Phân lập và xác định mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá nước ngọt ở địa bàn hà nội

Khóa luận tốt nghiệp K18 Bùi Thị Thùy Linh - lóp 1101 LỜI CẢM ON Trước hết em xin gửi lời câm ơn chân thành đến toàn thể thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội trang bị cho em kiến thức kĩ để em hồn thành khóa luận Em xin bày tị lịng kính trọng biết ơn chân thành đến TS Phạm Thị Tâm - khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mớ Hà Nội giúp đỡ tận tình hướng dẫn em kiến thức phương pháp ngiên cứu q trình thực khóa luận Cuối em xin gửi lời căm ơn tới gia đình, anh chị bạn - người động viên quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận Trong q trình ngiên cứu thực đề tài thân có nhiều cố gắng xong khơng tránh sai xót nên em mong nhận đóng , * Thir vieri Viện Đại nọc Mở Ha Nại góp cùa thây bạn lình vực nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên thực BÙITHỊTHÙY LINH Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Khóa luận tốt nghiệp K18 Bùi Thị Thùy Linh - lóp 1101 MỤC LỤC MỚ ĐẦU Phần I TÔNG QUAN TÀI LIỆU Lịch sứ phát triển nuôi trồng thủy sán 1.1 Thế giới 1.1.1 1.1.2 Tìm hiểu chung vi khuẩn Aeromonas hydrophila 1.3 1.3.2 1.4 Trong nước .4 Lịch sừ phát bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 1.2 Độc tố, gen gây bệnh, chế gây bệnh: 12 Khá kháng kháng sinh, chế kháng kháng sinh vi khuấn Aeromonas hydrophila 16 Phần II ĐÓI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 21 Đối tượng 21 2.1 Vật liệu 21 2.2 2.2.1 Thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm:, 2.2.2 Mơi trường hóa chât: : 22 ““ ■ ■ ' 2.3 I nụ yren V lệii Đại Hộc Mở Hâ Nộí 21 ' Phương pháp: 24 2.3.2 Các phàn ứng sinh hóa 25 2.3.3 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 28 2.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ: 29 2.3.5 Phàn ứng PCR : 30 PHÀN III KÉT QUÁ VÀ THÁO LUẬN 31 3.1 Phân lập vi khuấn Aeromonas hydrophila gây bệnh cá 31 3.2 : Xác định đặc tính sinh học, sinh hóa chúng vi khuẩn phân lập 32 3.2.1: 3.2.2 3.2.2.2 3.2.3 Xác định đặc tính sinh hóa cùa chủng vi khuân phân lập .32 Xác định khã gây bệnh chùng Aeromơnas hydrophila phân lập 39 Ket quã gây nhiễm cá bang độc tố Aerolysin 40 Xác định tính kháng kháng sinh chùng Aeromonas hydrophila phân lập.42 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHÁO 49 Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Khóa luận tốt nghiệp K18 Bùi Thị Thùy Linh - lóp 1101 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình la: Vi khuấn mọc Macconkey agar Hình Ib: Vi khuẩn mọc BHI agar 32 Hình Hình thái vi khuấn Aeromonas Hydrophila .34 Hình 3: Khả phân giải gelatine 35 Hình 4: Khả di động 35 Hình 5: Kết thừ KIA cúa chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 36 Hình 6: Kết thứ indol chúng vi khuẩn 37 Hình 7: Ket thứ catalase cúa vi khuẩn Aeromonas hydrophila 31 Hình 8: Kct thứ dung huyết vi khuân Aeromonas hydrophila 38 Hình 9: Khả phân giái tinh bột 38 Hình 10: Khá phân giãi casein 39 Hình 11 Cá chết gây nhiễm vi khuẩn 40 Hình 12 Hình ảnh kết tinh độc tố 41 Hình 13: Cá chết độc tố vi khuấn 42 Hình 14: Kết thử rtgiẹm kháng stalVàS cEằ VI khuấn Ằéíổrnónas hýârophila 43 Hình 15: Tách DNA tồng số 45 Hình 16: KếtquàPCR 46 Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Khóa luận tốt nghiệp K18 Bùi Thị Thùy Linh - lóp 1101 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng I Các phán ứng sinh hóa vi khuấn Aeromonas hydrophila 11 Bàng 2: Quy trình phân lập vi khuẩn Aeromonas Hydrophiỉa 24 Bàng Kết thứ sinh hóa cúa chủng vi khuấn phân lập 33 Bang Ket qua thử mức độ kháng kháng sinh cùa chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophíla 43 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila MỞ ĐẦU Ngành thủy sản Việt Nam xem ngành kinh tế mũi nhọn so với ngành kinh tế khác Ờ nước ta nghề nuôi trồng thuỷ sản nước có từ lâu đời, với nhiều đối tượng nuôi truyền thống nuôi phố biến như: cá trám có, cá trơi, cá mè, cá chép, cá rô phi, Trước người dân yếu nuôi xen ghép đối tượng theo mơ hình VAC nuôi lồng theo quy mô nhỏ đề cung cấp nguồn thực phẩm gia đình hay vùng nhị Nhưng năm gần đây, hoạt động ni trồng thuỳ sản phát triển mạnh mẽ diện rộng với quy mô lớn hơn, theo hướng sản xuất thương mại Cùng với tăng trường ngành nuôi trồng thuỳ sàn nói chung nghề ni cá nước nói riêng, dịch bệnh cá ngày gia tăng, ảnh hướng lớn đến hiệu quà kinh tế, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hường xấu tới sức khoé người tiêu dùng Có nhiều nguyên nhân gây bệnh cá, có thê virut, vi khuấn Trong đó, vi khuấn tác phân gây bệnh quan ựọng^Ịà jtrở lực chủ yếu kìm hãm phát triến mở rộng sán xuất nuối trồng thúy sân Hầu hết vi khuấn gây bệnh phần hệ vi sinh vật bình thường tồn mơi trường nước nói chung vi khuấn xem tác nhân gây bệnh thứ cấp tác nhân gây bệnh hội vật chù Trong nghiên cứu dịch bệnh cá xác định vi khuẩn gây bệnh chù yểu vi khuấn Gram âm như: Aeromonas hydrophila, A.sobria, Pseudomonas, Vibrio, Edwardsiella [28] Vi khuân Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh xuất huyết đốm đỏ, bệnh lờ loét hầu hết loài cá nuôi nước lợ với tý lệ chết cao Nguy nhiều nghiên cứu chi vi khuấn cịn có kháng nhiều loại kháng sinh như: Pennicilin, Ampicilin, Tetramycine, Streptomycin, Erythromycin [25] Van đề dặt là, cần có hiêu biết dặc tính sinh học, tính kháng kháng sinh gen kháng kháng sinh vi khuân đế đưa biện pháp ngăn ngừa tác hại chúng gây Vì vậy, tiến hành thực đề Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila tài: “ Phân lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuấn Aeromonas hydrophila gây bệnh cá nước địa bàn Hà Nội ” Mục đích để tài: Nắm dược đặc tính sinh học điền hình cùa vi khuẩn Aeromonas hydrophila: hình thái, sinh hóa, gây bệnh, tính kháng kháng sinh phát gen kháng kháng sinh Từ tạo sớ khoa học cho việc phát bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila cá lựa chọn kháng sinh thích hợp điều trị bệnh Nội dung đề tài: - Phân lập chùng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết, lờ loét cá nước địa bàn Hà Nội - Nghiên cứu đặc diêm sinh học, sinh hóa cùa chùng vi khuân phân lập được: + Đặc điểm hình thái, sinh hóa + Nghiên cứu khà nãng gây bệnh thực nghiệm cá Thư viện Viẹn t)ậi học Mở Hà Nội - Xác định mức độ kháng kháng sinh gen kháng kháng sinh cùa chúng vi khuẩn phân lập với kháng sinh nhóm p lactam Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Phần I TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản 1.1.1 Thế giói Ni trồng thủy sán coi ngành sàn xuất thực phấm có tốc độ phát triền nhanh giới, cung cấp phần lớn protein động vật cho người ngày chiếm tỷ trọng lớn tổng sản lượng thúy sãn toàn cầu Lịch sử nghề nuôi trồng thúy sàn giới khoảng 500 năm trước công ngun Trung Quốc với lồi cá ni cá chép (Cyprinus carpio) Hình thức sơ khai thu cá giống từ sông để nuôi ao vùng nước Nghề ni cá chép sau lan rộng nhiều nơi Châu Á, Trung Đông Châu Âu di dân cùa người Hoa Tuy nhiên, vào the kỷ thứ VI sau công nguyên, cá chép không phép nuôi Trung Quốc, lồi lồi cá khác Trung Quốc (cá tram cõ, cá mè hoa, mè trắng) bat đầu dược phát triên Ớ Ẩn Độ, loài cá trôi Ấn Độ ương nuôi từ kỹ XI Trong đó, lồi cá nước lợ ni loài cá măng (Chanos chanos) vào kỷ XV Indonesia Trong năm qua, sản lượng nuôi trồng thúy sán giới tăng trưởng với tốc độ vừa phải Theo báo cáo cùa FAO năm 2012, săn lượng nuôi trồng thúy sản đạt mức cao ký lục 90.4 triệu tấn, tương đương 144,4 tỷ đô la Mỹ; có 66,6 triệu thùy sản loại (137,7 tỳ đô la Mỹ) 23,8 tỳ thực vật thúy sinh nuôi(chủ yếu tảo biến), tương đương 6,4 triệu đô la Mỹ Các đối tượng ni bao gồm cá có vấy, động vật giáp xác, động vật thân mềm ếch bị sát (khơng tính cá sấu) loài thủy sàn khác phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng cùa người Năm 2013, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 70,5 triệu tấn, tăng 5,8%; đó, sản lượng lồi thực vật thúy sinh 26,1 triệu Sán lượng nuôi trồng thúy sán chiếm tý trọng ngày tăng tống sản lượng thủy sản toàn cầu (158 triệu tấn), từ 20,9% năm 1995 lên 32,4% năm 2005 40.3% năm 2010 mức cao kỷ lục 42,2% năm 2012 Châu Á chiếm tỳ trọng cao Phăn lập xác định mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn Aeromonas hydrophila tơng sản lượng ni tồn cầu 54%, châu Âu chiếm 18% châu lục cịn lại