Phân lập và khảo sát hàm lượng aloe emodin trong dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia valh, Fabaceace).pdf

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỎNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018-2019 Tên đề tài: Phân lập khảo sát hàm lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia valh, Fabaceace) Số hợp đồng: 2019.01.61/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Minh Thu Đơn vị công tác: Khoa Dược, Đại học Nguyền Tất Thành Thời gian thực hiện: 06 tháng TP Hồ Chỉ Minh, ngày 09 tháng 12 năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2018-2019 Tên đề tài: Phân lập khảo sát hàm lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp {Cassia angustifolia valh, Fabaceace) Sổ hợp đồng: 2019.01.61 /HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Minh Thu Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 06 tháng MỤC LỤC MỞ ĐẦU 28 CHƯƠNG 1: TÓNG QUAN ĐÈ TÀI 30 1.1 1.2 1.3 1.4 TÔNG QUAN VÈ THỤC VẬT HỌC 30 1.1.1 Vị trí phân loại cùa họ Fabaceae chi Cassia 30 1.1.2 Đặc diem thực vật chi Cassia 33 1.1.3 Tông quan thực vật học Phan tá diệp 33 TÔNG QUAN VÈ HÓA HỌC 34 1.2.1 Thành phan hóa học cùa chi Cassia 34 1.2.2 Thành phan hóa học cùa Phan tả diệp 35 TÔNG QUAN VÈ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 38 1.3.1 Tác dụng dược lý chi Cassia 38 1.3.2 Tác dụng dược lý cùa Cassia angustifolia Valh 38 TỎNG QUAN VÈ ALOE EMODIN 39 1.4.1 Tinh chất hóa lý 39 1.4.2 Tính chất dược lý 40 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 41 2.1 CH1ÉTXUẤT 41 2.2 PHÂN LẬP VÀ TINH CHÉ 41 2.3 2.4 2.5 2.2.1 Sắc ký cột chân không (VLC) 41 2.2.2 Phương pháp tinh che phân đoạn 42 XÁC ĐỊNH CÂU TRÚC CÚA CÁC HỢP CHÁT PHẢN LẬP ĐƯỢC 42 2.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết 42 2.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 42 XÂY DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALOE EMODIN BÂNG PHUONG PHÁP SÂC KÝ LÓNG HIỆU NÂNG CAO 43 2.4.1 Chuẩn bị mầu đế kháo sát cho quy trinh 43 2.4.2 Kháo sát điều kiện tiến hành HPLC 44 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LUỌNG ALOE EMODIN 44 2.5.1 Tính tuyến tính 44 2.5.2 Tính phù hợp hệ thống 44 2.5.3 Tinh chọn lọc (tính đặc hiệu) 45 2.5.4 Độ lặp lại 45 2.5.5 Độ 46 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 PHÂN TÍCH Sơ Bộ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÙA PHAN TA DIỆP 47 3.2 CHIÉTXUẤT 47 3.3 PHÂN LẬP CÁC CHÁT BẦNG SẮC KÝ 48 3.4 3.5 3.3.1 Tách phân đoạn bang sắc ký cột chân không (VLC) 48 3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết AI HPLC 50 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT AI 52 3.4.1 Phổ uv cùa hợp chất AI 52 3.4.2 Phổ IR cùa hợp chất AI 52 3.4.3 Phổ MS hợp chất AI 53 3.4.4 Phổ NMR cũa hợp chất AI 53 XÂY DựNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG aloe emodin phan tả diệp PHUONG PHÁP HPLC 59 3.5.1 Kháo sát điều kiện HPLC 59 3.5.2 Quy trinh định lượng aloe emodin Phan tã diệp 61 3.5.3 Đánh giá quy trình định lượng aloe emodin 62 3.5.4 Sơ đánh giá hàm lượng aloe emodin Phan tả diệp 66 CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIÉN 68 4.1 KÉT LUẬN: 68 4.2 HƯỚNG PHÁT TRIÊN: 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Bảng 3.1 Ket phân tích sơ thành phần hóa học củalá Phan tả diệp 47 Bảng 3.2 Kết kiểm tra độ tinh khiết AI HPLC 52 Bảng 3.3 Bảng so sánh 'H-NMR 13C-NMR so vớialoe emodin 55 Bảng 3.4 Số liệu đường tuyến tính cùa aloe emodin 62 Bảng 3.5 Ket khảo sát tính tương thích hệ thống phương pháp aloe emodin 63 Bảng 3.6 Ket khảo sát độ lặp lại aloe emodin mẫu thử 66 Bảng 3.7 Tóm tắt kết thẩm định quy trình định lượng 66 Hình 3.1 Sắc ký đồ kiểm tra ống hứng từ 55 - 63quacột VLC 49 Hình 3.2 Sắc ký đồ kiểm tra tủa A B saukhi rửa vớiCHCh 50 Hình 3.3 Sắc ký đồ (HPLC) họp chất AI 51 Hình 3.4 Phổ hấp thu uv cùa hợp chất AI 51 Hình 3.5 Phổ 3D họp chất AI 51 Hình 3.6 Độ tinh khiết pic AI 52 Hình 3.7 Phổ IR họp chất AI 53 Hình 3.8 Phổ MS (ES‘) họp chất AI 53 Hình 3.9 Cấu trúc hoá học cùa aloe emodin (họp chất Al) 56 Hình 3.10 Phổ 'H-NMRcủahọp chất Al (CDC13, 500 MHz) 56 Hình 3.11 Phổ 13C-NMR hợp chất Al (CDC13, 125 MHz) 57 Hình 3.12 Phổ DEPT hợp chất Al (CDC13, 125 MHz) 57 Hình 3.13 Phổ HMBC hợp chất Al (CDC13, 500MHz) 58 Hình 3.14 Phổ HSQC hợp chất Al (CDC13, 500 MHz) 58 Hình 3.15 Sắc ký đồ mầu chuẩn aloe emodin 59 Hình 3.16 Pho hấp thu ƯV aloe emodin 59 Hình 3.17 Sắc ký đồ mầu thử với pha động MeOH - acid phosphoric 0.1% (70 :30), (1 ml/phút) 60 Hình 3.18 Ket khảo sát độ tinh khiết pic aloe emodin, pha động MeOH -acid phosphoric 0.1 % (70:30), (1 ml/phút) 60 Hình 3.19 Sắc ký đồ mầu thử với pha động MeOH - acid phosphoric 0,1% (60:40), (1 ml/phút) 61 Hình 3.20 Ket khảo sát độ tinh khiết pic aloe emodin, pha động MeOH - acid phosphoric 0,1% (60:40), (1 ml/phút) 61 Hình 3.21 Đuờng biếu diễn dện tích pic theo nồng độ aloe emodin 62 Hình 3.22 sắc ký đồ mầu trắng 63 Hình 3.23 sắc ký đồ mầu chuẩn aloe emodin 64 Hình 3.24 sắc ký đồ mầu thử 64 Hình 3.25 sắc ký đồ mầu thử thêm chuan aloe emodin 64 Hình 3.26 Pho uv cùa aloe emodin mầu chuẩn 65 Hình 3.27 Pho uv cùa aloe emodin mẫu thử .65 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao anthraquinon toàn phần từ cao cồn Phan tả diệp 48 TÓM TẮT KỂT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sán phẩm đăng ký thuyết minh - Xây dựng quy trình chiết xuất aloe - Xây dựng quy trình chiết xuất aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Phân lập xác định cấu trúc hợp - Phân lập xác định cấu trúc hợp chat aloe emodin từ dược liệu Phan tả chat aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp diệp - Xây dựng quy trình định lượng sơ - Xây dựng quy trình định lượng sơ chất đánh dấu aloe emodin có dược chất đánh dấu aloe emodin có dược liệu Phan tả diệp liệu Phan tả diệp Thời gian đăng ký : từ 04/2019 đến 10/2019 Thời gian nộp báo cáo: ngày 04/12/2019 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, giá thuốc nhập khấu tăng cao nhiều lý do, việc tìm kiếm nguồn duợc liệu nước để thay phần thuốc nhập khấu từ nước khác yêu cầu cấp thiết cho ngành Dược nhà nghiên cứu Việt Nam Nước ta có ưu điểm nước cận nhiệt đới phong phú chủng loài thực vật, với nhiều loại thuốc quý tiếng giới, bên cạnh đó, việc du nhập loại thuốc từ nước đem lại hiệu định Tuy chưa trồng phổ biến Việt Nam, Phan tả diệp Cassia angustifolia, họ Đậu (Fabaceae) loại có giá trị y dược cao nhà khoa học giới nghiên cứu từ lâu Đoi với nước ta dường lồi cịn mẻ, Phan tả diệp đem Tuy Hòa, Phú Yên bước đầu có nghiên cứu nước loại Các cơng trình nghiên cứu Phan tả diệp tập trung nhiều vào cơng dụng nhóm nhuận tràng anthraglycosid giúp mạnh trình tiết ruột đe đào thải chất cặn bã, độc hại ton đọng gây độc cho đường tiêu hóa, hạn chế sinh sơi nẩy nở lồi sinh vật đường ruột có hại, loại thuốc xổ giun hữu hiệu Hiện nay, phương pháp xây dựng để định lượng Phan tả diệp chủ yếu sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng phổ biến nhiều lý do: độ nhạy cao, khả định lượng đồng thời nhiều chất tốt, thích hợp tách hợp chất không bay chịu nhiệt Mục tiêu nghiên cứu Nhằm tăng cường hiệu chăm sóc sức khoẻ người dân góp phần vào công tác quản lý, đánh giá chất lượng thuốc có thành phần Phan tả diệp, đề tài “Phân lập khảo sát hàm lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia Valh, Fabaceace)” thực với mục tiêu cụ the sau: - Xây dựng quy trình chiết xuất aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Phân lập xác định cấu trúc họp chat aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Xây dựng quy trình định lượng sơ chất đánh dấu aloe emodin có dược liệu Phan tả diệp Đối tượng nghiên cứu đề tài: Nguyên liệu nghiên cứu cùa Phan tả diệp thu hái Sapa (cây di thực Việt Nam) vào tháng 03 năm 2019 Lá rửa sạch, phơi, sấy khơ, sau nghiền thành bột thô, rây qua rây 500 pm; cho vào túi nylon bảo quản nơi khơ, thống mát NTTU-KHCN-05-TMĐT Nguyên vật liệu J Chất chuẩn, hóa chất, dung mơi Dung mơi, hóa chat: n-hexan, ethyl acetat, cloroform, methanol, dùng loại AR Trung Ọuốc sản xuất Các dung môi (methanol, nước, acid phosphoric) loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck), dùng quy trình định lượng Silica gel 60 (0.040 - 0.063 mm) Bản mỏng silica gel F254 (Merck) Thuốc thử Vanillin-sulfuric (VS) Một số hóa chất, thuốc thử khác dùng phịng thí nghiệm Hóa phân tích - Kiếm nghiệm V Trang thiết bị STT Thiết bị Xuất xứ Mã hiệu Buồng soi ƯV Vilber Lourmat CN-6 Cân kỳ thuật Sartorius TE412 Cân phân tích số Sartorius Practum 224 - s Cân phân tích số Sartorius CP225D Cột HPLCC18 GL Sciences InertSustain Hệ thống HPLC - PDA Waters Alliance 2695 XE Màng lọc 0.45 pm Sartorius Máy cô quay chân không Buchi Ri 10S Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AVANCE 500 MHz 10 Máy LC - MS Shimadzu 11 Máy quang phổ IR Shimadzu IRAffinity - s 12 Máy quang phố uv - Vis Shimadzu A1084348 13 Máy siêu âm Elma T840 DH Và sô dụng cụ thông thường phịng thí nghiệm NTTU-KHCN-05-TMĐT CHƯƠNG 1: TĨNG QUAN ĐÈ TÀI 1.1 TÓNG QUAN VỀ THỤC VẬT HỌC 1.1.1 VỊ trí phân loại họ Fabaceae chi Cassia Họ Đậu (Fabaceae) họ vần nhiều điểm chưa thống giừa nhà khoa học - Theo Takhtajan (2009), phân họ Đậu (Faboideae), phân họ Vang (Caesalpinioideae) phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) phân họ thuộc họ Đậu (Fabaceae) Theo Cronquist (1998), Fabaceae, Caesalpinioideae Mimosoideae lại họ riêng biệt thuộc Đậu (Fabales) ... xuất aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Phân lập xác định cấu trúc họp chat aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Xây dựng quy trình định lượng sơ chất đánh dấu aloe emodin có dược liệu Phan. .. dân góp phần vào cơng tác quản lý, đánh giá chất lượng thuốc có thành phần Phan tả diệp, đề tài ? ?Phân lập khảo sát hàm lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia Valh, Fabaceace)”... xuất aloe - Xây dựng quy trình chiết xuất aloe emodin từ dược liệu Phan tả diệp emodin từ dược liệu Phan tả diệp - Phân lập xác định cấu trúc hợp - Phân lập xác định cấu trúc hợp chat aloe emodin