Thành phần một phản ứng Nồng độ sau cùng Thể tích (μl) Bi H2O 13,25 Buffer (+K) 3 mM 2 MgCl2 3 mM 2 dNTP 1,6 mM 4 Primer p515FPL 10 pM 1 Primer p13B 10 pM 1 DMSO 0,05 μg 0,5 Taq 1,25 u 0,25 DNA vi khuẩn 50 ng 1
- Chu kỳ gia nhiệt khi thực hiện
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Máy gia nhiệt là máy đun
nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu
(natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.
Quy trình PCR gồm 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
(1) Giai đoạn tách: nhiệt độ tăng lên 94°C, thời gian: 45 giây. (2) Giai đoạn gắn mồi: 55°C, thời gian: 45 giây.
(3) Giai đoạn tổng hợp: 72°C, thời gian: 1 phút.
Primer 16S rRNA (Zinniel et al., 2002) dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:
p515FPL 5’ -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA
Sau đó, sản phẩm PCR được giữ ở 4°C.
- Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
Sau khi phản ứng PCR được thực hiện, sản phẩm PCR được điện di bằng gel
agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr).
Quy trình điện di như sau:
- Chuẩn bị gel
Khay điện di được đặt sẵn lược có số răng là 17 ở một đầu khay và được đặt ở nơi bằng phẳng.
Gel sử dụng chạy điện di: 40ml với nồng độ 1% agrarose.
Cân 0,40g agrarose cho vào chai thủy tinh có chứa 40ml bufer TBE 1X. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào buffer TBE 1X.
Nung hỗn hợp trong microwave ở mức medium trong 5 phút cho agarose tan
hồn tồn. Để nguội (có thể cầm bằng tay được), sau đó thêm 0,8μl ethidium bromide
vào, lắc đều và đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay. Dung dịch sẽ tự trải đều khay. Sau khoảng 45 phút gel đặc lại có thể sử dụng được.
Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di (bufer TBE 1X) phủ mặt gel
khoảng 2 mm.
Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel. - Load mẫu:
Dùng micropipette hút dung dịch loading buffer và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2μl ra giấy parafilm. Trộn đều 10μl dung dịch mẫu với dung dịch loading
buffer rồi nhỏ hổn hợp vào giếng của gel. Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút.
- Quan sát và chụp hình:
Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống máy đọc gel và chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ).
C. Giải trình tự DNA để nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh
Sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI3130 thơng qua cơng ty MACROGEN, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLAST N
(Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự đoạn gen 16S
rRNA của các dịng vi khuẩn với trình tự gen 16S rRNA của các lồi vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information) và vẽ cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.1.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập 4.1. Kết quả phân lập
Sau các giai đoạn phân lập và tách rịng vi khuẩn trên hai mơi trường Nfb và