CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu lúa nương đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh, có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh nhiều nhất được thu tại nhiều địa điểm khác nhau tại huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên.
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, loại bỏ những lá già, để ráo tự nhiên; cắt rời rễ, thân, lá và hạt thành từng đoạn nhỏ bằng dao bén, để riêng trong túi nylon sạch, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa phân lập.
Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml và tiến hành khử trùng bề mặt lần lượt bằng các hóa chất sau: cồn 96%, HgCl2 0,1% và hydrogen peroxide (H2O2) 3%. Hóa chất phải vừa ngập mẫu và phải lắc nhẹ bình. Sau 3 phút khử trùng, mẫu phải được rửa
sạch bằng nước cất vô trùng.
Để kiểm tra độ sạch của mẫu, dùng 200 μl nước rửa mẫu lần cuối chủng lên đĩa
chứa môi trường Tryptone - Yeast extract - Glucose agar. Nếu sau 24 giờ đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc nghĩa là mẫu đã đạt yêu cầu.
Cho khoảng 2 g mẫu rễ (hoặc thân, lá, cuống lá, hạt) vào cối vô trùng giã nhuyễn, thêm 0,5-1 ml nước cất cô trùng vào cối, trộn đều và hút phần dịch trích này cho vào tube 1,5 ml.
3.2.2. Phân lập vi khuẩn
Môi trường NFb và RMR bán đặc được chuẩn bị, khử trùng nhiệt ướt và phân
phối 3 ml môi trường cho vào ống nghiệm đặt trên giá ống nghiệm và để nguội.
Trộn đều dịch trích mẫu bằng máy vortex rồi hút 500 μl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường NFb và RMR bán đặc, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, sau đó đậy nắp ống nghiệm lại và đem ủ ở 30oC khoảng 2-4 ngày.
Sau 2-4 ngày quan sát ống nghiệm, thấy có một lớp màng mỏng trên bề mặt mơi
trường, đó là dấu hiệu chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Lần lượt cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường NFb và RMR đặc và ủ ở 30oC; sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường cấy, cấy chuyển
sang những đĩa môi trường khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn
đã ròng, chuyển mẫu ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở trong tủ lạnh và được xem là một dòng vi khuẩn.