CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.7. Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
Kết quả phân tích PCR với cặp mồi 16S rRNA (p515FPL, p-13B)(Ziniel et al., 2002) để nhận diện các dòng vi khuẩn đã phân lập cho thấy có 20/20 dịng cho band DNA ở vị trí khoảng 900bp so với thang chuẩn là vi khuẩn nội sinh.
Hình 25. Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S rRNA của 20 dịng vi khuẩn
Chú thích: TC: thang chuẩn, DC-: đối chứng âm, DC+: đối chứng dương, các giếng 1-20 tương ứng từ dòng AN1 đến dòng AN20
Kết hợp với kết quả kiểm tra các đặc tính cố định đạm, hịa tan lân khó tan và
tổng hợp IAA đã chọn ra bốn dịng có đặc tính tốt để giải trình tự là AN6, AN9, AN15 và AN17.
Dịng AN6 có tổng số nucleotid được giải là 765 nucleotid, xuất hiện band rõ nét có kết quả giải trình tự 16S rRNA như sau:
GGGGCCTGGCGGTNNGCTACACATGCAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGG ACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG ACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGG GGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGG TGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGAC GGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGG AATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTG CAGTGGATACTGGGCGACTAGAATGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATC AGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACATTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC AGGTTATCCGGGTGT
Kết quả tra cứu trên BLAST của NCBI cho thấy dịng vi khuẩn AN6 được xác
định có độ tương đồng với trình tự DNA của JQ659719 Pseudomonas hibiscicola
dịng R4-790 ở mức 99% (hình 26).
Hình 26. Kết quả so sánh trình tự AN6 với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Dịng AN9 có tổng số nucleotid được giải là 780 nucleotid xuất hiện band rõ nét có kết quả giải trình tự 16S rRNA như sau:
GGGGCTGGCGGCAGGCTACACATGCAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACG GGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTC GCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGA AGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTT ACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT TACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT TCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG GAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG GATAGTCCCGGGGGGGGTGTAAAAAAAAAA
Kết quả tra cứu trên BLAST của NCBI cho thấy dòng vi khuẩn AN9 được xác
định có độ tương đồng với trình tự DNA của JX495602 Enterobacter cloacae dòng
Bio103 ở mức 99% (hình 27).
Hình 27. Kết quả so sánh trình tự AN9 với trình tự các dịng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Dịng AN15 có tổng số nucleotid được giải là 779 nucleotid có kết quả giải trình tự 16S rRNA như sau:
GGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAAT TGCATTCGATACTGGTTGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA TCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCTCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAA ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAACCGTTGGGGCCCTTGAGGCTTTAGTGG CGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCC CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACAGAGAAC TTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCACCTCCCGGCGTGAG ATATTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCGACCCTTTTCCTTATTTGCCACCACTTCGGGTGGGAACTTTAAGGAT ACTGCCGCTGACAAACTGCAGGAAGGCGGGGACGACGTCCAGTCATCATGGGCCTTACAGCGAGGGCGACACACT TGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGGTGCTACACACCGATGTGATGCTCATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGTTTT
Kết quả tra cứu trên BLAST của NCBI cho thấy dòng vi khuẩn AN15 được xác
định có độ tương đồng với trình tự DNA của AB859674 Acinetobacter radioresistens,
dòng MTCC ở mức 97% (hình 28).
Hình 28. Kết quả so sánh trình tự AN15 với trình tự các dịng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Dịng AN17 có tổng số nucleotid được giải là 860 nucleotid có kết quả giải trình tự 16S rRNA như sau:
GCGGGGGCAGGTTACCCGGAATATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACG GCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGA AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGT TTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC TTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAG TTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAA ACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGAAATCGCGGATCAACAT GCCCCGGTGAATACTCCGCCGGGGGGGCATATAGA
Kết quả tra cứu trên BLAST của NCBI cho thấy dòng vi khuẩn AN17 được xác
định có độ tương đồng với trình tự DNA của KF417540 Bacillus flexus dịng PHCDB8 ở mức 99% (hình 29).
Hình 29. Kết quả so sánh trình tự AN17 với trình tự các dịng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Hình 30. Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ giữa bốn dòng vi khuẩn nội sinh thực hiện theo phương pháp Maximum-Likelihood với 1500 lần
lặp lại (Bootstrap) dựa theo trình tự gen 16S rRNA
(Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA 5.1)
Trong hình 30 cho thấy cây phả hệ chia ra hai nhánh lớn. Dịng AN17 có mối quan hệ gần với dịng Enterobacter cloacae dịng Bio103, dịng AN15 có khoảng cách khá xa so với dòng AN17 nhưng vẫn thuộc nhánh I. Dịng AN6 có mối quan hệ rất gần
gũi với dịng Acinetobacter radioresistens, dòng: MTCC 9821 và dòng AN9 gần với
Acinetobacter radioresistens dòng ABAC5 (nhánh II). Như vậy hai dịng AN6, AN9