Định danh phân tử và khảo sát đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus gây viêm họng cấp ở người.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẢN Streptococcus GÂY VIÊM HỌNG CẤP Ở NGƯỜI Sinh viên thực : Nguyễn Thị Kim Thuy Mà số sinh viên : 1411529374 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Giang cẩm Tú TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TÁT THÀNH CỘNG HỊA XÀ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CỊNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Nguyền Thị Kim Thuy MSSV: 1411529374 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 14DSH02 Đầu đề luận văn: Định danh phân tử khảo sát đặc tính kháng kháng sinh Streptococcus gây viêm họng cấp người Mục tiêu Phân lập so dòng Streptococcus Định danh phân tử, xây dựng phát sinh lồi cùa số dịng Streptococcus vừa phân lập Khảo sát đặc tính kháng kháng sinh số dịng Streptococcus với loại kháng sinh thơng dụng phát đo điều trị kháng sinh Việt Nam Nội dung: Phân lập vi khuấn Streptococcus từ mẫu bệnh phẩm Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Giải trình tự gen 16S rRNA số chủng phân lập Xây dựng phát sinh loài số chủng Streptococcus Khảo sát đặc tính kháng kháng sinh so dịng Streptococcus với loại kháng sinh: Amoxicillin, Cephalexin, Clindamycin, Azithromycin Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dẫn chính: ThS Giang cẩm Tú Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng nănứO Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẲN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Từ lúc học tập giảng đường đại học đến nay, nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm cùa Q thầy cơ, gia đình bạn bè Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu trường Đại học Nguyền Tất Thành Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học hồ trợ, tạo điều kiện cho tơi có mơi trường học tập tốt hiệu Với biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Giang cấm Tú TS Thân Văn Thái; cô thầy dành thời gian, công sức, tận tâm dạy bảo, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ góp ý cho tơi lời khun bo ích kiến thức chuyên môn khoảng thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận Con xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành với ba mẹ - người sinh ra, nuôi dưỡng, dạy dỗ nên người, ln bên hồn cảnh, ln động viên, ủng hộ cho điều tốt Ba mẹ điếm tựa vừng cho an tâm suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè lóp đà hồ trợ, động viên, chia sẻ với tơi q trình học tập làm khóa luận Nguyễn Thị Kim Thuy Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tong quan bệnh viêm họng cấp 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Nguyên nhân 1.1.3 Triệu chứng 1.1.4 Chẩn đoán xác định 1.1.5 Tiến triển biến chứng 1.1.6 Phòng bệnh 1.2 Tông quan vê Streptococcus 1.2.1 Lịch sử xếp loại 1.2.2 Đặc điêm sinh học 1.2.3 Cấu trúc kháng nguyên 1.2.4 Các enzyme độc tố 1.2.5 Một số chủng liên cầu thường gặp người 1.3 Phương pháp PCR 1.3.1 Khái niệm ii 1.3.2 Quy trình 1.3.3 Thành phần phản ứng 1.4 Vài nét gen 16S rRNA 1.5 Kỳ thuật giải trình tự gen 10 1.6 Xây dựng phát sinh loài 11 1.7 Kháng sinh đồ 11 1.7.1 Khái niệm 11 1.7.2 Kỳ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán 11 1.7.3 Kỳ thuật kháng sinh đồ định lượng 12 1.8 Tình hình nghiên cứu Streptococcus 12 1.8.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 1.8.2 Tình hình nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17 2.1 Noi thực 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Vật liêu nghiên cứu 17 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 17 2.3.2 Các môi trường sử dụng 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy chủng Streptococcus 20 2.4.2 Nuôi tăng sinh mầu 21 2.4.3 Nhuộm Gram 21 2.4.4 Phương pháp bảo quản mầu 21 2.4.5 Phương pháp tách chiết DNA 22 2.4.6 Phương pháp PCR 22 iii 1A.1 Phương pháp điện di 23 2.4.8 Phân tích trình tự xây dựng phát sinh loài 23 2.4.9 Kháng sinh đồ 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Ket nuôi cay Streptococcus 25 3.1.1 Ket nuôi cấy phân lập Streptococcus môi trường thạch 25 3.1.2 Ket nuôi tăng sinh Streptococcus môi trường lỏng 27 3.2 Ket nhuộm Gram 27 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR 28 3.4 Ket giải trình tự sản phẩm PCR 29 3.5 Ket xây dựng phát sinh loài 30 3.6 Ket thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy khuếch tán 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 37 IV TÓM TẤT Streptococcus nguyên nhân gây nhiễm trùng đường hơ hấp cấp tính Tác nhân gây bệnh dần đến bệnh xâm lấn nghiêm trọng, bao gồm viêm họng viêm da mủ, đế lại di chứng sau liên cầu khuẩn tự miền, sốt thấp khớp viêm cầu thận Do đó, đề tài “Định danh phân tử khảo sát đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus gây viêm họng cấp người” thực từ tháng 2/2019 đến tháng 8/2019 Khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành Đe tài có nội dung: - Phân lập vi khuẩn Streptococcus từ mầu bệnh phẩm - Nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào vi khuẩn - Giải trình tự gen 16S rRNA số chủng Streptococcus phân lập - Xây dựng phát sinh loài số chùng Streptococcus - Khảo sát đặc tính kháng kháng sinh cùa số chùng Streptococcus với loại kháng sinh: Amoxicillin, Cephalexin, Clindamycin, Azithromycin Những kết đạt sau sáu tháng nghiên cứu: - Từ 50 mẫu bệnh phẩm sau nuôi cấy phân lập 125 chủng vi khuẩn Trong số 125 chủng tiến hành nhuộm Gram quan sát hình thái thu 44/125 chủng có dạng liên cầu, 38/44 chủng vi khuẩn Gram (+), 6/44 chủng vi khuẩn Gram (-) chứng tỏ 38/44 chủng có khả chủng Streptococcus - Từ 38 chủng liên cầu Gram dương, chọn ngầu nhiên chùng tiến hành tách chiết DNA, chạy PCR giải trình tự gen 16S rRNA (04 mẫu), kết giải trình tự nhận tiến hành phân tích phát sinh lồi gen 16S rRNA cho thấy chủng vi khuấn nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Streptococcus chia sẻ mức độ tương đồng gần với chùng mitis, s oralis, s pseudopneutnonỉae - Ket khảo sát đặc tính kháng kháng sinh cho thấy chủng 155, 157, 158, 159 kháng với loại kháng sinh: Amoxicillin, Azithromycin, Cephalexin nhạy cảm với Clindamycin V SUMMARY Streptococcus is one of the main causes of acute respiratory infection The causative agent can lead to serious invasive diseases, including sore throat and pyoderma, and leave sequelae of autoimmune streptococcal disease, such as rheumatic fever and glomerulonephritis Therefore, the topic "Molecular identification and survey of antibiotic resistance properties of Streptococcus bacteria causing acute pharyngitis in humans" was conducted from February 2019 to August 2019 in the School of Biotechnology Nguyen Tat Thanh University The topic has contents: - Isolate Streptococcus bacteria from patient samples - Stain Gram and observe bacterial morphology - Sequencing gen 16S rRNA some isolated Streptococcus strains - Building phylogenetic trees of some Streptococcus strains - Survey antibiotic resistance of s ome Streptococcus strains with types of antibiotics: Amoxicillin, Cephalexin, Clindamycin, Azithromycin Results achieved after six months of research: - From 50 samples after culture, 125 bacterial strains were isolated Out of 125 strains, Gram stained and observed morphology 44/125 strains of streptococci of which 38/44 strains were Gram (+), 6/44 were Gram (-) proving that 38/44 strains are likely to be Streptococcus strains - From 38 Gram - positive streptococcal strains, randomly selected strains were conducted for DNA extraction, PCR run and gen 16S rRNA sequencing (04 samples) see the bacterial strains studied in the group Streptococcus and share the closest similarity with strains of s mitis, s oralis, s pseudopneumoniae - Survey results of antibiotic resistance showed that all strains 155, 157, 158, 159 are resistant to types of antibiotics: Amoxicillin, Azithromycin, Cephalexin and sensitive to Clindamycin vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình 1.1 s pyogenes đĩa thạch máu cừu, sau 24 ù điều kiện hiếu khí Hình 2.1 Chu trình nhiệt cùa phản ứng PCR 23 Hình 3.1 Các dạng khuẩn lạc thu nhận từ mầu bệnh phàm 26 Hình 3.2 Hình tăng sinh sau 24 27 Hình 3.3 Hình nhuộm Gram vi khuấn 28 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi 27 F 1492 R 29 Hình 3.5 Ket đọc trình tự gen phần mem BioEdit 29 Hình 3.6 Cây phát sinh lồi gen 16S rRNA chủng Streptococcus nghiên cứu với chủng tham chiếu 30 Hình 3.7 Kháng sinh đồ cùa mầu đối chứng Staphylococcus aureus NRRL B - 313 31 Hình 3.8 Kháng sinh đồ cùa chủng giải trình tự 32 vii DANH MỤC • BẢNG BIÉU Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng 17 Bảng 2.2 Danh sách dụng cụ sử dụng 18 Bảng 2.3 Danh sách hóa chất sử dụng 18 Bảng 2.4 Thành phần môi trường BHI 19 Bảng 2.5 Thành phần môi trường NA 19 Bảng 2.6 Thang diêm Maclssax - Centor strep 20 Bảng 2.7 Thành phần PCR 22 Bảng 3.1 Hình thái số lượng khuẩn lạc 25 viii ... văn: Định danh phân tử khảo sát đặc tính kháng kháng sinh Streptococcus gây vi? ?m họng cấp người Mục tiêu Phân lập so dòng Streptococcus Định danh phân tử, xây dựng phát sinh loài cùa số dòng Streptococcus. .. kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus gây vi? ?m họng cấp người” thực nhằm hiểu rõ chủng vi khuẩn gây bệnh đặc tính kháng thuốc chúng X Mục tiêu đề tài: Phân lập, định danh phân tử khảo sát đặc tính. .. khớp vi? ?m cầu thận Do đó, đề tài ? ?Định danh phân tử khảo sát đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus gây vi? ?m họng cấp người” thực từ tháng 2/2019 đến tháng 8/2019 Khoa Công nghệ Sinh