Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật, có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Từ 25 mẫu rễ và thân cây lúa gạo đỏ giống Tàu Cúc thu được ở huyện Tuy An tỉnh Phú Yên phân lập được hai mươi dòng vi khuẩn trên môi trường Nfb và RMR tỉ lệ 10:10. Qua các phép thử sinh hóa thì tất cả các dòng vi khuẩn này đều thỏa mãn những đặc tính của vi khuẩn nội sinh, phù hợp vớinhiều công trình nghiên cứu trước đây. Kết quả cho thấy các dòng AN6, AN9, AN15 và AN17 có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA tốt nhất. Các dòng vi khuẩn đã phân lập đều được xác định là vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR16S rRNA. Trong đó kết quả giải trình tự cho thấy đoạn DNA của các dòng AN6, AN9, AN15 và AN17 có tỉ lệ đồng hình 99% lần lượt với trình tự DNA của các dòng Pseudomonas hibiscicola, Enterobacter cloacae, Acinetobacter radioresistens, Bacillus sp..
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Vi khuẩn nội sinh tồn tại trong hầu hết các loài thực vật đã được nghiên cứu, chúng sinh sống trong mô cây chủ và thiết lập nhiều mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, hỗ sinh và hội sinh Các giống vi khuẩn nội sinh rất đa dạng, bao gồm Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum và Azotobacter.
Hầu hết vi khuẩn nội sinh có nguồn gốc từ vùng rễ, nhưng một số có thể được truyền qua hạt giống Chúng không chỉ thúc đẩy sự tăng trưởng và năng suất cây trồng mà còn đóng vai trò là tác nhân kiểm soát sinh học Vi khuẩn nội sinh sản xuất các sản phẩm tự nhiên, có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, y tế và các ngành công nghiệp khác Ngoài ra, chúng còn có khả năng loại bỏ chất gây ô nhiễm đất và cải tạo đất thông qua việc hòa tan lân khó tan và cố định đạm.
Khai thác vi khuẩn nội sinh không chỉ thúc đẩy sức khỏe thực vật mà còn đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp bền vững cho thực phẩm và cây trồng Hiểu rõ các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cùng với các phương pháp nghiên cứu và ứng dụng sẽ là yếu tố cần thiết để tối ưu hóa tiềm năng và hiệu quả trong các ứng dụng thực tiễn trong tương lai.
Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh từ cây lúa nương trồng tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên Mục tiêu là chọn lọc một số dòng vi khuẩn có đặc tính ưu việt để ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp, nhằm nâng cao hiệu quả canh tác và phát triển bền vững.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Vị trí địa lý huyện Tuy An
Huyện Tuy An, thuộc tỉnh Phú Yên, nằm ở vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, có vị trí ven biển với phía bắc giáp thị xã Sông Cầu và Đồng Xuân, phía nam giáp thành phố Tuy Hòa, phía tây giáp huyện Sơn Hòa, và phía đông là biển Đông Địa hình Tuy An đa dạng, bao gồm đồi núi, đồng bằng và biển.
Tuy An, tọa lạc ở phía Đông dãy Trường Sơn, là nơi các nhánh của dãy núi này đâm ra biển Huyện có địa hình thấp dần từ Tây sang Đông, với đỉnh cao nhất là núi Hòn Chuông, đạt độ cao 500 m Nhiều xã trong khu vực có địa hình núi non hiểm trở, khiến giao thông đi lại gặp nhiều khó khăn.
Huyện An Xuân, An Lĩnh, An Thọ có tổng diện tích 435 km², trong đó đất nông nghiệp chiếm 45%, đất đồi núi chiếm 26,5% và đất lâm nghiệp chiếm 12,6% tổng diện tích đất tự nhiên.
Sơ lược về cây lúa
(*Nguồn: http://phanbonsumo.com.vn/chi-tiet/Kinh-nghiem-cham-soc-lua-mua 2-xanh-2-vang-.48.html, ngày 23/07/2013)
Chi Lúa (Oryza) thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) gồm 15-20 loài, xuất hiện chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và châu Phi Chi này bao gồm cả các loài sống lâu năm và một năm.
Cây lúa non, hay còn gọi là mạ, được gieo sau khi các hạt thóc nảy mầm Hạt có thể được gieo thẳng vào ruộng lúa đã được cày bừa kỹ hoặc gieo trên rượu riêng để tăng sức sống Sau một thời gian, mạ sẽ được nhổ và cấy vào ruộng lúa chính Khi trưởng thành, cây lúa có chiều cao từ 1-2 m, với lá mỏng, hẹp có chiều rộng từ 2-2,5 cm và dài từ 50-100 cm Trên cây lúa, các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành cụm hoa phân nhánh, có hình dáng cong hoặc rủ xuống, dài từ 30-50 cm.
Sản phẩm chính thu được từ cây lúa là thóc, có kích thước nhỏ, thô cứng, dài từ 5-12 mm và dày từ 2-3 mm Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngoài, sản phẩm chính là gạo, kèm theo các phụ phẩm như cám và trấu Gạo là nguồn lương thực chủ yếu cho hơn một nửa dân số thế giới, chủ yếu tập trung ở châu Á và châu Mỹ La tinh Loài lúa tẻ (Oryza sativa) đóng góp 20% tổng sản lượng ngũ cốc toàn cầu, khẳng định tầm quan trọng của cây lương thực này trong việc đảm bảo an ninh lương thực.
Lúa nương là loại lúa được trồng trên các triền đất khô, thường thấy ở các vùng núi cao, nơi ít nước Tại huyện Tuy An, các giống lúa gạo đỏ có khả năng chịu hạn tốt và thích nghi với đất nghèo dinh dưỡng của địa hình đồi núi Phú Yên Theo báo cáo từ Công ty cổ phần Giám định và Khử trùng FCC, các giống lúa gạo đỏ Tuy An chứa hàm lượng protein, canxi, kali, phospho và vitamin B1 cao hơn so với giống lúa cạn LC93, cho thấy đây là nguồn gen quý cần được bảo vệ.
Hoạt động sản xuất lúa tại huyện Tuy An chủ yếu diễn ra ở hai xã An Hòa và An Hiệp, với các giống lúa chủ lực là Tàu cúc, Bát quạt và Đuôi nai Giống lúa Tàu cúc được người dân ưa chuộng nhờ thời gian sinh trưởng ngắn và năng suất cao, trong khi hai giống Bát quạt và Đuôi nai có thời gian sinh trưởng dài hơn, dẫn đến số hộ sản xuất các giống này ngày càng giảm.
Vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn cư trú trong các mô sống của cây chủ mà không làm tổn hại đến cây (Misaghi et al., 1990)
Vi khuẩn nội sinh xuất hiện phổ biến trong hầu hết các loài thực vật và có sự đa dạng phong phú về chủng loại, chủ yếu thuộc về chi vi khuẩn đất.
Vi khuẩn nội sinh đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển và sức khỏe của cây trồng Chúng hỗ trợ cây trong việc sử dụng làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học và tăng cường khả năng hấp thụ carbon thông qua sản xuất sinh khối.
Vi khuẩn nội sinh có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật thông qua việc sản xuất phytohormones và các enzyme quan trọng trong quá trình trao đổi chất, như etylen, ACC deaminase, auxin, IAA, acetoin, 2,3-butanediol và cytokinin Ngoài ra, chúng còn cải thiện sự phát triển của thực vật bằng cách cố định đạm và cung cấp khoáng chất như phosphate.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng sản sinh các hợp chất kháng mầm bệnh như vi khuẩn và nấm Đồng thời, chúng cũng có khả năng phân hủy các hóa chất độc hại được sử dụng trong nông nghiệp.
2.3.2 Nguồn gốc và cách xâm nhập
Nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh chưa được khẳng định Tuy nhiên, nhiều kết quả nghiên cứu cho rằng vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất
Vi khuẩn nội sinh có khả năng xâm nhập vào mô thực vật qua nhiều con đường, bao gồm việc bám vào bề mặt rễ và thâm nhập vào rễ chính hoặc rễ bên qua lông hút, hoặc di chuyển giữa các tế bào nhu mô và biểu bì rễ Một số loài vi khuẩn nội sinh phổ biến như Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Derxia, các loài trong họ Enterobacteriaeae (như Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter và Paenibacillus Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua khí khổng hoặc các vị trí bị tổn thương trên lá.
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có hình dạng que ngắn, kích thước từ 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4-3,7μm chiều dài Chúng có sự phân bố sinh thái rộng lớn và liên quan chặt chẽ đến đa dạng cây trồng (van Berkum và Bohlool, 1980).
Một số loài phổ biến thường xuất hiện ở rễ và thân lúa và hoa màu như:
Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum amazonense, Azospirillum irakens
Vi khuẩn Herbaspirillum, thuộc nhóm β – Proteobacteria, là loại vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều loại cây không thuộc họ đậu, đặc biệt là các cây họ lúa có giá trị kinh tế.
Các loài vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được phát hiện ở nhiều loại cây trồng như bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng Ngoài ra, chúng cũng xuất hiện ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm và chuối.
Herbaspirillum là nhóm vi khuẩn nội sinh bắt buộc, chủ yếu tồn tại trong mô thực vật, đặc biệt là ở vùng rễ, nơi chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986) Ngoài ra, chúng cũng có thể phát tán đến các vùng khác như thân và lá (Barraquio et al., 1997).
Chi Azotobacter là nhóm vi khuẩn hiếu khí, có hình dạng bầu dục hoặc cầu, nổi bật với khả năng di động và sản xuất lượng lớn chất nhờn Chúng đóng vai trò quan trọng trong chu trình nitơ tự nhiên bằng cách cố định nitơ từ khí quyển và giải phóng ion amoni vào đất Azotobacter chroococcum, đại diện đầu tiên của chi này, được nhà vi sinh học Martinus Beijerinck phát hiện vào năm 1901 Đây là loại vi khuẩn Gram âm, thường được tìm thấy trong đất trung tính và kiềm, trong nước, cũng như sống nội sinh trong thực vật.
Những loài thuộc chi Azotobacter có thể tổng hợp một số loại enzyme nitrogenase, enzyme quan trọng nhất liên quan đến sự cố định đạm
Hình 2 Azospirillum brasilense dưới kính hiển vi điện tử, x15000
(*Nguồn: http://web.mst.edu/~microbio/bio221_1999/A_brasilense.html , ngày 20/02/2013)
(*Nguồn: http://funpar.ufpr.br:8088/funpar/index.php?option=com_content&view=article&ids , ngày 21/02/2013)
(*Nguồn: http://biofertilizer.com/azotobacter , ngày 20/02/2013)
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh khác
Ngoài những loài vi khuẩn đã được biết đến, gần đây đã phát hiện một số nhóm vi khuẩn mới như Gluconacetobacter diazotrophicus, Klebsiella, Enterobacter, Azoarcus, Pseudomonas, Burkholderia, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Microbacterium, Gammaproteobacteria, Acinetobacter, Bacillus và Firmicutes, cho thấy tiềm năng nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực này.
Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
2.4.1 Khả năng cố định đạm
Nitơ là một yếu tố thiết yếu cho sự sống trên Trái Đất, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của amino acid và axit nucleic như DNA và RNA Trong thực vật, nitơ chủ yếu được sử dụng để tạo ra chlorophyll, cần thiết cho quá trình quang hợp và sự phát triển Mặc dù nitơ chiếm khoảng 78% khí quyển, nhưng dạng phân tử của nó trong không khí hạn chế khả năng sử dụng của sinh vật Đạm là dưỡng chất chính quyết định sự phát triển của lúa, cần 1 kg đạm để sản xuất 15-20 kg lúa hạt Cố định đạm sinh học, do vi khuẩn thực hiện, biến đổi nitơ thành dạng hữu cơ để sử dụng Để đảm bảo an toàn thực phẩm và phát triển nông nghiệp bền vững, việc tăng cường cố định đạm sinh học đang được ưu tiên hơn so với phương pháp công nghiệp.
Vi sinh vật cố định đạm đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa nitơ tự nhiên, giúp đáp ứng nhu cầu nitơ cho cây trồng trên trái đất Qua quá trình cố định đạm sinh học, hàng năm khoảng 170 triệu tấn nitơ từ không khí được chuyển đổi thành các hợp chất nitơ, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cây trồng.
2.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan
Trong đất, lân được chia thành ba loại chính: lân tan, lân vô cơ không tan và lân hữu cơ không tan Cây chỉ có thể hấp thụ lân dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất, chủ yếu là orthophosphate bậc một hoặc bậc hai Mặc dù nhiều loại đất như đất đỏ bazan và đất đen có hàm lượng lân cao, nhưng cây không thể hấp thụ được do lân tồn tại dưới dạng khó hòa tan như apatite, hydroxyapatite và oxyapatite.
Trong đất, có một nhóm vi sinh vật được gọi là vi sinh vật hoà tan lân, có khả năng hoà tan lân Nhóm vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng hấp thụ lân của cây trồng.
Nhóm vi sinh vật này có khả năng nuôi cấy dễ dàng trên môi trường nhân tạo Nhiều nơi đã áp dụng phương pháp trộn sinh khối hoặc bào tử vi sinh vật hòa tan lân sau khi nuôi cấy và nhân lên trong phòng thí nghiệm với bột phosphorit hoặc apatit, rồi bón cho cây Các chế phẩm sinh học này mang lại hiệu quả cao, đặc biệt ở những vùng đất thiếu lân.
2.4.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid (IAA), hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chính trong sự sinh trưởng của thực vật, ảnh hưởng đến sự phân chia và giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, cũng như sự phát triển của trái và hạt (Davies, 2004) Tác động của auxin thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào; ở các nồng độ nhất định, IAA có khả năng kích thích sự giãn dài của trục lá mầm, đồng thời ngăn cản sự phát triển của rễ chính, kích thích sự hình thành rễ bên và lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001).
Trong thực vật, có nhiều lộ trình tổng hợp IAA, với tryptophan là tiền chất phổ biến nhất Theo nghiên cứu của Koga et al (1991), các lộ trình sinh tổng hợp IAA được xác định bao gồm nhiều phương pháp khác nhau.
- Lộ trình indole-3-pyruvic acid
Tryptophan => indole-3-pyruvic acid =>indole-3-acetaldehyde => IAA
Tryptophan => tryptamine => indole-3-acetaldehyde => IAA
- Lộ trình indole-3-acetamine tryptophan => indole-3-acetamine => IAA
Vi khuẩn Enterobacter cloacae có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất L- tryptophan (Koga et al.,1991)
Hình 5 Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae
Vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA là do chúng chứa những enzyme đặc hiệu thuộc nhóm dehydrogenase
2.4.4 Đối kháng sinh học Đối kháng sinh học là biện pháp sử dụng các sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sản phẩm của chúng trong kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ các sinh vật, vi sinh vật gây bệnh Nó không những phòng, trị sâu bệnh hại có hiệu quả mà còn khắc phục được những nhược điểm của biện pháp sử dụng các chất hoá học bảo vệ thực vật
Biện pháp sinh học là phương pháp thân thiện với môi trường, ít gây ô nhiễm và giúp duy trì cân bằng sinh thái Chúng không độc hại cho người sử dụng và sản phẩm nông nghiệp từ biện pháp này có chất lượng cao, an toàn cho sức khỏe con người và vật nuôi Do đó, biện pháp sinh học đang ngày càng phổ biến tại nhiều quốc gia phát triển và được khuyến khích mở rộng trên toàn thế giới, hứa hẹn có nhiều tiềm năng phát triển trong tương lai.
Một số vi khuẩn nội sinh có khả năng kích hoạt hệ thống đề kháng cảm ứng (ISR), tương tự như hệ thống đề kháng mắc phải (SAR) Hệ thống SAR phát triển khi cây cối kích hoạt thành công các cơ chế bảo vệ để đối phó với sự nhiễm trùng do tác nhân gây bệnh.
ISR là cơ chế bảo vệ cây chống lại các tác nhân gây bệnh một cách hiệu quả, nhưng khác với SAR, vi khuẩn không gây ra triệu chứng rõ ràng trên cây chủ (van Loon et al, 1998) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn tác động của sinh vật gây hại Các phương pháp nghiên cứu sẽ khác nhau tùy thuộc vào loại tác nhân gây hại cụ thể.
2.4.5 Sản phẩm thiên nhiên từ vi khuẩn nội sinh
Những chi vi khuẩn nội sinh như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus
Lodewyckx et al (2002) nổi bật với khả năng tổng hợp nhiều sản phẩm thứ cấp quan trọng, bao gồm kháng sinh, chất chống ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, cũng như các chất kháng nấm, kháng virus và kháng sâu Bên cạnh đó, nghiên cứu còn đề cập đến các tác nhân ức chế miễn dịch.
Nhiều nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào việc sản xuất chế phẩm vi sinh có trọng lượng phân tử nhỏ, với khả năng hoạt động hiệu quả ở nồng độ thấp để chống lại các vi khuẩn gây bệnh cho động vật, con người và thực vật.
Pseudomonas viridiflava, một thành viên của chi Pseudomonas, được phân lập từ mô của nhiều loài cỏ và đã được phát hiện sản xuất hai hợp chất kháng khuẩn mới gọi là ecomycins Ecomycins là lipopeptides mới, được cấu tạo từ các acid amin không thông thường như homoserine và β-hydroxy aspartic acid Những hợp chất này có khả năng ức chế các mầm bệnh gây hại cho con người, bao gồm Cryptococcus neoformans và Candida albicans.
Các sản phẩm thứ cấp nói trên được trích ly từ sự lên men của những loài vi khuẩn như Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus (Lodewyckx et al., 2002)
2.4.6 Khả năng phân hủy sinh học
Phương pháp phân huỷ sinh học sử dụng vi sinh vật và thực vật để phân huỷ, khử độc các chất độc hại trong môi trường Được nghiên cứu từ những năm 1940, công nghệ này đã có những bước tiến đáng kể, với ứng dụng đầu tiên trong xử lý ô nhiễm dầu vào năm 1967 Phân huỷ sinh học hiệu quả trong việc xử lý đất, nước, cặn và không khí, nhờ vào hoạt tính enzyme của vi sinh vật, giúp chuyển đổi các chất độc hại thành dạng ít độc hơn Vi sinh vật được ưu tiên sử dụng do khả năng trao đổi chất đa dạng, có thể phân huỷ các chất độc như hydrocarbon trong dầu mỏ Sản phẩm cuối cùng của quá trình này là nước và CO2, không gây hại cho môi trường và các sinh vật khác.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.5.1 Ly trích hay tách chiết DNA
Kỹ thuật tinh chiết DNA là một trong những phương pháp sinh học phân tử quan trọng, đóng vai trò then chốt trong nhiều nghiên cứu Hiện nay, có nhiều phương pháp đơn giản và nhanh chóng để chiết xuất DNA, tùy thuộc vào mục đích sử dụng và loại mô cần chiết xuất Để thu được DNA tinh khiết, cần loại bỏ các tạp chất, đặc biệt là protein, và quá trình tách chiết DNA chính là giải pháp hiệu quả cho điều này.
Theo Neumann (1992), quy trình chung chiết xuất DNA như sau:
4 Loại bỏ các thành phần không phải là DNA
8 Kiểm tra chất lượng DNA
- Ly trích DNA dựa trên nguyên tắc:
Ly tâm dịch vi khuẩn để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường
Dung dịch TE pH8 có khả năng hòa tan tế bào và bảo vệ DNA khỏi sự biến tính Trong khi đó, dung dịch SDS 10% được sử dụng để phá vỡ màng nhân, giúp giải phóng DNA vào trong dung dịch.
Proteinase K là một serine protease không đặc hiệu, thường được sử dụng để chiết xuất và tinh sạch DNA có trọng lượng phân tử cao, cũng như để chiết xuất RNAse và làm bất hoạt nuclease Để tăng cường hiệu quả hoạt động, proteinase K thường được duy trì trong môi trường có sự hiện diện của SDS, EDTA và urea Chức năng chính của proteinase K là phân hủy protein.
10% CTAB/0,7M NaCl tạo phức tan với DNA, nhưng tạo phức dạng tủa với protein, lipid, …
Chloroform: isoamyl alcohol (24/1) giúp phân tách và kéo các thành phần không phải là DNA xuống mặt dưới dung dịch
Ethanol 70% giúp giữ tủa DNA, loại bỏ muối bám trong DNA và lượng isopropanol còn lại trong DNA
Sấy DNA trong máy sấy chân không để loại bỏ ethanol
PCR, viết tắt của Polymerase Chain Reaction, là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử, cho phép khuếch đại đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học và y học, phục vụ nhiều mục đích như phát hiện bệnh di truyền, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống, và phân tích mẫu DNA cổ Ngoài ra, PCR còn giúp xác định kiểu gene của các đột biến và so sánh mức độ biểu hiện gene, góp phần quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng y học hiện đại.
Chu kỳ PCR gồm 3 bước:
Trong giai đoạn tách DNA, nhiệt độ được tăng lên 94-95°C để phá vỡ cầu nối hydrogen giữa hai sợi DNA, quá trình này được gọi là biến tính Điều này đảm bảo rằng DNA và mồi được phân tách hoàn toàn, chỉ còn lại dạng sợi đơn trước chu kỳ 1 Thời gian thực hiện bước này thường kéo dài từ 1 đến 2 phút.
Giai đoạn gắn mồi là bước quan trọng trong quá trình PCR, diễn ra sau khi hai sợi DNA tách ra Nhiệt độ trong giai đoạn này được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn, thường nằm trong khoảng 45-60°C, thấp hơn 50°C so với nhiệt độ biến tính Việc sử dụng nhiệt độ không chính xác có thể dẫn đến mồi không gắn hoàn toàn hoặc gắn một cách tùy tiện vào DNA mẫu Thời gian gắn mồi thường kéo dài từ 1 đến 2 phút.
Trong giai đoạn tổng hợp, DNA polymerase gắn vào sợi trống và bắt đầu kéo dài dọc theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài trong quá trình này có vai trò quan trọng.
DNA polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại
Quy trình PCR thường được tiến hành từ 35-40 chu kỳ
Primer 16S rRNA dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau: p515FPL 5’ -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’ p13B 5’ -AGGCCCGGGAACGTATTCAC- 3’
2.5.3 Kỹ thuật điện di Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kỹ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point)
Kỹ thuật điện di gel sử dụng dung dịch đệm để tạo ra điện trường đều, trong khi bản gel (thường là agarose hoặc polyacrylamide) đóng vai trò là nền tảng phân tách các phân tử Sau quá trình điện di, các chất nhuộm như ethidium bromide, bạc và xanh coomassie được sử dụng để phát hiện vị trí của các phân tử trên gel.
Kỹ thuật điện di sử dụng lực kéo của điện trường để tác động lên các phân tử tích điện, trong khi kích thước lỗ của gel quyết định khả năng di chuyển của chúng Gel được tạo thành từ các chuỗi polymer liên kết chéo, hình thành một mạng lưới với kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ chất cao phân tử như agarose và polyacrylamide, cũng như phản ứng tạo liên kết chéo.
Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:
- Lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)
- Kích thước của phân tử so với kích thước lỗ gel
Điện di bằng gel agarose là phương pháp phân tích hình dạng và độ cồng kềnh của phân tử DNA, trong đó mẫu sản phẩm PCR được nhỏ vào gel agarose và chạy điện di Kết quả cho thấy các đoạn DNA nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn so với các đoạn lớn hơn từ cực âm đến cực dương Kích thước sản phẩm PCR được xác định bằng cách so sánh với thang chuẩn DNA, bao gồm các đoạn DNA có kích thước đã biết, cũng nằm trong gel.
Loading buffer là dung dịch chứa glycerol, bromophenol blue, xylencyanol và sucrose, được sử dụng để tải DNA Bromophenol blue và xylencyanol tạo màu sắc cho dung dịch, trong khi glycerol và sucrose với tỷ trọng cao giúp giữ cho DNA không bị trôi ra ngoài giếng trong quá trình nạp mẫu.
Thang chuẩn DNA phổ biến trong điện di DNA sợi đôi là "100bp plus DNA Ladder", bao gồm 14 đoạn DNA với kích thước từ 100bp đến 3000bp Hai mẫu DNA kích thước 1000bp và 500bp rất dễ xác định trên gel Hiện nay, thang chuẩn này được cung cấp sẵn kèm theo thuốc nhuộm 6X DNA Loading Dye và được bảo quản trong TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,6 và 1 mM EDTA trong 1 lít) Để sử dụng, cần thêm 1μl mẫu DNA thang chuẩn cho mỗi 1mm giếng trên gel.
Hình 6 Máy gia nhiệt (máy PCR) và bộ điện di
(*Nguồn (máy PCR): http://www.cgenetool.com/products/Biorad_c1000.shtml , ngày 20/07/2013)
(*Nguồn (bộ điện di): http://regentsgenetictechnology.wikispaces.com/Gel+Electrophoresis+3-4, ngày
(*Nguồn: http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/generuler-100-bp-plus-dna-ladder-100-to-3000-bp/, ngày 20/07/2013)
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Một số dụng cụ và máy móc, thiết bị như:
- Ống nghiệm nuôi vi khuẩn, đĩa petri, ống đong, bình tam giác 100 ml - 500 ml, ống Falcon, cốc, chai, que cấy, đèn cồn, lame và lammen …
Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ cấy, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi, cân phân tích, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy lắc, máy đo pH, máy đo quang phổ, tủ sấy, micropipette, máy ly tâm, water-bath, máy vortex, tube eppendorf, đầu cole, bộ điện di, bộ nguồn điện di, bộ đọc gel, máy gia nhiệt (máy PCR), máy chụp hình gel, tủ lạnh và nhiều thiết bị khác Những thiết bị này đóng vai trò thiết yếu trong việc thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu khoa học.
Mẫu lúa được trồng ở huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên
Môi trường phân lập vi khuẩn NFb và RMR, môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP
Iod, Fushin, Crystal Violet, Ethanol (70%), nước cất hai lần vô trùng
EDTA, phenol (C2H5OH), nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), NaOH,
Na2HPO4, NaOCl, ammonium molybdate ((NH4)6Mo7O24), aotassium antymonyl tartrate (KSbOC4H4O6), acid ascorbic, acid sulfuric (H2SO4) đậm đặc, FeCl3, HgCl2,
H2O2, dung dịch NH4 + 1 mg/l, dung dịch P2O5 10 mg/l, dung dịch IAA chuẩn 10 mg/l Tris-HCl pH8, EDTA, 10% SDS, proteinase K, CTAB, chloroform, ethanol, isopropanol, nước cất hai lần vô trùng
Taq DNA polymerase, bi H 2 O, buffer, MgCl 2, dNTPs, primer, ethidium bromide, agarose tinh khiết, thang chuẩn, loading buffer.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu lúa nương tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên đang trong giai đoạn tăng trưởng mạnh mẽ, với sự hiện diện phong phú của các vi khuẩn nội sinh được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau.
Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy mạnh để loại bỏ đất và những lá già, sau đó để ráo tự nhiên Dùng dao bén cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ, cho vào túi nylon sạch và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa phân lập.
Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và khử trùng bề mặt bằng cồn 96%, HgCl2 0,1% và hydrogen peroxide (H2O2) 3%, đảm bảo hóa chất ngập mẫu và lắc nhẹ Sau 3 phút, rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng Để kiểm tra độ sạch, sử dụng 200 μl nước rửa mẫu cuối cùng để cấy lên đĩa môi trường Tryptone - Yeast extract - Glucose agar Nếu sau 24 giờ không có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, mẫu đã đạt yêu cầu.
Để tiến hành chiết xuất mẫu, bạn cần cho khoảng 2 gam mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) vào cối vô trùng và giã nhuyễn Sau đó, thêm 0,5-1 ml nước cất vào cối, trộn đều và hút phần dịch trích để cho vào ống 1,5 ml.
Môi trường NFb và RMR bán đặc được chuẩn bị thông qua quá trình khử trùng nhiệt ướt Sau đó, 3 ml môi trường được phân phối vào ống nghiệm, đặt trên giá ống nghiệm và để nguội.
Trộn đều dịch trích mẫu bằng máy vortex, sau đó hút 500 μl dịch và cho vào các ống nghiệm chứa môi trường NFb và RMR bán đặc Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Cuối cùng, đậy nắp ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 30 oC trong khoảng 2-4 ngày.
Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh
Cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb và RMR đặc, ủ ở 30°C trong 1-2 ngày Sau đó, chọn những khuẩn lạc rời, đều nằm trên đường cấy và chuyển sang đĩa môi trường khác Tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi cho đến khi vi khuẩn đạt độ ròng, sau đó chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc và bảo quản trong tủ lạnh, được xem là một dòng vi khuẩn.
3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập, cần đo kích thước và quan sát hình thái của các dạng khuẩn lạc, bao gồm màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường Đối với những khuẩn lạc có kích thước nhỏ, sử dụng kính lúp để quan sát sẽ giúp thu được kết quả chính xác hơn.
3.3.4 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi tiến hành phân lập, vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp nhỏ giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần để đánh giá hình dạng và sự chuyển động của chúng Việc chuẩn bị mẫu vi khuẩn là bước quan trọng trong quá trình này.
- Nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame)
- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật
Để đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn, hãy nghiêng một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame ở góc 45 độ Sau đó, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng để đảm bảo trong mẫu không xuất hiện bọt khí.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ở độ phóng đại 400 lần
3.3.5 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm quan trọng giúp phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính: Gram dương và Gram âm, dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào Quy trình này bắt đầu bằng việc quan sát hình dạng và chuyển động của vi khuẩn, sau đó tiến hành nhuộm Gram theo các bước cụ thể để xác định loại vi khuẩn.
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào 20μl nước cất ở giữa kính mang vật
- Hơ nhanh mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào kính mang vật
- Nhuộm bằng dung dịch Crystal Violet (1-2 giọt) trong 2 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod trải đều và để trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Rửa lại bằng ethanol (70%) để tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô;
- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fuchsin (1-2 giọt) trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô
- Tiến hành quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần
Vi khuẩn Gram dương có màu tím xanh của Crystal Violet, trong khi vi khuẩn Gram âm trở thành màu hồng đỏ của Fuchsin
3.3.6 Khảo sát khả năng cố định đạm
Vi khuẩn có khả năng cố định đạm từ không khí có thể phát triển trong môi trường không có đạm Để xác định các dòng vi khuẩn này, cần cấy chuyển chúng trên môi trường Burk không đạm đặc và ủ ở nhiệt độ 30°C, theo dõi sự phát triển trong 1-2 ngày Những dòng vi khuẩn phát triển trong điều kiện này chính là những dòng có khả năng cố định đạm.
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NFb và RMR lỏng trong 1-2 ngày trước khi chuyển sang môi trường Burk không đạm lỏng Sau đó, hàm lượng NH4+ hình thành trong dung dịch được khảo sát sau 2, 4, 6 và 8 ngày bằng phương pháp so màu Sự tạo ra NH4+ từ vi khuẩn phản ứng với thuốc thử, tạo ra dung dịch màu xanh; màu xanh càng đậm thì hàm lượng NH4+ càng cao.
Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng trong ống Falcon và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng trong
8 ngày tiến hành thí nghiệm Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần
Hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch mẹ EDTA: cân 6 g EDTA cho vào 80 ml nước khử khoáng, thêm nước cho đủ 100 ml, chỉnh pH về 7
- Dung dịch mẹ phenol-nitroprusside: cân 7 g phenol (C 2 H 5 OH) và 0,034 g nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đến 100 ml
