBXK3 thể hoạt tính amylase mạnh với đường kính vịng phân giải lên đến 35,0±0,2 mm Hoạt tính amylase yếu quan sát thấy chủng xạ khuẩn VTXK11 VTXK17 với đường kính vịng phân giải 5,0±0,1 mm 4,0±0,1 mm Các chủng xạ khuẩn RBXK7, RBXK23, VTXK10, VTXK20 thể hoạt tính amylase trung bình với vịng phân giải tinh bột khoảng 10,0±0,2 mm đến 17,0±0,3 mm Với độ lớn vòng phân giải 4,0-35,0 mm, 10 chủng xạ khuẩn phân lập thể khả sản sinh amylase ngoại bào cao chủng Streptomyces S1-S8 phân lập chọn lọc từ biển nghiên cứu Sathya Rengasamy cộng (2018) với vòng phân giải tinh bột ghi nhận khoảng 4,0-20,0 mm [16], đồng thời so sánh độ lớn vòng phân giải với chủng Streptomyces sp SLBA-08 chọn lọc từ 286 chủng xạ khuẩn nghiên cứu Santos cộng (2012) chủng xạ khuẩn RBXK3 nghiên cứu có kết vịng phân giải tinh bột tương đương [25] Như vậy, với thể khả sinh tổng hợp amylase cao, chủng xạ khuẩn RBXK3 chọn làm đối tượng nghiên cứu cho thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp amylase Hình 3.2: Khả sinh amylase số chủng xạ khuẩn phân lập 28 Hình 3.3: Hoạt tính amylase chủng xạ khuẩn dựa vịng phân giải tinh bột Hình thái vi thể chủng xạ khuẩn tiến hành quan sát tiêu phịng ẩm kính hiển vi quang học Kết quan sát cho thấy cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn VTXK10, VTXK11, VTXK20 có dạng gấp khúc, phân nhánh cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn RBXK2, RBXK3, RBXK7, RBXK16, VTXK17, RBXK17, RBXK23 có dạng xoắn, với 2-5 vịng xoắn Các chủng xạ khuẩn tiến hành định danh phương pháp sinh học phân tử với việc giải trình tự vùng 16S rRNA Kết ban đầu xác định chủng VTXK10 VTXK11 có độ tương đồng cao tương ứng với Amycolaptosis sp CD-15 Amycolaptosis sp CD-17 99,35% 98,28%, đồng thời chủng RBXK3 có độ tương đồng với Streptomyces sp với hệ số tương đồng 99% Hình 3.4: Hình thái vi thể chủng xạ khuẩn độ phóng đại X1000 (bar 0,02mm) 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, vi thể định danh xạ khuẩn RBXK3 Chủng xạ khuẩn RBXK3 kiểm tra đặc điểm đại thể hình thái khuẩn lạc môi trường Gause I sau 10 ngày nuôi ủ Khuẩn lạc RBXK3 trịn, có kích thước 4,0-6,0 29 mm, màu trắng vàng, bờ không đều, tâm màu vàng nhạt, khuẩn ty chất bám sâu vào bề mặt thạch, khuẩn ty khí sinh nằm sát bề mặt mơi trường (hình 3.5A) Kết vi thể tiêu phịng ẩm quan sát kính hiển vi cho thấy cuống sinh bào tử RBXK3 phân nhánh, có dạng xoắn lị xo, với bào tử hình thành cuống sinh bào tử dạng chuỗi dài (hình 3.5B-C) Hình 3.5: Hình thái đại thể vi thể xạ khuẩn RBXK3 (A) Hình thái khuẩn lạc môi trường Gause I sau ngày nuôi ủ 37C (B) Hình ảnh vi thể độ phóng đại X1000 (C) Hình ảnh phóng đại cuống sinh bào tử (mũi tên đen) chuỗi bào tử (mũi tên trắng) Bên cạnh đó, phần trình tự đoạn gen mã hóa cho16S-rRNA (900 bp) xạ khuẩn RBXK3 kiểm tra với trình tự mồi so sánh với ngân hàng liệu NCBI Kết cho thấy gen mã hóa cho 16S-rRNA chủng RBXK3 có tương đồng với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Dựa kết thu được, phả hệ chủng xạ khuẩn RBXK3 với loài gần xây dựng xác định chủng xạ khuẩn RBXK3 thuộc chi Streptomyces (hình 3.6) 30 Hình 3.6: Cây phả hệ thể mối quan hệ di truyền (vùng vùng trình tự 16S ribosomal RNA) mẫu nghiên cứu taxa từ liệu NCBI, xây dựng phần mềm MrBayes theo phương pháp Bayesian với nhánh có giá trị bootstrap > 50% giữ lại 3.4 Ảnh hƣởng nguồn chất lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 Tương tự loại vi sinh vật khác, tổng hợp enzyme ngoại bào xạ khuẩn chịu ảnh hưởng trực tiếp chất tương ứng có mơi trường Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng chất tinh bột khác (tinh bột tan, bột gạo, bột mì, bột bắp) lên trình sinh tổng hợp amylase ngoại bào xạ khuẩn RBXK3 Dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau 24 nuôi ủ thu nhận kiểm tra hoạt tính amylase theo phương pháp Bernfeld Kết ảnh hưởng chất tinh bột khác theo thời gian lên sinh tổng hợp amylase trình bày hình 3.7 Hình 3.7: Ảnh hưởng nguồn chất lên tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 nuôi cấy (B) 31 Kết cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 có khả sinh tổng hợp amylase môi trường Gause II với chất bổ sung tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp với mức độ khác (hình 3.7A) Trong 48 ni ủ ban đầu, RBXK3 thể tổng hợp enzyme không đáng kể Sau 72 nuôi ủ, bốn loại chất cho thấy sinh tổng hợp amylase vượt trội, nguồn chất tinh bột bột bắp cho kết tốt với hoạt tính 2895 ± 56,5 U/ml 2660 ± 97,8 U/ml, hoạt tính amylase thu điều kiện bột gạo bột mì đạt 1221 ± 64,2 U/ml 1683 ± 147,6 U/ml Tuy nhiên, sau thời gian nuôi ủ 96 giờ, hoạt tính amylase mơi trường bổ sung chất bột gạo cho kết tăng cao với 3266 ± 138,1 U/ml, tương tự hoạt tính đạt mơi trường có nguồn chất tinh bột 3248 ± 91,9 U/ml, mơi trường có chất bột mì bột bắp cho kết đạt 2189 ± 74,2 U/ml 1574 ± 24,3 U/ml (hình 3.7B) Sự gia tăng thời gian ni ủ cho thấy giảm hoạt tính amylase dịch ni cấy, ngồi trừ mơi trường có nguồn chất tinh bột, nguyên nhân nguồn chất khơng phải mơi trường thích hợp cho sinh trưởng xạ khuẩn, đó, hạn chế mật độ xạ khuẩn hạn chế sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Bên cạnh đó, kết phân tích thống kê cho thấy có khác biệt đáng kể nguồn chất tinh bột với nguồn chất bột bắp, bột mì khơng có khác biệt nguồn chất bột gạo lên sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn RBXK3 sau 96 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Do đó, để ổn định q trình sinh tổng hợp enzyme, tinh bột chọn làm chất cho thí nghiệm khảo sát lên trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 với thời gian nuôi ủ sau 96 3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 Bên cạnh nguồn chất cacbon, nitơ thành phần thiếu sinh trưởng phát triển loại sinh vật Sự sinh tổng hợp enzyme ngoại bào vi sinh vật bị ảnh hưởng thành phần Do đó, để xác định ảnh hưởng nitơ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3, tiến hành khảo sát nguồn nitơ khác (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, NaNO3, ure, cao nấm men, tryptone lên sản sinh amylase ngoại bào xạ khuẩn Hoạt tính amylase dịch nuôi cấy kiểm tra sau 24 ni ủ thể hình 3.8 32 Hình 3.8: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 nuôi cấy (B) Hoạt tính amylase chủng RBXK3 ghi nhận cho kết cao môi trường nuôi cấy có bổ sung nguồn nitơ NH4NO3 với 4161,9 U/ml ± 140,2 U/ml sau 96 lên men trì hoạt tính cao theo khoảng thời gian lên men đến 144 (hình 3.8A) Hoạt tính amylase mơi trường lên men có bổ sung (NH4)2SO4 ure ghi nhận 3980,9 ± 185,4 U/ml 3827,1 ± 84,1 U/ml thời điểm lên men 96 chênh lệch không đáng kể so sánh với môi trường lên men có chứa NH4NO3 (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Tuy nhiên, sau thời gian tiếp tục lên men đến 144 hoạt tính amylase giảm cho thấy có ảnh hưởng sản phẩm trao đổi thứ cấp mơi trường lên men lên hoạt tính amylase sinh tổng hợp từ xạ khuẩn RBXK3 Ngoài ra, hoạt tính amylase dung dịch enzyme mơi trường bổ sung nguồn nitơ khác kiểm tra, hoạt tính thể thấp với giá trị 3275,2 ± 267,4 U/ml, 2732,4 ± 209,3 U/ml, 3438,1 ± 140,2 U/ml, 3166,7 ± 85,3 U/ml tương ứng với NH4Cl, NaNO3, Tryptone, cao nấm men (hình 3.8B) Sự gia tăng thời gian nuôi cấy đến 144 ảnh hưởng đến chất lượng dung dịch enzyme môi trường lên men cho thấy hoạt tính amylase giảm mạnh so với hoạt tính ghi nhận trước Căn kết thu nhận được, nguồn nitơ NH4NO3 chọn bổ sung vào môi trường sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 với thời gian lên men xác định sau 96 3.6 Ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 Nhiệt độ lên men yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme khả sản sinh enzyme vi sinh vật, đặc biệt xạ khuẩn Ảnh hưởng nhiệt độ 33 lên sinh tổng hợp amylase kiểm tra môi trường Gause II với nguồn nitơ NH4NO3 điều kiện nhiệt độ khác (25, 30, 35, 37, 40C), 150 vịng/phút Hoạt tính amylase dung dịch nuôi cấy nhiệt độ khác kiểm tra tương tự thí nghiệm sau 24 hoạt tính không tăng đáng kể kết thể hình 3.9 bên Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể hoạt tính khác điều kiện nhiệt độ khác sau 144 lên men (hình 3.9A), hoạt tính cao điều kiện nhiệt độ 37C với 4478,6 ± 42,0 U/ml điều kiện nhiệt độ khác thể thấp tương ứng 380,0 ± 24,3 U/ml, 633,3 ± 70,1 U/ml, 841,4 ± 64,2 U/ml, 2542,4 ± 85,3 U/ml nhiệt độ 25C, 30C, 35C, 40C So sánh hoạt tính thể theo thời gian nhiệt độ khác nhau, kết cho thấy khả sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn RBXK3 khơng thích hợp nhiệt độ thấp 25C, 30C nhiệt độ ấm 35C-40C thích hợp cho tổng hợp amylase Điều phù hợp cho đặc tính sinh trưởng phát triển ưa nhiệt chủng xạ khuẩn Hình 3.9: Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ khác lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 nuôi cấy (B) Tại điều kiện 35C, 37C, 40C, sau 96 lên men, hoạt tính amylase thể tương ứng 3429,0 ± 78,0 U/ml, 3600,9 ± 28,0 U/ml, 3492,4 ± 85,3 U/ml kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể sinh tổng hợp amylase điều kiện nhiệt độ sau 96 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.9B) Tuy nhiên, thời gian ni ủ tăng lên, hoạt tính amylase điều kiện 35C 40C giảm, hoạt tính amylase 37C khơng có xu hướng giảm tiếp tục tăng nhẹ Kết nguyên nhân giảm khả sinh trưởng xạ khuẩn môi trường nhiệt độ thấp, ảnh hưởng chất trao đổi thứ cấp xạ khuẩn trình sinh trưởng hình thành Kết tương tự quan sát thấy 34 sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Streptomyces spp PDS1 nghiên cứu Ragunathan cộng (2013) [17] Ngoài ra, kết cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 sinh tổng hợp amylase tốt sau 96 ni ủ tương tự dịng xạ khuẩn Streptomyces S1-S8 nghiên cứu Sathya Rengasamy cộng (2018) [16], chủng Streptomyces gancidius_ASD-KT852565 nghiên cứu Ashwini Krishnan cộng (2015) [11] nhanh chủng Streptomyces spp PDS1 với thời gian thích hợp 120 (Ragunathan cộng sự-2013) [17], chủng Streptomyces sp D1 có thời gian lên men tạo amylase thích hợp 10 ngày nghiên cứu Chakraborty cộng (2009) [31] Dựa vào kết thu nhận được, nhiệt độ 37C chọn cho sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 thời gian nuôi ủ xác định tương tự kết nghiên cứu trước sau 96 3.7 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 Ngoài việc chịu ảnh hưởng thành phần chất cacbon, nitơ, điều kiện nhiệt độ môi trường, sinh tổng hợp amylase ngoại bào vi sinh vật bị ảnh hưởng yếu tố pH môi trường cấy Để khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3, môi trường Gause II với thành phần chất tinh bột nguồn nitơ NH4NO3 điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ± 0,1 xạ khuẩn nuôi cấy nhiệt độ 37C điều kiện lắc 150 vòng/phút Dung dịch enzyme thu nhận kiểm tra hoạt tính sau 24 ni cấy Hình 3.10: Ảnh hưởng điều kiện pH khác lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn RBXK3 theo thời gian (A) thời điểm 96 ni cấy (B) Kết thể hình cho thấy chủng xạ khuẩn RBXK3 có khả tổng hợp amylase tốt mơi trường ni cấy có giá trị pH ban đầu khoảng 6,0-8,0 35 mạnh pH 8,0 với hoạt tính 4379,0 ± 78,0 U/ml hoạt tính điều kiện pH 6,0 7,0 3392,9 ± 64,2 U/ml 3528,6 ± 24,3 U/ml sau 96 nuôi ủ Kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể sinh tổng hợp amylase sau 96 với 120 144 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.10A) Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme thu nhận mơi trường ni cấy có điều kiện pH 4,0, 5,0 9,0 thể hoạt tính thấp đạt 2099,0 ± 61,1 U/ml pH 4,0, 2859,0 ± 114,7 U/ml pH 5,0 1954,3 ± 121,4 U/ml điều kiện pH 9,0 sau 96 ni ủ, đồng thời hoạt tính giảm mạnh theo thời gian nuôi ủ đạt 1076,7 U/ml sau 144 ni ủ (hình 3.10A) Ngồi ra, giảm hoạt tính enzyme điều kiện pH acid mạnh (4,0 – 5,0) pH kiềm (9,0) điều kiện bất lợi môi trường ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển xạ khuẩn, từ ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme xạ khuẩn Kết khảo sát cho thấy sinh tổng hợp amylase RBXK3 thích hợp điều kiện pH trung tính, acid yếu kiềm yếu (6,0-8,0), kết phân tích thống kê cho thấy có khác biệt đáng kể hoạt tính amylase thu nhận pH 8,0 với điều kiện pH 6,0 7,0 sau 96 nuôi ủ (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) (hình 3.10B) Như vậy, chủng xạ khuẩn RBXK3 thích hợp sinh tổng hợp amylase mơi trường có pH kiềm, phần lớn chủng xạ khuẩn nghiên cứu trước thể tốt điều kiện pH trung tính 7,0 chủng Streptomyces sp SLBA-08, chủng Streptomyces spp PDS1 nghiên cứu tương ứng Santos cộng (2012) [25], Ragunathan cộng (2013) [17], chủng xạ khuẩn Streptomyces gancidius_ASD-KT852565 phân lập từ biển nghiên cứu Ashwini Krishnan cộng (2015) [11] Ngoài ra, sinh tổng hợp amylase từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm ghi nhận nghiên cứu Chakraborty S cộng (2012) [32] 3.8 Tinh amylase xạ khuẩn RBXK3 Chủng xạ khuẩn RBXK3 nuôi mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp amylase sau 96 tiến hành thu dịch nuôi cấy có chứa enzyme ngoại bào Các tế bào xạ khuẩn loại bỏ phương pháp ly tâm 6.000 vòng/phút 4°C 15 phút Dung dịch thu nhận tiến hành tủa muối (NH4)2SO4 tinh sắc ký trao đổi ion Kết phân tích giai đoạn tinh amylase SDS-PAGE thể hình 3.11 Kết phân tích SDS-PAGE cho thấy amylase xạ khuẩn RBXK3 sau tinh với sắc ký trao đổi ion, phân đoạn protein thu cho trọng lượng 36 phân tử khoảng 24kDa Trọng lượng phân tử amylase thu tương tự amylase chủng Bacillus licheniformis CUMC305 (~28kDa) nghiên cứu T Krishnan [33] thấp amylase thu nhận từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp AlDhabi-46, Streptomyces fragilis DA7-7 Streptomyces gulbargensis với trọng lượng phân tử tương ứng 44kDa, 51kDa 55kDa [23, 24, 27] Enzyme sau tinh tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa điều kiện phản ứng khác Hình 3.11: Kết tinh amylase ngoại bào xạ khuẩn RBXK3 Kết điện di sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 12% dung dịch enzyme thô (A), dung dịch sau tủa với (NH4)2SO4 (B) sau tinh với sắc ký trao đổi ion (C) M thang chuẩn protein 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ pH lên hoạt tính amylase xạ khuẩn RBXK3 Hoạt tính xúc tác enzyme bị ảnh hưởng yếu tố mơi trường phản ứng, nhiệt độ pH có tác động mạnh mẽ lên cấu trúc enzyme làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Hoạt tính amylase xạ khuẩn RBXK3 kiểm tra dung dịch phản ứng đệm phosphate 50 mM pH 7,0 điều kiện nhiệt độ khác 25-80°C Hoạt tính enzyme xác định thơng qua lượng đường khử tạo thành thể hình 3.12A Kết kiểm tra cho thấy enzyme thể khả chịu nhiệt có hoạt tính cao điều kiện phản ứng 40°C tăng dần nhiệt độ tăng cao đạt hoạt tính cao nhiệt độ 65°C (1,1x107±2,5x104 U/mg) Ngồi ra, kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt đáng kể nhiệt độ phản ứng 65°C với nhiệt độ phản ứng khác (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) Sự tiếp tục gia tăng nhiệt độ phản ứng làm giảm hoạt tính enzyme, đạt 8,5x105±1,2x104U/mg 70°C 7,0x105±4,2x104/mg 80°C Tuy nhiên, giảm 37 hoạt tính nhiệt độ cao 80°C tương tự điều kiện thí nghiệm 37°C đạt 7,6x105±6,7x104 U/mg Hoạt tính enzyme thu amylase sau trình tinh cho thấy khả xúc tác mạnh mẽ enzyme từ chủng xạ khuẩn RBXK3 cao 573 lần so với amylase xạ khuẩn Streptomyces gulbargensis nghiên cứu Dastager G Syed cộng (2009) [27] Ngoài ra, khả xúc tác điều kiện nhiệt độ cao amylase quan sát thấy nghiên cứu hoạt tính amylase chủng xạ khuẩn Streptomyces fragilis DA7-7 Streptomyces sp MSC702 với nhiệt độ tối thích tương ứng 50°C 60°C [19, 24], nhiên, hoạt tính thu amylase từ RBXK3 cao nhiều lần so với amylase chủng xạ khuẩn Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng (A) pH phản ứng (B) lên hoạt tính amylase ngoại bào xạ khuẩn RBXK3 Để kiểm tra ảnh hưởng pH phản ứng lên hoạt tính enzyme, dung dịch đệm cho phản ứng thiết kế theo giá trị pH khác 3,0 đến 10,0, tương ứng đệm citrate (pH 3,0-6,0), đệm phosphate (6,0-8,0), đệm Tris-HCl (pH 8,0-10,0), sử dụng NaOH 1N để chỉnh pH phản ứng khoảng pH 10-12 Ảnh hưởng điều kiện pH lên hoạt tính enzyme thể hình 3.12B Kết cho thấy amylase hoạt tính xúc tác điều kiện pH 3,0 pH 4,0 Hoạt tính xúc tác thể điều kiện pH 5,0-10,0 giảm pH 12,0 Hoạt tính enzyme thể cao phản ứng với dung dịch đệm Tris-HCl với pH 10,0 (2,2x107±4,4x105U/mg) Như vậy, amylase chủng xạ khuẩn có khả xúc tác điều kiện phản ứng có pH kiềm cao, kết tương tự quan sát thấy nghiên cứu amylase từ chủng Streptomyces gulbargensis tác giả Dastager G Syed cộng với khoảng pH tối ưu 8,5-11, nhiên hoạt tính enzyme từ RBXK3 cao 10.000 lần so với hoạt tính amylase từ chủng xạ khuẩn [27] Như vậy, enzyme ngoại bào amylase chủng xạ khuẩn RBXK3 cho thấy điều kiện phản ứng thích hợp 65°C pH 10,0, thể khả 38 xúc tác phản ứng môi trường cực đoan cho thấy tiềm ứng dụng dung dịch tẩy rửa công nghiệp điều kiện phản ứng nhiệt độ cao ngành công nghiệp khác 3.10 Độ bền nhiệt amylase xạ khuẩn RBXK3 Bên cạnh ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme, độ bền nhiệt enzyme điều kiện nhiệt độ khác cần xác định để có sơ sở cho việc bảo quản ứng dụng thực tế Để kiểm tra độ bền nhiệt enzyme, amylase xạ khuẩn RBXK3 ủ điều kiện nhiệt độ khác (25-85°C) kiểm tra hoạt tính mơi trường phản ứng thích hợp với nhiệt độ 65°C pH 10,0 Hoạt tính enzyme sau phản ứng so sánh với điều kiện đối chứng enzyme lưu 4°C Kết hoạt tính thu sau phản ứng trình bày hình 3.13 Hình 3.13: Độ bền nhiệt amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 Kết cho thấy amylase ngoại bào xạ khuẩn RBXK3 có khả bền nhiệt khoảng thí nghiêm 25-85°C Hoạt tính enzyme xử lý môi trường nhiệt độ cao (55-65°C) cho hiệu xúc tác cao đạt 130-132% so sánh với thí nghiệm đối chứng Ở điều kiện nhiệt độ xử lý 30-50°C 70°C, hoạt tính enzyme thu khoảng 121-125% hoạt tính so với đối chứng, hoạt tính enzyme nhiệt độ xử lý 25°C 75°C đạt tương ứng 111% 116% Khi xử lý enzyme nhiệt độ 80-85°C, hoạt tính enzyme giảm nhẹ đạt 89-95% so với đối chứng Khả sinh tổng hợp enzyme chịu nhiệt xạ khuẩn quan sát thấy nghiên cứu Krishnasamy Nithya cộng (2017) với chủng xạ Streptomyces fragilis DA7-7 có bền nhiệt 40-70°C với hoạt tính trì khoảng 90-100% [24] Như vậy, kết kiểm tra độ bền nhiệt cho thấy amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn RBXK3 có khả bền nhiệt cao, đồng thời, việc xử lý nhiệt làm tăng hoạt tính enzyme Khả bền nhiệt 39 chịu nhiệt enzyme yếu tố quan trọng cho việc ứng dụng enzyme lĩnh vực công nghiệp khác sở cho việc bảo quản enzyme thực tế 3.11 Ảnh hƣởng ion kim loại lên hoạt tính amylase xạ khuẩn RBXK3 Các ion kim loại có vai trị quan trọng hoạt động enzyme, cofactor thúc đẩy hoạt tính xúc tác enzyme Việc xác định cofactor thích hợp cho enzyme sở để thiết lập điều kiện phản ứng enzyme hoạt động tốt Trong thí nghiệm này, amylase xạ khuẩn RBXK3 kiểm tra hoạt tính mơi trường phản ứng có thành phần ion kim loại khác nhau, mẫu đối chứng thực không bổ sung ion kim loại, nhiên sau trình tinh sắc ký ion, mẫu enzyme có chứa ~1mM NaCl Để loại bỏ hết ion mẫu, EDTA thêm vào phản ứng với nồng độ cuối 10mM Hàm lượng ion kim loại khác bổ sung vào phản ứng với nồng độ cuối 5mM Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme thể hình 3.14 Hình 3.14: Ảnh hưởng ion kim loại khác lên hoạt tính amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 Amylase xạ khuẩn RBXK3 cho thấy hoạt tính xúc tác cao đạt phản ứng không bổ sung thêm ion kim loại (3,02x108U/mg) Trong mơi trường khơng có diện ion kim loại, hoạt tính amylase thể thấp môi trường chứa mM ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ Hoạt tính enzyme khơng quan sát thấy mơi trường có diện ion Mn2+ Fe2+ Như vậy, hoạt tính amylase từ xạ khuẩn RBXK3 cho hoạt tính cao mơi trường khơng bổ sung thêm ion kim loại, tương ứng với diện ~1mM Na+ phản ứng Kết thu 40 tương ứng với hoạt dộng amylase từ chủng Streptomyces sp Al-Dhabi-46, Streptomyces gulbargensis [23, 27] Sự gia tăng nồng độ ion Na+ lên 5mM làm giảm hoạt tính enzyme (1,71x108U/mg) Sự giảm hoạt tính enzyme môi trường chứa nồng độ ion kim loại cao quan sát thấy nghiên cứu nhóm tác giả Yasser R Abdel-Fattah (năm 2013) với amylase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis AI20 [26] 3.12 Động học enzyme Hoạt tính xúc tác enzyme kiểm tra thông qua việc xác định động học enzyme Ái lực liên kết với chất khả phân giải chất xác định theo phương trình Mechalis-Menten phần mềm Prism 3.0 Kết thể hình 3.15 Hình 3.15: Hoạt tính amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 nồng độ chất khác Kết khảo sát nồng độ chất khác (0-20 mg/ml), hoạt tính enzyme tăng dần theo nồng độ chất giá trị Vmax Km xác đinh với giá trị tương ứng Vmax = 1,38 x 109 U/mg Km = 6,05 mg/ml Giá trị Vmax amylase từ RBXK3 thể cao hầu hết amylase thu nhận từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu trước amylase từ chủng Streptomyces fragilis DA7-7 (0,624mU/mg), chủng Streptomyces gulbargensis (1341U/mg) [24, 27] Tuy nhiên, lực liên kết chất thấp so sánh với amylase xạ khuẩn Streptomyces gulbargensis (Km = 5,0 mg/ml) amylase từ chủng nấm mốc Trichoderma pseudokoningii (Km = 4,0 mg/ml) [27, 34] 41 3.13 Đáng giá sơ số tiêu nƣớc thải giàu tinh bột đƣợc xử lý xạ khuẩn Từ kết khảo sát sơ khả sinh enzyme amylase, chủng xạ khuẩn có khả sinh amylase ni tăng sinh môi trường Gause II nhiệt độ phòng ngày Kiểm tra mật độ tế bào xạ khuẩn phương pháp đếm khuẩn lạc Dung dịch nuôi cấy xạ khuẩn sử dụng làm chế phẩm để ứng dụng xử lý nước thải giàu tinh bột có mật độ x 107 CFU/ml Mẫu nước thải giàu tinh bột bổ sung chế phẩm xạ khuẩn theo tỷ lệ khác (0,5%, 1,0%, 2,0%) Mẫu nước thải ban đầu không bổ sung chế phẩm xạ khuẩn sử dụng nghiệm thức đối chứng Các thử nghiệm tiến hành ủ nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút 10 ngày Các tiêu BOD5, COD, hàm lượng tinh bột sau xử lý, giá trị pH kiểm tra thể bảng 3.3 hình 3.16 Bảng 3.3: Giá trị BOD5, COD, tinh bột, pH nước thải giàu tinh bột sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn Hàm lượng Tỷ lệ chế phẩm BOD5 xạ khuẩn (%) (mg/l) Control 5600a±163 18720ab±216 32,3ac±2,7 3,2ad±0,6 0,5% 2150b±204 9544bb±283 22,2bc±3,1 6,0bd±0,5 1,0% 2210b±82 8640cb±283 20,7bc±3,0 6,7bd±0,7 2,0% 2010b±82 9600bb±82 19,9bc±3,2 6,9bd±0,8 COD (mg/l) tinh bột tương Giá trị pH đối (mg/l) Sau thời gian xử lý với chế phẩm xạ khuẩn, kết cho thấy giá trị BOD5, COD, tinh bột giảm mạnh Giá trị BOD5 giảm 61,6-65,1%, giá trị COD giảm 48,7-53,8%, hàm lượng tinh bột tương đối cho thấy giảm 31,1-38,4% sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ khác Sự thay đổi giá trị khơng có khác biệt nhiều xử lý nước thải giàu tinh bột với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn 0,5%, 1,0%, 2,0% Các tiêu BOD5, COD giảm thể nhu cầu oxy sinh học oxy hóa học cần thiết để oxy hóa lượng chất hữu hịa tan nước thải giàu tinh bột giảm, điều cho thấy chế phẩm xạ khuẩn có hoạt tính amylase cao tham gia mạnh mẽ vào việc chuyển hóa chất hữu có nước thải này, tương tự nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces indiaensis ACT Streptomyces hygroscopicus ACT 14 để xử lý nước thải từ nhà máy sữa với việc giảm giá trị BOD5 COD tương ứng 56,37-59,95% 42 51,53% 55,32% sau 10 ngày xử lý [35] thấp nghiên cứu xử lý nước thải xạ khuẩn Wael N Hozzein cộng (2012) với việc giảm giá trị BOD5 COD tương ứng 68,1-95,4% 47,7-84,7% [36], nghiên cứu More cộng (2001) với giảm COD 70-80% [37] Ngoài ra, giá trị pH nước thải ban đầu từ 3,2 dần điều chỉnh tăng mức acid yếu (pH 6,0) gần trung tính (pH 6,9) xử lý với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác Sự điều chỉnh giá trị pH mức cần ghi nhận nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn để xử lý nước thải Amany G Madkour cộng (2019) với giá trị pH điều chỉnh từ pH 9,32 thành pH 8,283 [38] Bên cạnh đó, kết hàm lượng tinh bột tương đối nước thải giảm chứng minh khả chuyển hóa hợp chất hữu để phục vụ cho sinh trưởng phát triển xạ khuẩn, giảm thiểu chất hữu gây ô nhiễm nước thải Ngồi ra, kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể nghiệm thức bổ sung tỉ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác (0,5%-2,0%) (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) lên thay đổi giá trị BOD5, tinh bột pH nước thải sau xử lý Do đó, với kết thu nhận cho thấy hiệu tích cực đối tượng vi sinh vật việc xử lý nước thải giàu tinh bột Hình 3.16 Các tiêu nước thải giàu tinh bột sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn (A) Chỉ tiêu BOD5 20C; (B) Chỉ tiêu COD 20C; (C) Sự thay đổi hàm lượng tinh bột (D) Sự thay đổi giá trị pH sau xử lý chế phẩm xạ khuẩn 43 Ngoài ra, ảnh hưởng nước thải giàu tinh bột xử lý với chế phẩm xạ khuẩn lên phát triển hạt đậu xanh kiểm tra để đánh giá tác động lên sinh trưởng sinh vật Nước thải từ nhiều nguồn khác thải môi trường, thấm vào đất, mạch nước ngầm, vào ao, hồ, sông, suối ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển nhiều loài sinh vật khác Để đánh giá hiệu xử lý nước thải giàu tinh bột chế phẩm xạ khuẩn, tiến hành nuôi ủ hạt đậu xanh quan sát phát triển chúng tưới nước thải không xử lý, nước thải xử lý với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác 0,5%, 1,0%, 2,0%, mẫu tưới nước cất nghiệm thức đối chứng dương Sau ngày nuôi ủ, kết phát triển hạt đậu xanh quan sát thấy thể hình 3.17 Hình 3.17: Đặc điểm phát triển hạt đậu xanh tưới nước thải sản xuất bún sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn Kết quan sát phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải xử lý chế phẩm xạ khuẩn cho kết tốt cách rõ rệt không xử lý với xạ khuẩn Sự phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải không xử lý với chế phẩm xạ khuẩn với thân ngắn, cong, rễ ngắn, phần lớn mầm bị nhiễm khuẩn, thối nhũn Quan sát phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải xử lý với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ 1,0% 2,0% cho thấy thân dài xấp xỉ mẫu đối chứng (75%-100% chiều dài thân so với đối chứng), nhiễm khuẩn thối nhũn bề mặt mầm giảm đáng kể với số lượng diện tích thối nhũn bề mặt giảm (1 cây/13 bị thối nhũn) Mặc dù phát triển hạt đậu xanh khơng hồn tồn tương tự đối chứng kết xác nhận hiệu xử lý nước thải giàu tinh bột chế phẩm xạ khuẩn Việc sản sinh chất trao đổi thứ cấp có khả ức chế phát triển vi khuẩn xạ khuẩn quan sát thấy nhiều nghiên cứu khác nhau, ứng dụng sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn, giảm thiểu tượng nhiễm khuẩn thối nhũn bề mặt 44 ... khác chủng xạ khuẩn môi trường Gause I 3.2 Tuyển chọn xạ khuẩn có khả sinh enzyme amylase ngoại bào Các chủng xạ khuẩn sau phân lập tiến hành khảo sát khả sản sinh amylase ngoại bào dựa phân hủy... khoảng pH tối ưu 8,5-11, nhiên hoạt tính enzyme từ RBXK3 cao 10.000 lần so với hoạt tính amylase từ chủng xạ khuẩn [27] Như vậy, enzyme ngoại bào amylase chủng xạ khuẩn RBXK3 cho thấy điều kiện phản... Căn vào vòng phân giải tinh bột đường kính khuẩn lạc, hoạt tính amylase chủng xạ khuẩn xác định sơ thể hình 3.2, 3.3 bảng 3.2 Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn sau 10 ngày ni cấy Xạ khuẩn