CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.6. Khảo sát khả năng cố định đạm
Do có khả năng tổng hợp đạm từ khơng khí, các vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm. Cấy chuyển các dịng vi khuẩn phân
lập được trên mơi trường Burk không đạm đặc, ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển trong 1-2 ngày. Những dòng phát triển được là những dịng có khả năng cố định đạm.
Những dịng vi khuẩn này được ni tăng sinh trong môi trường NFb và RMR lỏng trong 1-2 ngày trước khi chủng vào môi trường Burk không đạm lỏng để tiến
hành khảo sát hàm lượng NH4+ hình thành trong dung dịch sau 2, 4, 6 và 8 ngày bằng
phương pháp so màu. Lượng NH4+ được vi khuẩn tạo ra trong dung dịch phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch màu xanh, lượng NH4+ càng nhiều thì màu xanh của dung dịch càng đậm.
Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng trong ống Falcon và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phịng trong 8 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Hóa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch mẹ EDTA: cân 6 g EDTA cho vào 80 ml nước khử khoáng, thêm nước
cho đủ 100 ml, chỉnh pH về 7.
- Dung dịch mẹ phenol-nitroprusside: cân 7 g phenol (C2H5OH) và 0,034 g nitroprusside (Na2Fe(CN)5NO(2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đến 100 ml.
- Dung dịch mẹ Sodium hypochlorise: cân 1,48 g NaOH và 4,98 g Na2HPO4, chuẩn bị sẵn 80 ml nước và 20 ml dung dịch NaOCl, khi thêm NaOCl xong thì thêm nước ngay
sau đó cho đủ 100 ml.
Xây dựng đường chuẩn NH4+: Chuẩn bị 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự từ 0 đến 5 như bảng sau.
Bảng 1. Đường chuẩn NH4+ 0 1 2 3 4 5 NH4+ 1 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Dung dịch mẹ EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Dung dịch mẹ phenol-nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch mẹ sodium hypochloride
(ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6 6 6 6 6 6
Mẫu: ly tâm mẫu (2ml dịch vi khuẩn) 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm
được lần lượt thêm vào: 2 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 0,5 ml dung
dịch mẹ EDTA, 1 ml dung dịch mẹ phenol-nitroprusside, 2 ml dung dịch mẹ sodium hypochloride; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15-20 phút và tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 636 nm.
3.3.7. Khảo sát khả năng hịa tan lân khó tan
Tương tự khảo sát năng cố định đạm, sau khi được cấy chuyển trên môi trường NBRIP đặc trong 1-2 ngày ở 30oC, các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển tốt trên cả
môi trường này và môi trường Burk không đạm được nhân sinh khối trong môi trường
NFb và RMR rồi chủng vảo môi trường NBRIP lỏng. Khả năng hịa tan lân khó tan được định lượng sau 5, 10, 15 và 20 ngày.
Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào 25 ml mơi trường NBRIP lỏng trong bình tam giác và lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 20 ngày tiến hành thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch A: chuẩn bị sẵn 1 l nước khử khoáng được đặt trong thau nước lạnh, cho từ từ 140 ml H2SO4 đậm đặc vào, để nguội; cân 12 g ammonium molybdate
((NH4)6Mo7O24) cho vào 100 ml nước khử khoáng; cân 0,2908 g potassium antymonyl
tartrate (KSbOC4H4O6) cho vào 100 ml nước khử khoáng; trộn ba dung dịch trên lại rồi thêm nước cho đủ 2 l.
Xây dựng đường chuẩn P2O5: chuẩn bị 6 ống nghiệm như sau Bảng 2. Đường chuẩn P2O5 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (ml) 4 4 4 4 4 4 P2O5 10 mg/l (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước khử khoáng (ml) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 Tổng thể tích (ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5
Mẫu: lấy mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15, 20 ngày ly tâm mẫu 12000
vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào: 4 ml nước khử khoáng, 0,5 ml mẫu đã ly tâm, 4 ml dung dịch B, 4 ml nước khử khoáng; trộn đều bằng máy vortex, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 15-20 phút và tiến hành đo lượng lân được
hòa tan bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 880 nm.
3.3.8. Khảo sát khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA)
Cấy chuyển các dịng vi khuẩn nội sinh trên mơi trường Nfb và RMR đặc có bổ
sung tryptophan (100 μl/100 ml) và ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1-2 ngày, dịng nào phát triển thì có khả năng tổng hợp IAA. Chọn những dòng phát triển
trên môi trường này đồng thời phát triển trên môi trường Burk không đạm và NBRIP đặc để tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp IAA trên môi trường NFb và RMR lỏng
có bổ sung tryptophan sau 2, 4, 6 và 8 ngày.
Chủng 150 μl vi khuẩn gốc lần lượt vào các tube eppendorf có chứa 1,5 ml mơi
trường Nfb và RMR lỏng có bổ sung tryptophan và ủ trong tối trong 8 ngày tiến hành
thí nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại ba lần.
Chuẩn bị thuốc thử: đong 447 ml nước khử khoáng cho vào cốc có thể tích lớn hơn 1l,
đặt cốc này trong thau nước lạnh, cho từ từ 553 ml H2SO4 đậm đặc vào cốc trên, để
nguội; cân 4,5g FeCl3 trong cốc khác cũng có thể tích lớn hơn 1l; rót từ từ dung dịch H2SO4 đã được pha loãng vào cốc chứa 4,5g FeCl3, khuấy đều, để nguội; bảo quản
Xây dựng đường chuẩn:
Bảng 3. Đường chuẩn IAA
0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử (ml) 1 1 1 1 1 1
Tổng thể tích (μl) 1500 1510 1520 1530 1540 1550
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15-20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp
quang phổ ở bước sóng 530 nm. Dung dịch có màu hồng hay đỏ tùy thuộc vào lượng IAA có trong mẫu. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.
x Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý với mức độ tin cậy 99%. 3.3.9. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
A. Ly trích DNA của vi khuẩn
Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm.
Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào mơi trường và tủa vi khuẩn.
Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn.
Cho 250μl dung dịch TE pH8 vào phần cặn của tube, và đánh tan sinh khối. Thêm 50μl dung dịch 10% SDS. Bổ sung thêm 5μl proteinase K (20 mg/ml) và ủ bằng water-bath trong 20 phút ở 65oC, cứ mỗi 5 phút đảo ngược tube 1 lần.
Thêm 400μl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn đều và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút. Bổ sung 600μl chloroform: isoamyl alcohol (24/1) (thực hiện trong tủ hút) vào tube và trộn đều, ly tâm ở 12000 vịng/phút trong 10 phút.
Chuyển 500μl phần trong DNA phía trên vào tube mới, thêm 500μl isopropanol vào tube và lắc đều, giữ ở -20oC ít nhất 30 phút.
Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần trong, lấy phần cặn là DNA tủa.
Rửa với 500μl ethanol 70%, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần. Sấy DNA trong máy ly tâm chân không ở 45oC trong 15 phút để loại bỏ ethanol. Hòa tan trong 30μl nước cất hai lần để trữ DNA.
B. Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
- Pha mix trong tube 1,5 ml.
Bảng 4. Thành phần một phản ứng PCR Thành phần một phản ứng Nồng độ sau cùng Thể tích (μl) Thành phần một phản ứng Nồng độ sau cùng Thể tích (μl) Bi H2O 13,25 Buffer (+K) 3 mM 2 MgCl2 3 mM 2 dNTP 1,6 mM 4 Primer p515FPL 10 pM 1 Primer p13B 10 pM 1 DMSO 0,05 μg 0,5 Taq 1,25 u 0,25 DNA vi khuẩn 50 ng 1
- Chu kỳ gia nhiệt khi thực hiện
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Máy gia nhiệt là máy đun
nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu
(natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.
Quy trình PCR gồm 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
(1) Giai đoạn tách: nhiệt độ tăng lên 94°C, thời gian: 45 giây. (2) Giai đoạn gắn mồi: 55°C, thời gian: 45 giây.
(3) Giai đoạn tổng hợp: 72°C, thời gian: 1 phút.
Primer 16S rRNA (Zinniel et al., 2002) dùng để nhận dạng vi khuẩn nội sinh có trình tự sau:
p515FPL 5’ -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’
Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA
Sau đó, sản phẩm PCR được giữ ở 4°C.
- Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
Sau khi phản ứng PCR được thực hiện, sản phẩm PCR được điện di bằng gel
agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr).
Quy trình điện di như sau:
- Chuẩn bị gel
Khay điện di được đặt sẵn lược có số răng là 17 ở một đầu khay và được đặt ở nơi bằng phẳng.
Gel sử dụng chạy điện di: 40ml với nồng độ 1% agrarose.
Cân 0,40g agrarose cho vào chai thủy tinh có chứa 40ml bufer TBE 1X. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào buffer TBE 1X.
Nung hỗn hợp trong microwave ở mức medium trong 5 phút cho agarose tan
hoàn tồn. Để nguội (có thể cầm bằng tay được), sau đó thêm 0,8μl ethidium bromide
vào, lắc đều và đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay. Dung dịch sẽ tự trải đều khay. Sau khoảng 45 phút gel đặc lại có thể sử dụng được.
Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di (bufer TBE 1X) phủ mặt gel
khoảng 2 mm.
Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel. - Load mẫu:
Dùng micropipette hút dung dịch loading buffer và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2μl ra giấy parafilm. Trộn đều 10μl dung dịch mẫu với dung dịch loading
buffer rồi nhỏ hổn hợp vào giếng của gel. Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút.
- Quan sát và chụp hình:
Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống máy đọc gel và chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ).
C. Giải trình tự DNA để nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh
Sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI3130 thông qua công ty MACROGEN, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLAST N
(Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) để so sánh trình tự đoạn gen 16S
rRNA của các dịng vi khuẩn với trình tự gen 16S rRNA của các lồi vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information) và vẽ cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.1.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập 4.1. Kết quả phân lập
Sau các giai đoạn phân lập và tách ròng vi khuẩn trên hai mơi trường Nfb và
RMR, thu được 20 dịng vi khuẩn từ cây lúa nương trồng ở huyện Tuy An, tỉnh Phú
Yên. Trong đó 10 dịng (AN1-AN10) phân lập trên mơi trường Nfb và 10 dịng (AN11-AN20) phân lập trên mơi trường RMR.
Trong 20 dịng vi khuẩn phân lập được, có 6 dịng vi khuẩn phân lập từ thân, chiếm 30% và 14 dòng phân lập từ rễ , chiếm 70%
Bảng 5. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Nfb và RMR RMR
STT Dòng vi khuẩn Giống lúa Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 AN1 Tàu cúc Thân Xã An Hòa
2 AN2 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
3 AN3 Tàu cúc Thân Xã An Hòa
4 AN4 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
5 AN5 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
6 AN6 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
7 AN7 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
8 AN8 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
9 AN9 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
10 AN10 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
11 AN11 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
12 AN12 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
13 AN13 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
14 AN14 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
15 AN15 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
16 AN16 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
17 AN17 Tàu cúc Thân Xã An Hiệp
18 AN18 Tàu cúc Rễ Xã An Hòa
19 AN19 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
20 AN20 Tàu cúc Rễ Xã An Hiệp
Các dịng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường bán đặc, tạo thành màng mỏng (pellicle) sau 2-4 ngày.
Hình 9. Vi khuẩn sau 36 giờ ni cấy trên môi trường bán đặc Nfb (trái) và RMR (phải) tạo màng mỏng trên bề mặt môi trường
4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn
Hình 10. Khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh cấy trên môi trường Nfb và RMR
Trong 20 dịng vi khuẩn, có 12 dịng có khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm 60%,
40% cịn lại có khuẩn lạc màu trắng trong (8 dịng).
Chỉ có hai dịng vi khuẩn có dạng khơng đều, độ nổi lài và bìa cưa là AN16 và
AN18, 18 dịng vi khuẩn cịn lại có dạng trịn, độ nổi mơ và bìa ngun, chiếm 90%.
Đường kính của 20 dòng khuẩn lạc dao động từ 1,0-2,5 mm sau khi cấy trên môi trường đặc và ủ trong tủ ủ 24h.
Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường
Nfb và RMR
STT Dòng vi khuẩn khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc Dạng khuẩn lạc Độ nổi khuẩn lạc Dạng bìa Đường kính (mm)
1 AN1 Trắng đục Trịn Mơ Nguyên 1,5
2 AN2 Trắng đục Trịn Mơ Nguyên 1,5
3 AN3 Trắng đục Trịn Mơ Ngun 1
4 AN4 Trắng trong Trịn Mơ Nguyên 2
6 AN6 Trắng trong Trịn Mơ Nguyên 2
7 AN7 Trắng trong Trịn Mơ Ngun 2
8 AN8 Trắng đục Tròn Mô Nguyên 1
9 AN9 Trắng đục Trịn Mơ Ngun 1,5
10 AN10 Trắng đục Trịn Mơ Nguyên 1,5
11 AN11 Trắng trong Trịn Mơ Nguyên 1,5
12 AN12 Trắng đục Trịn Mơ Ngun 1,5
13 AN13 Trắng trong Tròn Mô Nguyên 2
14 AN14 Trắng trong Trịn Mơ Ngun 2
15 AN15 Trắng trong Trịn Mơ Nguyên 2,5
16 AN16 Trắng đục Khơng đều Lài Bìa cưa 2,5
17 AN17 Trắng đục Trịn Mơ Nguyên 2
18 AN18 Trắng đục Khơng đều Lài Bìa cưa 2,5
19 AN19 Trắng đục Trịn Mơ Nguyên 1,5
20 AN20 Trắng đục Trịn Mơ Ngun 1,5
4.3. Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
Hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp giọt
ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.
Tất cả vi khuẩn phân lập được đều có dạng hình que ngắn phù hợp với kết quả của Nguyễn Ái Chi (2009) và Phan Thị Nhã (2009). Hai mươi dòng vi khuẩn này đều có khả năng di chuyển chậm trong mơi trường lỏng. Khi nhuộm Gram, tất cả 20 dòng vi khuẩn đều có màu đỏ của thuốc nhuộm fuchsin chứng tỏ chúng là vi khuẩn Gram âm.
Bảng 7. Đặc điểm tế bào của 20 dòng vi khuẩn đã phân lập được
STT Dòng vi khuẩn Gram Chuyển động Hình dạng vi khuẩn
1 AN1 - + Que ngắn 2 AN2 - + Que ngắn 3 AN3 - + Que ngắn 4 AN4 - + Que ngắn 5 AN5 - + Que ngắn 6 AN6 - + Que ngắn 7 AN7 - + Que ngắn 8 AN8 - + Que ngắn
9 AN9 - + Que ngắn 10 AN10 - + Que ngắn 11 AN11 - + Que ngắn 12 AN12 - + Que ngắn 13 AN13 - + Que ngắn 14 AN14 - + Que ngắn 15 AN15 - + Que ngắn 16 AN16 - + Que ngắn 17 AN17 - + Que ngắn 18 AN18 - + Que ngắn 19 AN19 - + Que ngắn 20 AN20 - + Que ngắn 4.4. Khả năng cố định đạm
Cấy 20 dịng vi khuẩn trên mơi trường Burk’s không đạm đặc và ủ ở 30oC, theo