0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
IAA chuẩn 10 mg/l (μl) 0 10 20 30 40 50
Thuốc thử (ml) 1 1 1 1 1 1
Tổng thể tích (μl) 1500 1510 1520 1530 1540 1550
Mẫu: ly tâm mẫu 12000 vòng/phút trong 5 phút; ống nghiệm được lần lượt thêm vào 0,5 ml mẫu đã ly tâm và 1 ml thuốc thử rồi được khuấy đều bằng máy vortex, ổn định 15-20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đo lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp
quang phổ ở bước sóng 530 nm. Dung dịch có màu hồng hay đỏ tùy thuộc vào lượng IAA có trong mẫu. Các bước trên đều phải được thực hiện trong tối.
x Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý với mức độ tin cậy 99%. 3.3.9. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
A. Ly trích DNA của vi khuẩn
Nuôi vi khuẩn trong 3ml môi trường LB lỏng và lắc ủ qua đêm.
Chuyển 2 ml dung dịch vi khuẩn vào tube eppendoft 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào mơi trường và tủa vi khuẩn.
Loại bỏ phần dung dịch trong có trong tube, giữ lại phần cặn.
Cho 250μl dung dịch TE pH8 vào phần cặn của tube, và đánh tan sinh khối. Thêm 50μl dung dịch 10% SDS. Bổ sung thêm 5μl proteinase K (20 mg/ml) và ủ bằng water-bath trong 20 phút ở 65oC, cứ mỗi 5 phút đảo ngược tube 1 lần.
Thêm 400μl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn đều và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút. Bổ sung 600μl chloroform: isoamyl alcohol (24/1) (thực hiện trong tủ hút) vào tube và trộn đều, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 500μl phần trong DNA phía trên vào tube mới, thêm 500μl isopropanol vào tube và lắc đều, giữ ở -20oC ít nhất 30 phút.
Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần trong, lấy phần cặn là DNA tủa.
Rửa với 500μl ethanol 70%, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần. Sấy DNA trong máy ly tâm chân không ở 45oC trong 15 phút để loại bỏ ethanol. Hòa tan trong 30μl nước cất hai lần để trữ DNA.
B. Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
- Pha mix trong tube 1,5 ml.