PHÂN lập VI KHUẨN nội SINH từ rễ cây bắp TRỒNG TRÊN đất ở HAI TỈNH ĐỒNG NAI và VŨNG tàu

Mười sáu dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb và môi trường LGI từ rễ cây bắp trồng ở đất huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai và Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa – Vũng Tàu đều có khả năng phát triển trên môi trường Burk’s không đạm và môi trường NBRIP sau 72 giờ nuôi trên môi trường đặc, ủ ở 300C. Kiểm tra khả năng tổng hợp đạm trên môi trường Burk’s lỏng và khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng, kết quả có 1616 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm chiếm tỉ lệ 100% và 1616 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan chiếm tỉ lệ 100%.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ RỄ CÂY BẮP TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ VŨNG TÀU Cần Thơ, Tháng 11/2012 TÓM LƢỢC Mười sáu dịng vi khuẩn phân lập mơi trường NFb môi trường LGI từ rễ bắp trồng đất huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa – Vũng Tàu có khả phát triển mơi trường Burk’s khơng đạm môi trường NBRIP sau 72 nuôi môi trường đặc, ủ 300C Kiểm tra khả tổng hợp đạm môi trường Burk’s lỏng khả hịa tan lân khó tan mơi trường NBRIP lỏng, kết có 16/16 dịng vi khuẩn có khả tổng hợp đạm chiếm tỉ lệ 100% 16/16 dịng vi khuẩn có khả hịa tan lân khó tan chiếm tỉ lệ 100% Trong có 4/16 dịng vi khuẩn tổng hợp NH4+ cao bao gồm dòng: NA3a (2,17 mg/l), NA3b (2,5 mg/l), LA2 (2,03 mg/l), LTT2 (2,82 mg/l); 4/16 dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan tốt gồm dịng: NTB1 (23,88 mg/l), NTB2 (24,33 mg/l), LA3b (25,42 mg/l), LTT1 (26,46 mg/l) Từ khóa: Cây bắp, cố định đạm, hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh i MỤC LỤC Trang TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc bắp 2.2 Vi khuẩn nội sinh 2.2.1 Vùng rễ vi khuẩn vùng rễ 2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum 2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter 2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia 2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter 2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter 2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum 2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella 2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh giới Việt Nam 2.4 Một số đặc tính vi khuẩn nội sinh 10 2.4.1 Khả cố định đạm 10 2.4.2 Khả hòa tan lân khó tan 11 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Địa điểm thời gian thực 13 3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 13 3.1.2 Thời gian thực 13 3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 13 ii 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 13 3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 14 3.2.3 Hóa chất mơi trƣờng 14 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu phân lập dòng vi khuẩn nội sinh 18 3.3.1.1 Thu thập xử lý mẫu 18 3.3.1.2 Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ bắp 19 3.3.2 Quan sát hình thái đo kích thƣớc khuẩn lạc 20 3.3.3 Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn 20 3.3.4 Xác định đặc tính dòng vi khuẩn nội sinh 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập 24 4.1.1 Phân lập vi khuẩn 24 4.1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 26 4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 27 4.1.2.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 28 4.2 Khả phát triển dịng vi khuẩn từ mơi trƣờng NFb môi trƣờng LGI sang môi trƣờng Burk’s không đạm khả cố định đạm dòng vi khuẩn 29 4.2.1 Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập 29 4.2.2 Khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập 30 4.3 Khả phát triển dòng vi khuẩn từ môi trƣờng NFb môi trƣờng LGI sang mơi trƣờng NBRIP khả hịa tan lân dòng vi khuẩn 33 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC iii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Hàm lƣợng dinh dƣỡng loại hạt Bảng Công thức môi trƣờng LGI (Cavalcante Dưbereiner, 1988) 15 Bảng Cơng thức mơi trƣờng NFb (Krieg Dưbereiner, 1984) 16 Bảng Công thức môi trƣờng Burk’s N-free (Park et al., 2005) 17 Bảng Công thức môi trƣờng NBRIP (Nautiyal., 1999) 18 Bảng Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 24 Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập 26 Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 27 Bảng Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trƣờng Burk’s không đạm 29 Bảng 10 Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) dòng vi khuẩn sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi môi trƣờng Burk’s không đạm 31 Bảng 11 Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập môi trƣờng NBRIP đặc 33 Bảng 12 Khả hòa tan P2O5 (mg/l) dòng vi khuẩn sau ngày 10 ngày nuôi môi trƣờng NBRIP lỏng 34 iv DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Sơ đồ xử lý mẫu rễ bắp 19 Hình Vi khuẩn sau 36 ni môi trƣờng bán đặc 25 Hình Đặc điểm số dạng khuẩn lạc 28 Hình Đƣờng chuẩn đo đạm 30 Hình Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian 32 Hình Khả hịa tan P2O5 (mg/l) dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian 35 v CÁC TỪ VIẾT TẮT CV: Coefficient of variation Df: degree of freedom LSD: Least Significant Difference MS: Mean Square SS: Sum of Square VK: Vi khuẩn DC: Đối chứng vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU Bắp (danh pháp khoa học: Zea mays L.) xem loại ngũ cốc vàng lương thực quan trọng đứng thứ hai sau lúa nước ta khơng đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm người từ thuở sơ khai mà nguồn dinh dưỡng tiềm góp phần ngăn ngừa triệu chứng bệnh lý động mạch Bắp trồng khắp nơi, từ đồng đến trung du nhiều miền núi Cuộc cách mạng giống bắp lai góp phần tăng nhanh diện tích, suất sản lượng bắp toàn quốc, đưa nước ta vào hàng ngũ nước trồng bắp lai tiên tiến vùng châu Á Những năm trở lại sản xuất bắp ý bắp lương thực mà sử dụng làm thức ăn gia súc cấu nông nghiệp chuyển dịch theo hướng giảm dần tỷ trọng ngành trồng trọt tăng tỷ trọng ngành chăn nuôi nên nhu cầu bắp lớn Mục tiêu ngành nông nghiệp năm tới phấn đấu xây dựng vùng trồng bắp hàng hoá khu vực: vùng Trung Du Miền Núi phía Bắc, vùng đồng sơng Hồng, Đơng Nam Bộ, Tây Nguyên Phát triển bắp đông đất lúa nơi có điều kiện phù hợp, có đủ nước tưới Đây hướng tích cực chuyển dịch cấu sản xuất theo hướng thâm canh tăng vụ, góp phần tăng sản lượng lương thực vững đặc biệt khu vực dân cư miền núi Hiện diện tích trồng bắp nước gần 1,2 triệu ha, suất trung bình 43 tạ/ ha, sản lượng giao động khoảng 4,5 - triệu tấn/năm, nhu cầu bắp nước ta triệu tấn/ năm kể cho chế biến lương thực chăn nuôi, tổng sản lượng bắp sản xuất chưa đủ cho nhu cầu nước, hàng năm phải nhập nửa triệu Đây điều kiện thuận lợi để sản xuất bắp phát triển mở rộng Điều kiện tự nhiên Việt Nam hồn tồn thích hợp cho sản xuất bắp, đặc biệt vùng miền núi điều kiện canh tác lúa bị hạn chế Trong tương lai, sản xuất đủ cho nhu cầu nội địa, chắn bắp mặt hàng xuất nước ta giống lúa gạo, nhu cầu lương thực chế biến giới ngày tăng, nhiều nước giới sử dụng bắp lương thực chính, giống bắp trồng Việt Nam có chất lượng tốt Bắp có nhiều công dụng Tất phận bắp từ hạt, đến thân, sử dụng để làm lương thực, thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp (rượu bắp, sản xuất ethanol để chế biến xăng sinh học…), số phận bắp có chứa số chất có vai trị loại thuốc chữa bệnh,… Bắp có giá trị dinh dưỡng cao, sinh trưởng mạnh, thích nghi với nhiều loại đất nhờ có mặt vi khuẩn nội sinh (endophytic bacteria) Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ để sống bên mô thực vật mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với chủ; trái lại chúng xúc tiến sinh trưởng chủ Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường tăng trưởng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) (Barbieri et al., 1986), tăng hàm lượng chất khoáng, tăng khả kháng nhiều nguồn bệnh khác (Fashey et al., 1991; Bandara et al., 2006), giúp cố định đạm sinh học, giảm tính mẫn cảm với mầm bệnh thay đổi thời tiết gây tổn hại cho Sự phát triển vi khuẩn nội sinh có ích trung tâm nghiên cứu giới mở viễn cảnh tốt đẹp vận dụng vi khuẩn nội sinh vào việc tăng cường sản phẩm nông nghiệp nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học cung cấp cho trồng giúp cho việc xây dựng nông nghiệp bền vững xanh Mục tiêu nghiên cứu đề tài : - Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ bắp trồng huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa - Vũng Tàu - Xác định khả cố định đạm hịa tan lân khó tan dịng vi khuẩn nội sinh phân lập CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc bắp Bắp hay cịn gọi Ngơ (danh pháp khoa học: Zea mays L.) loại lương thực canh khu vực Trung Mỹ sau lan tỏa khắp châu Mỹ Bắp gieo trồng phần cịn lại giới sau có tiếp xúc người châu Âu với châu Mỹ vào cuối kỷ 15, đầu kỷ 16 Ở Việt Nam bắp có nguồn gốc từ Trung Quốc Theo Lê Quý Đôn “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi (1662-1762), Trần Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) sang sứ nhà Thanh lấy giống bắp đem nước Khắp hạt Sơn Tây dùng bắp thay cho lúa gạo Từ bắp phổ biến phát triển khắp đất nước Nhà nơng có câu: “Được mùa phụ ngơ khoai”, điều đủ để thấy rằng, năm tháng có đủ lúa gạo bắp giữ vai trò quan trọng người nơng dân Có nhiều loại bắp, thường xếp vào loại khác tính chất cơng dụng bắp nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, bắp tẻ (hạt màu trắng vàng), cứng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc Hai loại bắp đường (hạt màu vàng không đều), vị bắp rau (bắp nhỏ, tinh bột) dùng để ăn Bắp lương thực gieo trồng nhiều châu Mỹ (chỉ riêng Hoa Kỳ sản lượng khoảng 270 triệu năm) Các giống bắp lai ghép nông dân ưa chuộng so với giống bắp thơng thường có suất cao có ưu giống lai Trong vài giống bắp cao tới 7m số nơi, giống bắp thương phẩm tạo với chiều cao khoảng 2,5m Bắp (Zea mays var rugosa hay Zea mays var saccharata) thông thường thấp so với giống bắp khác Các giống bắp nếp, bắp ngựa nước ta có hàm lượng tinh bột cao, lượng đường Trong giống bắp Mỹ châu Âu thường lai tạo để có lượng tinh bột ít, độ cao (họ gọi sweetcorn) 4.1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dịng vi khuẩn phân lập Dòng vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Chuyển Hình dạng động NA2 Que ngắn ++ Trắng Không Răng cưa Lài 1,5 NA3a Que ngắn +++ Trắng Tròn Nguyên Lài NA3b Que ngắn +++ Trắng đục Tròn Nguyên Mơ NA3c Que ngắn ++ Trắng đục Trịn Răng cưa Mô NST Que ngắn +++ Trắng đục Không Răng cưa Lài 1,5 NTT1 Que ngắn ++ Trắng đục Tròn Răng cưa Lài 0,5 NTT2 Que ngắn +++ Trắng đục Tròn Nguyên Mô 0,5 NTB1 Que ngắn ++ Trắng đục Trịn Ngun Mơ NTB2 Que ngắn +++ Trắng Không Răng cưa Lài 1,5 10 LA2 Que ngắn ++ Trắng đục Không Răng cưa Lài 11 LA3b Que ngắn +++ Trắng đục Tròn Răng cưa Lài 12 LA3d Que ngắn ++ Trắng Không Nguyên Lài 13 LTT1 Que ngắn ++ Vàng cam Trịn Răng cưa Mơ 14 LTT2 Que ngắn +++ Vàng nhạt Không Răng cưa Lài 15 LTT3 Que ngắn ++ Trắng Tròn Răng cưa Mô 16 LTB Que ngắn ++ Vàng đục Tròn Răng cưa Lài Số TT Màu sắc Đặc điểm khuẩn lạc Độ Hình dạng Dạng bìa (++) chuyển động nhanh; (+++) chuyển động nhanh ĐK: Đường kính khuẩn lạc vi khuẩn sau 24 cấy môi trường phân lập 26 ĐK (mm) 4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng Màu sắc Dạng bìa Độ Số lượng Tỷ lệ % Trịn 10 62,5 Không 37,5 Trắng 31,25 Trắng đục 50,00 Vàng cam 6,25 Vàng nhạt 6,25 Vàng đục 6,25 Răng cưa 11 68,75 Nguyên 31,25 Mô 37,5 Lài 10 62,5 Hình dạng khuẩn lạc: Khuẩn lạc vi khuẩn phần lớn có dạng hình trịn khơng Trong số 16 dòng vi khuẩn phân lập dòng vi khuẩn có khuẩn lạc hình trịn chiếm cao 10/16 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 62,5%) khuẩn lạc có dạng khơng chiếm 6/16 (chiếm tỷ lệ 37,5%) Màu sắc khuẩn lạc: Đa số dòng vi khuẩn phân lập có màu trắng trắng đục; số khuẩn lạc có màu vàng nhạt, vàng cam vàng đục Trong tổng số dòng vi khuẩn phân lập, 8/16 dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm tỷ lệ 50,%; 5/16 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu trắng trong, chiếm tỷ lệ 31,25%; 1/16 dịng vi khuẩn có màu vàng nhạt, vàng cam, vàng đục dòng chiếm tỷ lệ 6,25%; Tuy nhiên, số dòng vi khuẩn sau cấy trữ lâu ngày khuẩn lạc chuyển từ màu trắng đục sang màu vàng nhạt vàng cam Dạng bìa khuẩn lạc: Phần lớn dịng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc dạng bìa cưa cịn lại khuẩn lạc có bìa dạng ngun Trong số 16 dịng vi khuẩn 27 phân lập 11/16 dịng vi khuẩn có bìa dạng cưa, chiếm tỷ lệ 68,75%; 5/16 dịng vi khuẩn có bìa dạng nguyên, chiếm tỷ lệ 31,25% Độ khuẩn lạc: Trong tổng số 16 dòng vi khuẩn phân lập dịng vi khuẩn với độ lài chiếm đa số với 10 dòng vi khuẩn, chiếm tỷ lệ 62,5%; cịn lại dịng với độ mơ, chiếm tỷ lệ 37,5% Đường kính khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập dao động từ 0,5-2 mm sau cấy môi trường đặc ủ 300C 24 Khuẩn lạc Hình Đặc điểm số dạng khuẩn lạc, ngày 05/08/2012 (A) Khuẩn lạc có màu vàng cam, dạng trịn, bìa cưa, độ mơ (B) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng trịn, bìa ngun, độ mơ (C) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng trịn, bìa cưa, độ lài (D) Khuẩn lạc có màu trắng trong, khơng đều, bìa ngun, độ lài 4.1.2.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn Các dòng vi khuẩn phân lập có số đặc điểm sau: Tất 16 dịng vi khuẩn có dạng que ngắn, chiếm tỉ lệ 100% Khả chuyển động tất dòng vi khuẩn phân lập chuyển động nhanh nhanh Cụ thể tổng số 16 dịng có dịng chuyển nhanh, chiếm tỷ lệ cao 56,25% lại dòng vi khuẩn chuyển động nhanh, chiếm tỷ lệ 43,75% 28 4.2 Khả phát triển dòng vi khuẩn từ môi trƣờng NFb môi trƣờng LGI sang môi trƣờng Burk’s không đạm khả cố định đạm dòng vi khuẩn 4.2.1 Khả phát triển dòng vi khuẩn phân lập Cấy chuyển tất dòng vi khuẩn phân lập môi trường NFb LGI sang môi trường Burk’s không đạm đặc, ủ 300C , kết theo dõi phát triển vi khuẩn trình bày bảng sau: Bảng Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trƣờng Burk’s khơng đạm STT Khả phát triển Dòng vi khuẩn 24 48 72 NA2 ++ ++ ++ NA3a ++ +++ +++ NA3b ++ ++ +++ NA3c ++ ++ +++ NST + ++ ++ NTT1 + + ++ NTT2 + ++ ++ NTB1 ++ ++ ++ NTB2 ++ ++ +++ 10 LA2 ++ +++ +++ 11 LA3b + + ++ 12 LA3d ++ ++ +++ 13 LTT1 ++ +++ +++ 14 LTT2 + ++ ++ 15 LTT3 + + ++ 16 LTB + + ++ 29 4.2.2 Khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập Sau ngày quan sát phát triển vi khuẩn môi trường Burk’s không đạm đặc cho thấy: tất đĩa petri chứa môi trường Burk’s xuất khuẩn lạc, điều cho phép đánh giá sơ dịng vi khuẩn có khả cố định đạm Để đánh giá xác khả cố định đạm dòng vi khuẩn cần tiến hành định lượng lượng NH4+ dòng vi khuẩn tạo phương pháp phenol-nitropruside Khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập thể qua mức hấp thụ quang phổ mẫu đo Những mẫu có màu xanh đậm mức hấp thụ quang phổ lớn khả tổng hợp đạm cao Hình Đƣờng chuẩn đo đạm ( ngày 16/09/2012) Tính giá trị trung bình sau lần lặp mẫu đo sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi vi khuẩn môi trường Burk’s kết thu sau: 30 Bảng 10 Khả tổng hợp NH4+ (mg/l) dòng vi khuẩn sau ngày, ngày, ngày ngày nuôi môi trƣờng Burk’s không đạm Nghiệm thức Ngày Ngày Ngày Ngày Trung bình NA2 0,00 1,63 0,32 0,00 0,49 NA3a 0,00 2,17 0,32 0,00 0,56 NA3b 0,00 2,50 0,26 0,00 0,69 NA3c 0,00 1,77 0,28 0,00 0,51 NST 0,00 1,87 0,28 0,00 0,54 NTT1 0,00 1,71 0,16 0,00 0,47 NTT2 0,00 1,62 0,00 0,00 0,41 NTB1 0,00 1,57 0,34 0,00 0,48 NTB2 0,00 1,65 0,31 0,00 0,49 LA2 0,00 2,03 0,31 0,75 0,77 LA3b 0,00 0,64 0,51 0,38 0,38 LA3d 0,00 1,60 0,04 0,00 0,41 LTT1 0,00 1,82 0,11 0,23 0,54 LTT2 0,00 2,82 0,28 0,38 0,87 LTT3 0,00 0,72 0,14 0,17 0,26 LTB 0,00 1,77 0,04 0,00 0,45 DC 0,00 0,16 0,00 0,00 0,04 CV% 0,00 4,02 43,08 112,22 8,39 LSD(0,01) 0,00 0,04 0,06 0,07 0,05  DC : đối chứng Sau tính hàm hượng NH4+ trung bình qua đợt đo 16 dịng vi khuẩn, kết có 16/16 dịng vi khuẩn phân lập có khả cố định đạm chiếm 100% (so với kết mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn mức ý nghĩa 1%) 31 Khả tổng hợp đạm vi khuẩn có biến động theo thời gian, hầu hết dòng vi khuẩn phân lập tổng hợp đạm đạt mức cao ngày nuôi thứ giảm dần ngày nuôi Vì vi khuẩn tổng hợp đạm lượng đạm mà vi khuẩn tổng hợp môi trường nhiều lượng đạm ức chế lại vi khuẩn phát triển, thời gian ngưng tổng hợp đạm vi khuẩn sử dụng lượng đạm tổng hợp đến lượng đạm mơi trường khơng cịn ức chế lại vi khuẩn vi khuẩn tiếp tục tổng hợp đạm Đối với vi khuẩn nội sinh thực vật có khả cố định đạm vi khuẩn sử dụng lượng nhỏ phần đạm tổng hợp phần lại thực vật sử dụng Đa số dòng vi khuẩn phân lập có khả cố định đạm hiệu khơng cao (dưới mg/l) Một vài dịng vi khuẩn lại có khả cố định đạm tốt, hàm lượng NH4+ tổng hợp cao (trên mg/l) sau ngày chủng vi khuẩn cụ thể dòng NA3b (2,50 mg/l), NA3a (2,17 mg/l), LA2 (2,03 mg/l), LTT2 (2,82 mg/l) có khác biệt thống kê mức ý nghĩa 1% so với đối chứng (DC)(0 mg/l) Tuy nhiên, tiến hành đo ngày thứ ngày thứ số dịng khơng cịn tổng hợp NH4+ (hàm lượng NH4+ = mg/l) NA3a Hàm lượng amonium (mg/l) NA3b 2,5 LA2 LTT2 DC 1,5 0,5 Ngày Ngày Ngày Ngày Thời gian + Hình Khả tổng hợp NH4 (mg/l) dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian Như vậy, dòng vi khuẩn nội sinh rễ bắp cố định đạm mạnh ngày thứ sau chủng vào mơi trường Burk’s khơng đạm dịng vi khuẩn cố định đạm mạnh gồm dòng phân lập huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai, dòng phân lập Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa-Vũng Tàu 32 4.3 Khả phát triển dịng vi khuẩn từ mơi trƣờng NFb mơi trƣờng LGI sang mơi trƣờng NBRIP khả hịa tan lân dòng vi khuẩn Để tiến hành đo khả hịa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập cần cấy chuyển dịng vi khuẩn mơi NBRIP đặc ủ 300C để đánh giá sơ khả phát triển khả hịa tan lân khó tan Bảng 11 Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trƣờng NBRIP đặc STT Khả phát triển Dòng vi khuẩn 24 48 72 NA2 + ++ ++ NA3a + ++ ++ NA3b ++ + + NA3c ++ ++ +++ NST ++ ++ ++ NTT1 + + ++ NTT2 + ++ +++ NTB1 + + ++ NTB2 ++ ++ +++ 10 LA2 ++ +++ +++ 11 LA3b ++ ++ ++ 12 LA3d +++ ++ ++ 13 LTT1 ++ +++ +++ 14 LTT2 + ++ +++ 15 LTT3 ++ ++ ++ 16 LTB + ++ +++ Qua kết kiểm tra khả phát triển khuẩn lạc vi khuẩn phân lập tất 16 dịng vi khuẩn có khả phát triển môi trường NBRIP đặc 33 Tiếp tục cấy vi khuẩn vào môi trường NBRIP lỏng để định lượng lượng P 2O5 dòng vi khuẩn hòa tan phương pháp Oniani Khả hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập thể qua mức hấp thụ quang phổ mẫu đo Những mẫu có màu xanh mức hấp thụ quang phổ lớn khả hòa tan lân cao Sau lần lặp tính giá trị trung bình mẫu đo sau ngày 10 ngày nuôi vi khuẩn môi trường NBRIP lỏng kết thu sau: Bảng 12 Khả hòa tan P2O5 (mg/l) dòng vi khuẩn sau ngày 10 ngày nuôi môi trƣờng NBRIP lỏng Nghiệm thức Ngày Ngày 10 Trung bình NA2 9,55 14,80 12,17 NA3a 13,10 12,63 12,87 NA3b 14,00 19,14 16,57 NA3c 21,75 22,78 22,26 NST 3,30 5,83 4,56 NTT1 16,27 16,16 16,21 NTT2 17,83 10,98 14,40 NTB1 21,55 23,88 22,72 NTB2 18,11 24,33 21,22 LA2 28,34 14,69 21,51 LA3b 15,39 25,42 20,41 LA3d 17,16 13,44 15,30 LTT1 24,94 26,46 25,70 LTT2 13,88 21,82 17,85 LTT3 2,98 1,38 2,18 LTB 15,22 19,57 17,40 DC 1,40 1,75 1,57 CV% 9,30 7,15 8,32 LSD(0,01) 0,90 0,75 2,29 34 Kết có 16/16 dịng vi khuẩn phân lập có khả hịa tan lân chiếm 100% (so với kết mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn mức ý nghĩa 1%) Các dòng vi khuẩn phân lập có khả hịa tan lân hiệu cao ngày thứ Cụ thể dòng NA3c (21,75 mg/l), LA2 (28,34 mg/l), LTT1 (24,94 mg/l) tiếp tục đo ngày thứ 10 khả hịa tan lân số dịng vi khuẩn phân lập giảm xuống khơng đáng kể Hàm lượng lân hòa tan (mg/l) 30 25 20 NTB1 NTB2 15 LA3b LTT1 10 DC Ngày Ngày 10 Thời gian Hình Khả hịa tan P2O5 (mg/l) dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian Tuy nhiên, vài dòng vi khuẩn lại tiếp tục hòa tan lân tốt ngày 10 Cụ thể dòng LA3b (15,39 - 25,42 mg/l) phân lập huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai dòng NTB1 (21,55 – 23,88 mg/l), NTB2 (18,11 – 24,33 mg/l), LTT2 (13,88 – 21,82 mg/l) phân lập Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa-Vũng tàu có khác biệt thống kê mức ý nghĩa 1% so với đối chứng (DC)(0 mg/l) 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Từ mẫu rễ bắp trồng đất tỉnh Đồng Nai mẫu rễ bắp trồng đất tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu phân lập 16 dịng vi khuẩn Trong dịng vi khuẩn mơi trường NFb, dịng vi khuẩn mơi trường LGI - Có dịng vi khuẩn có khả tổng hợp đạm cao bao gồm: dòng NA3b (2,50 mg/l), NA3a (2,17 mg/l), LA2 (2,03 mg/l) phân lập huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai dòng LTT2 (2,82 mg/l) phân lập Thị Trấn Đất Đỏ tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu Và dịng vi khuẩn có khả hịa tan lân cao bao gồm: dòng LA3b (25,42 mg/l) phân lập huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai dòng NTB1 (23,88 mg/l), NTB2 (24,33 mg/l), LTT1 (26,46 mg/l) phân lập Thị Trấn Đất Đỏ tỉnh Bà Ria-Vũng Tàu 5.2 Đề nghị Giải trình tự để định danh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập có khả cố định đạm cao hịa tan lân khó tan tốt Tiếp tục phân lập khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh rễ bắp địa phương khác Ứng dụng vi khuẩn nội sinh có khả cố định đạm cao hịa tan lân khó tan tốt để làm phân bón phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Cao Ngọc Điệp Nguyễn Văn Được 2004 Hiệu phân lân sinh học đậu nành bắp lai trồng đất phù sa huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 1, 98-104 Cao Ngọc Điệp 2005 Hiệu chủng vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) vi khuẩn Pseudomomnas spp đậu nành Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ, Trường Đại học Cần Thơ 3, tr.40-48 Cao Ngọc Điệp Bùi Thị Kiều Oanh 2006 Hiệu vi khuẩn Pseudomonas ssp suất tổng trữ đường mía đường (Saccharum officinarum L) trồng đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 6, 69-76, NXB Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp, Phạm Khánh Vân Lăng Ngọc Dậu 2007 Phát vi khuẩn Azospirillum lipoferum nội sinh lúa mùa đặc sản (Oryza sativa L.) trồng vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Những vấn đề khoa học sống, tr.456-459 Cao Ngọc Điệp 2008 Giáo trình vi sinh chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp 2010 Sách chuyên khảo vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria), Trường Đại học Cần Thơ Đặng Thị Huỳnh Mai 2001 Phân lập vi sinh vật hịa tan lân khó tan Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 4, tr.353-357 Nguyễn Hữu Hiệp 2008 Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh qui mơ thí nghiệm cho mía trồng Tỉnh Sóc Trăng Tạp chí ngiên cứu khoa học Cần Thơ 8, tr.149-157 Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp 2009 Phân lập khảo sát đặc tính dịng vi khuẩn nội sinh số cỏ chăn nuôi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2), tr.241-250 37 TIẾNG ANH Bandara, W M M S., Gamini Seneviratne and S A Kulasooriya 2006 Interactions among endophytic bacteria and fungi: effects and potentials J Biosci 31, pp 645-650 Barbieri, Zanelli, Enrica Galli and Giuliana Zanetti 1986 Wheat inoculation with Azospirillum brasilense sp And some mutants altered in nitrogen fixation and indole3-acetic acid production FEMS Microbiology Letters 36, pp 87-90 Beijerinck, M W 1923 Die bakterien der Papilionaceenkollchen Botan Ztg 46, pp 726804 Bremner J M 1996 Chemical methods (Part 3) Methods of soil Analysis, Published by Soil Science Society of Agronomy, Inc Madison, Wisconsin, USA, pp 85-128 Carro-López, R., N Campos-Reales, C Elmerich and B E Baca 2000 Physiological evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense Mol Gen Genet 264, pp 521-530 Cavalcante, Vladimir A and J Döbereiner 1988 A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane Plant and Soil 108, pp.23-31 Döbereiner, J 1974 Nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere In The biology of nitrogen fixation, ed A Quispel, Amsterdam, The Netherlands: North Holland Publishing Company, pp.86-120 Döbereiner, J 1992 History and new perspectives of diazotrophs in association with nonleguminous plants Symbiosis 13, pp.1-13 Elmerich, C 2007 Historical perspective: From bacterization to endophytes Goldstein, A H 1986 Bacteria solubilization of mineral phosphates: Historycal perspective and future prospects American Journal of Alternative Agriculture Volume 1, issure 2, pp 51-57 Hamdia, H M H M El-Komy, M Shaddad and A M Hetta 2005 Effect off molybdenum of nitrogenase activities of wheat inoculated with Azospirillrum brasillense growth under drought stress Gen Appl Plant Physiology 31: 43-54 Hwangbo, H., R D Park, Y W Kim, Y S Rim, K H Park, T H Kim, J S Suh and K Y Kim 2003 2-ketogluconic acid production and phosphate solubilization by Enterobacter intermedium Cur Microbiol 47, pp.87-92 38 Illmer, P and F Schinner 1995 Solubilization of inorganic phosphates by microorganisms isolated from forest soil Soil Biology and Biochemistry 24, pp 389-395 Kobayashi, D Y and J D Palumbo 2000 Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture Microbial Endophytes, pp.199-213 Krieg N R., Döbereiner J 1984 Genus Azospirillum In: Bergey’s manual of systematic bacteriology 1, Murray et al (eds), pp 94-103 Lind Berg and Granhall U L F 1984 Isharolation and characterization of dinitrogen – fixing bacteria from the rhizosphere of temperate cereals and forage grasses, Appl Environ Microbiol 48, pp 683 – 689 Muthukumarasamy R., G Revathi, S Seshadri and C Laskshminarsimhan, (2002), « Gluconacetobacter diazotrophicus (Syn Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte intropics », Curr Sci, 83, pp 137-145 Nautiyal, C S., (1999), “An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms” FEMS Microbiology Letters, 170, pp 265270 Park, M., C Kim, J Yang, H Lee, W Shin, S Kim and T Sa, (2005), “ Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea”, Microbiological Research, 160, pp 127-133 Pillay, V K and J Nowak, (1997), “Inoculum density, temperature and genotype effects on invitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato (Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a Pseudomonad bacterium”, Can J Microbiol, 43, pp 354-361 Quispel, A., (1992), “A search of signals in endophytic microorganisms”, In: Molecular signals in plant- microble communications, pp 471-491 Tan, Z., T Hurek and B Reinhold-Hurek, (2003), “Effect of N-ferlitization, plant genotype and eviromental conditions on NifH gên pools in roots of rice” Environ Microbiol, 5, pp 1009-1015 Zinniel, D K., P Lambrecht, N B Harris, Z Feng, D Kuczmarski, P Higley et al., (2002), “ Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants”, Applied and Environment Microbiology, 68, pp 2198-2208 39 TRANG WEB http://ngo.vaas.org.vn/nguongoccayngoovietnam.php, (2/7/2012) http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacte, (4/7/2012) http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella, (4/7/2012) http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%B4_(h%E1%BB%8D), (2/7/2012) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12541509.htm, (4/7/2012) 40 ... LUẬN 4.1 Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập 4.1.1 Phân lập vi khuẩn Từ mẫu rễ bắp trồng huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai mẫu rễ bắp trồng Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa -Vũng Tàu phân lập 16... - Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ bắp trồng huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa - Vũng Tàu - Xác định khả cố định đạm hịa tan lân khó tan dòng vi khuẩn nội sinh phân lập. .. động vi khuẩn 20 3.3.4 Xác định đặc tính dịng vi khuẩn nội sinh 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập 24 4.1.1 Phân lập vi khuẩn