Mười sáu dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb và môi trường LGI từ rễ cây bắp trồng ở đất huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai và Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa – Vũng Tàu đều có khả năng phát triển trên môi trường Burk’s không đạm và môi trường NBRIP sau 72 giờ nuôi trên môi trường đặc, ủ ở 300C. Kiểm tra khả năng tổng hợp đạm trên môi trường Burk’s lỏng và khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng, kết quả có 1616 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm chiếm tỉ lệ 100% và 1616 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan chiếm tỉ lệ 100%.
GIỚI THIỆU
Bắp (Zea mays L.) được coi là ngũ cốc vàng và là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa tại Việt Nam, cung cấp thực phẩm thiết yếu và nguồn dinh dưỡng tiềm năng giúp ngăn ngừa bệnh lý động mạch Bắp được trồng rộng rãi từ đồng bằng đến miền núi, với cuộc cách mạng giống bắp lai đã nâng cao diện tích và năng suất, đưa Việt Nam vào nhóm các nước trồng bắp lai tiên tiến ở châu Á Gần đây, sản xuất bắp ngày càng được chú trọng không chỉ vì vai trò lương thực mà còn phục vụ nhu cầu thức ăn gia súc, trong bối cảnh cơ cấu nông nghiệp chuyển dịch từ trồng trọt sang chăn nuôi Ngành nông nghiệp đặt mục tiêu phát triển vùng trồng bắp hàng hóa tại các khu vực như Trung Du Miền Núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, đồng thời khuyến khích phát triển bắp đông trên đất lúa ở những nơi có điều kiện thuận lợi, góp phần tăng sản lượng lương thực bền vững, đặc biệt cho khu vực miền núi.
Hiện nay, diện tích trồng bắp ở Việt Nam đạt gần 1,2 triệu ha với năng suất trung bình 43 tạ/ha, sản lượng hàng năm dao động từ 4,5 đến 5 triệu tấn Tuy nhiên, nhu cầu về bắp trong nước vượt quá 5 triệu tấn, bao gồm cả chế biến lương thực và chăn nuôi, dẫn đến việc hàng năm Việt Nam phải nhập khẩu hơn nửa triệu tấn bắp Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển sản xuất bắp Với điều kiện tự nhiên phù hợp, đặc biệt là ở các vùng miền núi nơi canh tác lúa bị hạn chế, Việt Nam có tiềm năng lớn để mở rộng sản xuất bắp.
Trong tương lai, khi sản xuất bắp đáp ứng đủ nhu cầu nội địa, Việt Nam có khả năng trở thành một trong những nước xuất khẩu bắp hàng đầu, tương tự như lúa gạo Nhu cầu lương thực và chế biến trên toàn cầu ngày càng gia tăng, nhiều quốc gia đang sử dụng bắp làm lương thực chính Các giống bắp trồng tại Việt Nam đều đạt chất lượng tốt, tạo điều kiện thuận lợi cho xuất khẩu.
Bắp là cây có nhiều công dụng quý giá, với tất cả các bộ phận từ hạt, thân đến lá đều có thể sử dụng làm lương thực, thực phẩm cho con người và thức ăn cho gia súc Ngoài ra, bắp còn được dùng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp, như sản xuất rượu bắp và ethanol để chế biến xăng sinh học Một số bộ phận của bắp cũng chứa các chất có tác dụng như thuốc chữa bệnh.
Bắp có giá trị dinh dưỡng cao và khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhờ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh trong cây Những vi khuẩn này xâm nhập vào rễ mà không gây hại, ngược lại, chúng thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách tổng hợp hormone auxin (IAA), tăng cường hàm lượng khoáng chất và khả năng kháng bệnh Vi khuẩn nội sinh còn giúp cố định đạm sinh học và giảm nhạy cảm với mầm bệnh cũng như biến đổi khí hậu Sự phát triển của loại vi khuẩn này tại các trung tâm nghiên cứu toàn cầu mở ra cơ hội ứng dụng vào nông nghiệp, giảm sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hóa học, từ đó xây dựng nền nông nghiệp bền vững, xanh và sạch.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :
- Phân lập được những dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ cây bắp trồng ở huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai và Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa - Vũng Tàu
- Xác định khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của những dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập được.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Sơ lƣợc về cây bắp
Bắp, hay còn gọi là Ngô (Zea mays L.), là một loại cây lương thực có nguồn gốc từ Trung Mỹ và đã lan rộng ra khắp châu Mỹ sau khi người châu Âu tiếp xúc với vùng đất này vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16 Tại Việt Nam, bắp có nguồn gốc từ Trung Quốc, được đưa về bởi Trần Thế Vinh trong thời kỳ Khang Hi (1662-1762) Từ đó, bắp đã trở thành một phần quan trọng trong đời sống nông nghiệp, đặc biệt ở Sơn Tây, nơi người dân đã thay thế lúa gạo bằng bắp Câu nói “Được mùa chớ phụ ngô khoai” cho thấy vai trò thiết yếu của bắp trong nền kinh tế nông nghiệp, dù lúa gạo đã đủ đầy.
Có nhiều loại bắp được phân loại dựa trên tính chất và công dụng, bao gồm bắp nếp (hạt màu trắng, dẻo) chủ yếu dùng để ăn, và bắp tẻ (hạt màu trắng hoặc vàng) cứng, thường được sử dụng làm thức ăn cho gia súc Ngoài ra, còn có bắp đường (hạt màu vàng không đều, vị ngọt) và bắp rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) cũng được tiêu thụ Bắp là cây lương thực phổ biến nhất tại châu Mỹ.
Sản lượng bắp hàng năm đạt khoảng 270 triệu tấn, với các giống bắp lai ghép được nông dân ưa chuộng hơn nhờ năng suất cao Một số giống bắp có thể cao tới 7m, trong khi giống bắp thương phẩm chỉ cao khoảng 2,5m Bắp ngọt (Zea mays var rugosa hay Zea mays var saccharata) thường thấp hơn so với các giống khác Các giống bắp nếp và bắp răng ngựa tại Việt Nam có hàm lượng tinh bột cao và ít đường, trong khi bắp ở Mỹ và châu Âu được lai tạo để có tinh bột rất ít và độ ngọt cao, được gọi là sweetcorn.
Bảng 1 Hàm lƣợng dinh dƣỡng trong các loại hạt Đơn vị tính: Phần trăm (%)
Tinh bột Protein Lipit Xenluloza Tro Nước
(Nguồn: http://ngo.vaas.org.vn/nguongoccayngoovietnam.php, ngày 02/07/2012)
Bắp chứa khoảng 10,6% protein, chủ yếu là zein, một loại prolamin thiếu lysin và tryptophan Khi kết hợp bắp với đậu đỗ hoặc các nguồn protein động vật, giá trị dinh dưỡng của protein trong bắp sẽ được cải thiện đáng kể.
Whole corn contains 4-5% lipids, primarily concentrated in the germ The fat composition of corn includes 50% linoleic acid, 31% oleic acid, 13% palmitic acid, and 3% stearic acid.
Gluxit: Gluxit trong bắp khoảng 69% chủ yếu là tinh bột Ở hạt bắp non có thêm một số đường đơn và đường kép.
Chất khoáng: Bắp nghèo canxi, giàu photpho
Vitamin trong bắp chủ yếu tập trung ở lớp ngoài hạt và mầm, với nhiều vitamin B1 có lợi Tuy nhiên, hàm lượng vitamin PP tương đối thấp, kết hợp với sự thiếu hụt tryptophan - một acid amin cần thiết để tạo ra vitamin PP - có thể dẫn đến nguy cơ mắc bệnh Pellagre nếu chỉ ăn bắp trong thời gian dài Đặc biệt, bắp vàng giàu caroten, một tiền vitamin A quan trọng cho sức khỏe.
Vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là loại vi khuẩn tồn tại chủ yếu trong cây trồng, không gây hại mà còn hỗ trợ sự phát triển của chúng Chúng đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp, giúp cải thiện năng suất mùa màng.
Vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào rễ cây qua nhiều phương thức khác nhau, bao gồm việc xâm nhập từ các điểm lộ rõ trên rễ, bám vào bề mặt rễ và tìm cách thâm nhập vào rễ chính hoặc các rễ bên.
Reinhold Hurek và Hurek (1998) cho biết rằng vi khuẩn nội sinh như Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Klebsiella, Enterobacter, Pantonae, Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter và Paenibacillus có thể xâm nhập vào rễ cây thông qua các vết nứt trong quá trình hình thành rễ bên, lông hút, hoặc giữa các tế bào nhu mô và biểu bì rễ Ngoài ra, các vi khuẩn này cũng có khả năng xâm nhập qua các vị trí tổn thương trên lá hoặc mô thông qua khí khẩu (Roos và Hattingh, 2007).
1983) Bằng những con đường đó vi khuẩn có thể tiến vào lục lạp của rễ
Khi vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào rễ cây, chúng có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc phân tán khắp cây, đi vào các tế bào bên trong và các khoảng trống gian bào hay hệ mạch, từ đó thúc đẩy quá trình sinh hóa trong cây Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất đa dạng, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, cũng như điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của cây.
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không chỉ không gây hại cho cây chủ mà còn thúc đẩy sự sinh trưởng của cây trồng thông qua việc sản xuất các chất kích thích sinh trưởng như auxin và gibberellin, cũng như khả năng cố định đạm từ không khí.
2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ là khu vực tiếp giáp giữa rễ cây và đất, nơi tích tụ các chất hữu cơ và tạo ra môi trường sống cho vi sinh vật đất Thực vật có khả năng điều chỉnh vùng rễ của mình thông qua việc hấp thụ dinh dưỡng, độ ẩm và oxy, cũng như các chất do rễ tiết ra.
Các dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, điều này giúp tăng cường sự phong phú của vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Dửbereiner, 1974) Ngược lại, vi sinh vật trong vùng rễ có thể tác động đến sự sinh trưởng của cây thông qua ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al., 1983; Harari et al., 1988).
Vi khuẩn nốt rễ không chỉ tồn tại bên trong cây họ đậu mà còn có khả năng xâm nhập vào cây bắp, giúp cố định đạm sinh học để cây bắp có thể sử dụng.
Nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn được phân lập bởi Beijerinck vào năm
Vào năm 1923, vi khuẩn Azospirillum đã được phát hiện và đến năm 1963, Becking đã tái phát hiện chúng Đến năm 1976, Dürbereiner và Day đã mô tả sự liên hợp của các vi khuẩn này với cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau Sau đó, các vi khuẩn này được phân loại thành giống mới mang tên Azospirillum.
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hỡnh que ngắn; kớch thước biến thiờn trong khoảng 0,8-1,7àm chiều rộng và 1,4-
Cỏc loài Azospirillum có sự phân bố sinh thái rộng lớn, gắn liền với đa dạng cây trồng (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005; Van Berkum và Bohlool, 1980) Nghiên cứu vào năm 1984 – 1985 đã phát hiện nhiều loài Azospirillum trong rễ cỏ Kallar (Leptochloa fusca), với khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và cung cấp các chất dinh dưỡng khác (Reinhold et al., 1986; Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003) Ngoài ra, chúng còn sản xuất hormone thực vật và kiểm soát vi sinh vật gây hại cho cây trồng (Vande Broek et al., 1999; Rangarajan et al., 2003).
Vào năm 1966, loài vi khuẩn Azotobacter paspali được Dửbereiner phân lập từ các cây cỏ đang sinh trưởng, đánh dấu một bước quan trọng trong quá trình cố định đạm cộng sinh Loài vi khuẩn này đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang Tuy nhiên, nghiên cứu của Brown vào năm 1976 cho thấy rằng sự cộng sinh giữa Paspalum notatum và A paspali không phải lúc nào cũng cải thiện sự sinh trưởng của cây, mà chủ yếu thông qua việc sản xuất auxin hơn là thông qua quá trình cố định đạm.
Vi khuẩn Burkholderia sống ở vùng rễ của nhiều loại cây như bắp, mía, cà phê, lúa và cỏ, và chúng có khả năng cố định đạm Cụ thể, khi cộng sinh với cây lúa, vi khuẩn Burkholderia có thể cố định tới 19% tổng lượng đạm cần thiết cho cây Năng suất của cây lúa có vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis tương đương với cây lúa không có vi khuẩn này nhưng được bón phân đạm 25-30 kg/ha.
Vi khuẩn Burkholderia là một loại vi khuẩn gram âm có hình dạng xoắn và đường kính khoảng 1µm, có khả năng di chuyển nhờ các chân mao ở đầu Chúng có khả năng cố định đạm và sinh trưởng trong cả điều kiện kỵ khí lẫn hiếu khí, nhưng phát triển tốt nhất trong môi trường ít oxy.
Burkholderia tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2
– 4mm, tròn, phẳng hoặc lài
Vi khuẩn Enterobacter thuộc nhóm – Proteobacteria, chủ yếu là vi khuẩn gram âm hình que và sống kỵ khí không bắt buộc Một số loài trong nhóm này có khả năng cố định đạm và thường cư trú ở vùng rễ hoặc nội sinh trong mô thực vật, góp phần kích thích sự sinh trưởng của cây trồng.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacte, ngày 04/07/2012)
Hwangbo và cộng sự (2003) đã phân lập loài Enterobacter intermedium từ rễ của một số cây cỏ tại Triều Tiên Loài vi khuẩn này có khả năng hòa tan các phosphate khó tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây thông qua cơ chế acid hóa nhờ vào việc sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid.
Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam
Hiện nay, nhiều giống vi khuẩn nội sinh đã được phát hiện, bao gồm Azoarcus, Enterobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, Brudyrhizobium, Azospirillum, Gluconacetobacter, Cellulomonas, Klebsiella, Corynebacterium, Burkholderia và Herbaspirillum Những vi khuẩn này xuất hiện ở các loại cây lương thực, cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ chăn nuôi, góp phần quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe cây trồng và tăng năng suất.
Năm 1958, các nhà khoa học đã tìm thấy Beijerinckia spp ở vùng rễ cây mía
Nghiên cứu của Berg et al (1980) đã chỉ ra rằng Azospirillum cộng sinh ở cây mía có khả năng tăng cường hoạt tính của enzyme nitrogenase, từ đó nâng cao tỷ lệ tổng hợp đạm của cây.
Năm 1988, Cavalcante và Dửbereine đã phân lập vi khuẩn cố định đạm Acetobacter diazotrophicus từ rễ và thân cây mía ở Brazil Gần đây, các nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn này có khả năng tổng hợp hormone tăng trưởng, auxin và gibberellin, cũng như làm giảm pH môi trường để hòa tan lân (Muthukumarasamy et al., 2002) Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phát hiện ở cây cà phê, gari, khóm và lúa (Loganathan và Nair, 2003) Tại Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy Enterobacter và Bacillus trong vùng rễ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi (Lindberg và Granhall, 1984) Ở Nhật Bản, các nghiên cứu đã xác định được sự hiện diện của các vi khuẩn nội sinh.
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbeltagy et al.,2001)
Nghiên cứu về vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia trên cây lúa cho thấy các vi khuẩn này có khả năng cố định đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho cây (Verma et al., 2001) Tại Mỹ, sau hơn 6 năm nghiên cứu trên 4 loại cây nông nghiệp (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì) cùng 27 loài cỏ tự nhiên, các nhà khoa học đã xác định được 15 giống vi khuẩn nội sinh, bao gồm Agrobacterium, Bacillus, Bradirhizobium, Erwinia và Cellulomonas.
Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas là những loại vi khuẩn được nghiên cứu, trong đó số lượng vi khuẩn gram dương và gram âm tương đương nhau (Zinniel et al., 2002) Tại Ấn Độ, nghiên cứu trên bốn loài lúa trồng đã phát hiện vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen Nif (Muthukumarasamy et al., 2005) Ở Việt Nam, nghiên cứu về các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp hormone IAA ở cây nông nghiệp đã được thực hiện nhiều trong những năm gần đây Tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ, Cao Ngọc Điệp et al (2007) đã tiến hành phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn này.
Nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2005) đã sử dụng kỹ thuật PCR để xác định sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum từ rễ và thân lúa trồng Đồng thời, ông cũng đã khảo sát tác động của vi khuẩn nốt rễ Sinorhizobium fredii đến sự phát triển của cây lúa.
Pseudomonas sp trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm số trái lép trên cây
Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al (2008) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng tại huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh ở rễ cây bắp.
Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân có mối liên hệ chặt chẽ với thực vật, hình thành các tập đoàn mô bên trong cây chủ Chúng thường không gây hại cho sinh vật chủ và được coi là công cụ hữu ích trong nông nghiệp, giúp cải thiện năng suất cây trồng nhờ vào các đặc tính sinh học tích cực của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002).
2.4.1 Khả năng cố định đạm Đạm là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của sinh vật bởi vì nó thường là chất dinh dưỡng đầu tiên hạn chế sự sinh trưởng của sinh vật trong các hệ sinh thái Trong nông nghiệp năng suất của cây trồng được cung cấp chủ yếu bằng cách dùng các phân đạm vô cơ, mà phân này thì đắc đỏ và có hại cho môi trường (Muthukumarasamy et al., 2005) Từ các viễn cảnh về sinh thái và kinh tế, sự cố định đạm sinh học do sự liên kết giữa vi khuẩn với cây trồng là điều mong đợi thiết yếu, nhất là đối với các cây có giá trị kinh tế quan trọng
Sự cố định đạm sinh học chỉ giới hạn ở sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và
Archaea là nhóm vi sinh vật có khả năng sống tự dưỡng hoặc dị dưỡng, trong đó quá trình cố định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu từ carbohydrate do cây chủ cung cấp Nguồn năng lượng dồi dào sẽ dẫn đến sản lượng đạm cố định cao hơn Quá trình cố định đạm sinh học, với khâu then chốt là sự khử liên kết N2 thành NH3, phụ thuộc vào năng lượng ATP và sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase cùng enzyme hydrogenase.
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N 2 thành NH 3 theo công thức sau:
Ammonia (NH3) được sản xuất trong quá trình kết hợp với chuỗi carbon, từ đó đồng hóa thành các axit amin đầu tiên cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Đánh giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được phân lập là một bước quan trọng trong việc phân loại chúng.
Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy đặc, bán đặc hoặc lỏng không đạm thường không cung cấp đủ bằng chứng cho hoạt tính cố định đạm của chúng Các điều kiện sinh lý cần thiết cho hoạt động của enzyme nitrogenase và việc phát hiện hoạt tính này qua thử nghiệm khử acetylene có thể không đạt được kết quả như mong muốn hoặc không thuyết phục (Postage, 1981).
Theo Klucas (1991), để quá trình cố định đạm nội sinh diễn ra hiệu quả, cần cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng từ cây chủ và điều kiện môi trường phù hợp Sự hiện diện của các gen Nif trong bộ gen của vi khuẩn được coi là chỉ thị đáng tin cậy để phân loại vi khuẩn cố định đạm (Elmerich, 2007).
2.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan
Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Mặc dù lân có mặt trong đất, nhưng hàm lượng sẵn có cho sự sinh trưởng thực vật thường rất thấp, chỉ khoảng 0,05% (w/w) Trong đó, chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị thực sự cho cây.
Thiếu lân trong đất là một yếu tố quan trọng hạn chế sự sinh trưởng của thực vật Để tối ưu hóa năng suất cây trồng, người ta thường sử dụng các dạng phân lân dễ tan Tuy nhiên, khi bón vào đất, các dạng phân lân này dễ bị kết tủa thành các dạng không hòa tan, gây ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng phân bón.
CaHPO4, Ca3(PO4)2, FePO4 và AlPO4 là những dạng photpho khó hấp thụ đối với cây trồng (Omar, 1998), dẫn đến việc bón phân lân quá mức cho phép Việc này không chỉ gây ô nhiễm môi trường mà còn làm đất bị hoang hóa và xói mòn, đồng thời gây ra những vấn đề kinh tế nghiêm trọng.
Nghiên cứu của Đặng Thị Huỳnh Mai (2001) chỉ ra rằng nhiều vi sinh vật được phân lập từ đất ở đồng bằng sông Cửu Long có khả năng hòa tan lân, trong đó nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế hơn so với nấm Tuy nhiên, nấm lại thể hiện hiệu quả cao hơn trong quá trình hòa tan lân.
Các vi sinh vật hòa tan phosphate có khả năng chuyển đổi phosphate khó tan thành dạng hòa tan thông qua quá trình acid hóa, làm giảm pH nhờ các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra, tạo ra nhiều ion H + (Lin et al., 2006) Các acid hữu cơ này bao gồm citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid, được sản xuất chủ yếu từ vi khuẩn và nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan (Sperber, 1985; Duff, 1963).
Nghiên cứu của Moghimi và Tate (1978) chỉ ra rằng ngoài cơ chế acid hóa, vi khuẩn còn có khả năng hòa tan lân khó tan thông qua việc tạo phức và các phản ứng trao đổi ion Cụ thể, phức cation đóng vai trò quan trọng trong quá trình hòa tan lân khó tan, đặc biệt khi có sự hiện diện của cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Vi sinh vật môi trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.
Phương tiện nghiên cứu
Tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ, người nghiên cứu có thể sử dụng các thiết bị và phương tiện hiện đại để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn.
- Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống Falcon
- Que cấy, đèn cồn, lame và lammen
- Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật)
- Kính hiển vi Olympus BH – 2 (Nhật)
- Cân điện tử Sartorius (Đức )
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – international (Đức)
- Tủ cấy vi sinh vật ( Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Inccucell 111 (Đức)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), máy Vortex
- pH kế Orion 420A (Hoa Kì)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Tủ lạnh Electrolux Confor Plus (Thụy Điển)
- Tủ lạnh Akira (Việt Nam)
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus 7,1 megapixel
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
Rễ cây bắp được thu hoạch từ các khu vực Ấp Hai, Ấp Ba và Suối Tiên tại huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai, cũng như ấp Thanh Bình và Thanh Tân thuộc Thị Trấn Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
3.2.3 Hóa chất và môi trường a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu
- Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) 10% b) Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh
Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường LGI đặc và bán đặc
Theo Cavalcante và Dửbereiner (1988) thỡ cụng thức của mụi trường đặc và bỏn đặc được trình bày ở bảng 2
Bảng 2 Cụng thức mụi trường LGI ( Cavalcante và D ử bereiner, 1988 )
Bromothymol blue 0.5% trong KOH 0,2N 5 ml/l
Agar Môi trường đặc 20 g/l, môi trường bán đặc
Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường NFb đặc và bán đặc
Theo Krieg và Dửbereiner (1984) thỡ cụng thức của mụi trường đặc và bỏn đặc gồm các thành phần hóa chất sau :
Bảng 3 Cụng thức mụi trường NFb ( Krieg và D ử bereiner, 1984 )
Dung dịch nguyên tố vi lượng (a) 2 ml/l
Agar Môi trường đặc 20 g/l, môi trường bán đặc 0,2 g/l pH 6.8
(a)Dung dịch nguyên tố vi lượng gồm: 0,4 g/l CuSO 4 ; 0,12 g/l ZnSO 4 7H 2 O; 1,4 g/l
H 3 BO 3 ; 1,5 g/l MnSO 4 H 2 O và 1 g/l Na 2 MoO 4 2H 2 O
(b)Dung dịch vitamin gồm: 1 mg/l biotin (vitamin H) và 2 mg/l pyridoxine-HCl
Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đã phân lập
Bảng 4 Công thức môi trường Burk’s N-free (Park et al., 2005)
Agar Môi trường đặc 20 g/l, môi trường lỏng 0 g/l pH 7,0
Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh đã phân lập
Bảng 5 Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999)
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh 3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu
Rễ cây bắp được thu bằng cách nhổ ngẫu nhiên ở 5 địa điểm Mỗi địa điểm từ 2 –
Rễ cây bắp được thu hoạch từ những cây có độ tuổi từ 40 đến 60 ngày, thời điểm mà hệ thống rễ phát triển mạnh mẽ và mật độ vi khuẩn nội sinh đạt tối ưu Sự phát triển của vi khuẩn này phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây cũng như các yếu tố môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003) Để loại bỏ vi sinh vật có thể còn bám trên bề mặt rễ, mẫu rễ sau khi thu thập sẽ được xử lý kỹ lưỡng.
Để kiểm tra khả năng của vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu rễ sau khi khử trùng, cần lấy 200 µl nước cất từ lần rửa thứ tư (lần cuối) và cấy lên các đĩa môi trường Tryptone – Yeast extract – glucose – agar Sau đó, ủ ở 30°C Nếu sau 24 giờ ủ mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa môi trường, thì mẫu rễ đã khử trùng đạt yêu cầu.
3.3.1.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ cây bắp
Sau khi khử trùng, mẫu rễ được cho vào cối và thêm 1-2ml nước cất rồi nghiền nhuyễn Tiếp theo, lấy 100µl dịch nghiền của rễ chủng vào các ống nghiệm chứa 3ml môi trường LGI và NFb bán đặc Đậy nắp các ống nghiệm và ủ trong tủ ủ ở 30°C trong 2-3 ngày.
Sau 2 – 3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc LGI và NFb đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng (pellicle) cách bề mặt môi trường nuôi khoảng 0,5cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ các vòng pellicle của các môi trường bán đặc LGI và NFb lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI và NFb đặc để tách ròng các khuẩn lạc
Rễ cây bắp đã rửa sạch
Rửa rễ bằng nước cất vô trùng
Cắt rễ thành đoạn nhỏ 1-2 cm
Khử rễ bằng cồn 96% trong 3 phút
Khử rễ bằng H2O 2 3% trong 3 phút
Rửa bằng nước cất vô trùng 4 lần
Hình 1 Sơ đồ xử lý mẫu rễ cây bắp
Sau khi thực hiện vài lần cấy chuyển trên các môi trường LGI và NFb đặc, các khuẩn lạc rời được chọn và quan sát dưới kính hiển vi Khi vi khuẩn đạt độ tinh khiết, chúng được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng, sau đó bảo quản ở 4°C và được coi là một dòng (isolate).
3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc, cần đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa bằng mắt thường Đối với những khuẩn lạc có kích thước nhỏ, có thể sử dụng kính lúp để quan sát chi tiết hơn.
Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng milimet (mm)
3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi tách ròng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của chúng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
Nhỏ 15àl nước cất vụ trựng lờn lame
Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
Sử dụng que cấy, lấy một ít khuẩn lạc và trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lam Đậy lam lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách nghiêng một cạnh của lam với góc 45 độ, sau đó hạ lam xuống từ từ và nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí trong mẫu vật.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần giúp chúng ta nhận diện các hình dạng và khả năng di chuyển của vi khuẩn một cách rõ ràng.
3.3.4 Xác định đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh
Cấy kiểm tra tất cả các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được trên ba môi trường đặc (Burk’s không N, NBRIP và môi trường phân lập vi khuẩn có bổ sung Tryptophan) nhằm ghi nhận mức độ sinh trưởng của chúng Từ mỗi môi trường, các dòng vi khuẩn có biểu hiện dương tính mạnh nhất sẽ được lựa chọn để đo khả năng cố định đạm sinh học và hòa tan lân khó tan.
Khả năng cố định đạm
Vi khuẩn có khả năng cố định đạm phát triển tốt trong môi trường không có đạm, nhờ vào khả năng tổng hợp đạm từ không khí Để xác định các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng này, cần cấy chúng trên môi trường Burk’s không đạm đặc và ủ ở nhiệt độ 30°C Sau 1-2 ngày theo dõi, những dòng vi khuẩn nào phát triển trong môi trường này sẽ chứng tỏ khả năng cố định đạm của chúng.
- Định lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra
Nguyên tắc xác định nồng độ NH4+ dựa vào phản ứng giữa phenol và NH3 trong môi trường kiềm, với sự hiện diện của hypochlorite làm tác nhân oxy hóa, tạo ra indophenol có màu xanh Việc sử dụng sodium nitroprusside sẽ tăng cường hiệu quả của phản ứng này.
NH 3 và phenol (Page et al., 1982) Hàm lượng NH 4 + được xác định bằng cách đo cường độ màu trên máy quang phổ tại bước sóng 636nm
Hóa chất: (1) Dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất (2)
Để chuẩn bị dung dịch stock (NH4+), hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước và bảo quản trong tủ lạnh Trước khi sử dụng, pha loãng 40ml dung dịch stock (NH4+) với nước để có tổng thể tích 200ml, tạo ra dung dịch có nồng độ 2µg/ml Đối với thuốc thử phenol nitroprusside, hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong 0,5 lít nước Chuẩn bị dung dịch buffer hypocloride bằng cách hòa tan 15ml NaOCl với 5g NaOH trong 0,5 lít nước Cuối cùng, chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường lỏng LGI hoặc NFb với 15ml môi trường trong ống nghiệm.
Chủng vi khuẩn vào trong ống nghiệm chứa môi trường LGI hoặc NFb lỏng lắc trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 vòng/phút
Để pha các dung dịch chuẩn nồng độ 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ppm, cần chuẩn bị các thành phần sau: Đường chuẩn 0 ppm gồm 5ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 0ml NH4+; Đường chuẩn 1 ppm gồm 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 1ml NH4+; Đường chuẩn 2 ppm gồm 3ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 2ml NH4+; Đường chuẩn 3 ppm gồm 2ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 3ml NH4+; Đường chuẩn 4 ppm gồm 1ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+; Đường chuẩn 5 ppm gồm 0ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 5ml NH4+.
Hút 2ml dịch vi khuẩn trong các ống facol cho vào các eppendorf
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút
Hút 2ml dịch vi khuẩn ở các thời điểm 2, 4, 6, 8, đem ly tâm và 4ml H 2 O; 5ml buffer; 5ml thuốc thử Tiến hành đo phổ OD
Bằng cách dựa vào sự thay đổi màu sắc của phản ứng giữa thuốc thử và ion NH4+, chúng ta có thể đo phổ OD tại bước sóng 636nm Sau đó, sử dụng chương trình Excel để vẽ đồ thị, từ đó tính toán được nồng độ ion NH4+ trong dịch vi khuẩn.
Khả năng hòa tan lân khó tan
- Dùng thuốc thử acid ascorbic – amoniummolybdate – potassium antinomonyltartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung dịch theo nguyên lý:
Chất lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate màu vàng
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập
Từ 3 mẫu rễ của cây bắp trồng ở huyện Trảng Bom tỉnh Đồng Nai và 2 mẫu rễ của cây bắp trồng ở Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa-Vũng Tàu đã phân lập được 16 dòng vi khuẩn Trong số 16 dòng vi khuẩn đã phân lập, số dòng được phân lập từ mẫu rễ ở tỉnh Đồng Nai là 8 dòng (trong đó 5 dòng trên môi trường NFb và 3 dòng trên môi trường LGI) và ở Bà Rịa-Vũng Tàu phân lập được 8 dòng (trong đó có 4 dòng trên môi trường NFb và 4 dòng trên môi trường LGI)
Bảng 6 Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
STT Vi khuẩn Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Môi trường
1 NA2 Ấp 2, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai NFb
2 NA3a Ấp 3, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai NFb
3 NA3b Ấp 3, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai NFb
4 NA3c Ấp 3, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai NFb
5 NST Ấp Suối Tiên, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai NFb
6 NTT1 Ấp Thanh Tân, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu NFb
7 NTT2 Ấp Thanh Tân, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu NFb
8 NTB1 Ấp Thanh Bình, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu NFb
9 NTB2 Ấp Thanh Bình, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu NFb
10 LA2 Ấp 2, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
11 LA3b Ấp 3, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
12 LA3d Ấp 3, Sông Trầu, Trảng Bom, Đồng Nai LGI
13 LTT1 Ấp Thanh Tân, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu LGI
14 LTT2 Ấp Thanh Tân, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu LGI
15 LTT3 Ấp Thanh Tân, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu LGI
16 LTB Ấp Thanh Bình, Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa, Vũng Tàu LGI
Khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh ở rễ cây bắp thể hiện sự đa dạng về hình thái, màu sắc và hình dạng Tất cả các dòng vi khuẩn này đều phát triển tốt trong điều kiện vi hiếu khí và môi trường bán đặc, tạo thành màng mỏng (pellicle) cách mặt môi trường khoảng 0,5cm.
Hình 2 Vi khuẩn sau 36 giờ nuôi trên môi trường bán đặc
4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Bảng 7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Dòng vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi ĐK (mm)
1 NA2 Que ngắn ++ Trắng trong Không đều Răng cưa Lài 1,5
2 NA3a Que ngắn +++ Trắng trong Tròn đều Nguyên Lài 1
3 NA3b Que ngắn +++ Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2
4 NA3c Que ngắn ++ Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1
5 NST Que ngắn +++ Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,5
6 NTT1 Que ngắn ++ Trắng đục Tròn đều Răng cưa Lài 0,5
7 NTT2 Que ngắn +++ Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5
8 NTB1 Que ngắn ++ Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1
9 NTB2 Que ngắn +++ Trắng trong Không đều Răng cưa Lài 1,5
10 LA2 Que ngắn ++ Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2
11 LA3b Que ngắn +++ Trắng đục Tròn đều Răng cưa Lài 1
12 LA3d Que ngắn ++ Trắng trong Không đều Nguyên Lài 2
13 LTT1 Que ngắn ++ Vàng cam Tròn đều Răng cưa Mô 2
14 LTT2 Que ngắn +++ Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1
15 LTT3 Que ngắn ++ Trắng trong Tròn đều Răng cưa Mô 1
16 LTB Que ngắn ++ Vàng đục Tròn đều Răng cưa Lài 1
(++) chuyển động nhanh; (+++) chuyển động rất nhanh ĐK: Đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn sau 24 giờ cấy trên môi trường phân lập
4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Bảng 8 Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn đã phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Số lượng Tỷ lệ %
Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn chủ yếu là hình tròn và không đều Trong số 16 dòng vi khuẩn được phân lập, có 10 dòng (62,5%) có khuẩn lạc hình tròn đều, trong khi 6 dòng (37,5%) có khuẩn lạc không đều.
Màu sắc khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập chủ yếu là trắng trong và trắng đục, với 50% (8/16 dòng) tạo khuẩn lạc màu trắng đục, 31,25% (5/16 dòng) màu trắng trong, và 6,25% (1/16 dòng) cho mỗi màu vàng nhạt, vàng cam, vàng đục Đáng chú ý, một số dòng vi khuẩn có thể chuyển màu từ trắng đục sang vàng nhạt hoặc vàng cam sau thời gian cấy trữ lâu dài.
Trong nghiên cứu về dạng bìa khuẩn lạc, phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập được có bìa dạng răng cưa, với 11/16 dòng, chiếm 68,75%, trong khi 5/16 dòng có bìa dạng nguyên, chiếm 31,25% Về độ nổi khuẩn lạc, 10 dòng vi khuẩn có độ nổi lai chiếm 62,5%, còn lại 6 dòng với độ nổi mô chiếm 37,5% Đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,5-2 mm sau khi cấy trên môi trường đặc và ủ ở 30°C trong 24 giờ.
(A) Khuẩn lạc có màu vàng cam, dạng tròn, bìa răng cưa, độ nổi mô
(B) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
(C) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng tròn, bìa răng cưa, độ nổi lài
(D) Khuẩn lạc có màu trắng trong, không đều, bìa nguyên, độ nổi lài
4.1.2.2 Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn phân lập được có một số đặc điểm như sau:
Tất cả 16 dòng vi khuẩn đều có dạng que ngắn, chiếm tỉ lệ 100%
Tất cả 16 dòng vi khuẩn đã được phân lập cho thấy khả năng chuyển động nhanh và rất nhanh Trong đó, 9 dòng vi khuẩn chuyển động nhanh, chiếm 56,25%, trong khi 7 dòng còn lại có tốc độ chuyển động rất nhanh, chiếm 43,75%.
Hình 3 Đặc điểm của một số dạng khuẩn lạc, ngày 05/08/2012
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn từ môi trường NFb và môi trường LGI sang môi trường Burk’s không đạm và khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
4.2.1 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Tất cả các dòng vi khuẩn đã được phân lập từ hai môi trường NFb và LGI đã được chuyển sang môi trường Burk’s không đạm đặc và ủ ở nhiệt độ 30°C Kết quả theo dõi sự phát triển của các vi khuẩn này được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 9 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường Burk’s không đạm
4.2.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Sau 3 ngày quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường Burk’s không đạm đặc cho thấy: tất cả các đĩa petri chứa môi trường Burk’s đều xuất hiện khuẩn lạc, điều này cho phép đánh giá sơ bộ các dòng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm Để đánh giá chính xác khả năng cố định đạm của từng dòng vi khuẩn cần tiến hành định lượng lượng NH4 + do những dòng vi khuẩn này tạo ra bằng phương pháp phenol-nitropruside
Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được xác định thông qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo Các mẫu có màu xanh đậm cho thấy mức hấp thụ quang phổ cao hơn, đồng nghĩa với khả năng tổng hợp đạm tốt hơn.
Sau 3 lần lặp, giá trị trung bình của mỗi mẫu đo sau 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi vi khuẩn trong môi trường Burk's được tính toán và thu được kết quả như sau:
Hình 2 Đường chuẩn đo đạm ( ngày 16/09/2012)
Bảng 10 Khả năng tổng hợp NH 4 +
(mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày,
4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk’s không đạm
Nghiệm thức Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Trung bình
Sau khi phân tích hàm lượng NH4+ trung bình qua 4 đợt đo của 16 dòng vi khuẩn, kết quả cho thấy 100% các dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng cố định đạm, so với mẫu đối chứng không có chủng vi khuẩn ở mức ý nghĩa 1%.
Khả năng tổng hợp đạm của vi khuẩn thay đổi theo thời gian, với mức cao nhất vào ngày nuôi thứ 4 và giảm dần ở những ngày sau Khi vi khuẩn tổng hợp quá nhiều đạm, điều này sẽ ức chế sự phát triển của chúng Trong thời gian ngưng tổng hợp, vi khuẩn sử dụng lượng đạm đã tổng hợp, và khi môi trường không còn ức chế, chúng sẽ tiếp tục quá trình này Đối với vi khuẩn nội sinh thực vật, chúng chỉ sử dụng một phần nhỏ đạm tổng hợp, phần còn lại được thực vật hấp thụ Mặc dù hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng cố định đạm, hiệu quả thường thấp (dưới 2 mg/l) Một số dòng vi khuẩn như NA3b, NA3a, LA2 và LTT2 cho thấy khả năng cố định đạm tốt hơn, với hàm lượng NH4+ cao (trên 2 mg/l) sau 4 ngày nuôi, và có sự khác biệt thống kê đáng kể so với đối chứng Tuy nhiên, vào ngày thứ 6 và thứ 8, một số dòng vi khuẩn không còn khả năng tổng hợp đạm.
NH 4 + (hàm lượng NH 4 + = 0 mg/l)
NA3a NA3b LA2 LTT2 DC
Các dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây bắp cho thấy khả năng cố định đạm mạnh nhất vào ngày thứ 4 sau khi được đưa vào môi trường Burk’s không đạm Trong số đó, 4 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt nhất bao gồm 3 dòng được phân lập từ huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai và 1 dòng từ Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa-Vũng Tàu.
Hình 5 Khả năng tổng hợp NH 4 + (mg/l) của 4 dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn từ môi trường NFb và môi trường LGI sang môi trường NBRIP và khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn
Để đo khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập, cần cấy chuyển chúng trên môi trường NBRIP đặc và ủ ở nhiệt độ 30°C Việc này giúp đánh giá sơ bộ khả năng phát triển và khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn.
Bảng 11 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP đặc
Qua kết quả kiểm tra khả năng phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đã phân lập
Tiếp tục cấy vi khuẩn vào môi trường NBRIP lỏng để định lượng lượng P2O5 hòa tan bằng phương pháp Oniani Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ, với những mẫu có màu xanh đậm cho thấy mức hấp thụ quang phổ cao hơn và khả năng hòa tan lân tốt hơn Sau 3 lần lặp lại, giá trị trung bình của mỗi mẫu đo sau 5 ngày và 10 ngày nuôi vi khuẩn trong môi trường NBRIP lỏng đã được ghi nhận.
Bảng 12 Khả năng hòa tan P 2 O 5 (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày và
10 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng
Nghiệm thức Ngày 5 Ngày 10 Trung bình
Kết quả có 16/16 dòng vi khuẩn phân lập có khả năng hòa tan lân chiếm 100% (so với kết quả của mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở mức ý nghĩa 1%)
Các dòng vi khuẩn phân lập cho thấy khả năng hòa tan lân cao nhất vào ngày thứ 5, với NA3c đạt 21,75 mg/l, LA2 đạt 28,34 mg/l và LTT1 đạt 24,94 mg/l Đến ngày thứ 10, khả năng hòa tan lân của một số dòng vi khuẩn vẫn giảm nhưng không đáng kể.
NTB1 NTB2 LA3b LTT1 DC
Một số dòng vi khuẩn vẫn duy trì khả năng hòa tan lân tốt vào ngày thứ 10, trong đó dòng LA3b từ huyện Trảng Bom, Đồng Nai đạt 15,39 - 25,42 mg/l Ngoài ra, ba dòng NTB1 (21,55 – 23,88 mg/l), NTB2 (18,11 – 24,33 mg/l) và LTT2 (13,88 – 21,82 mg/l) được phân lập tại Thị Trấn Đất Đỏ, Bà Rịa-Vũng Tàu cũng cho thấy sự khác biệt thống kê có ý nghĩa 1% so với đối chứng (DC) có giá trị 0 mg/l.
Hình 5 Khả năng hòa tan P 2 O 5 (mg/l) của 4 dòng vi khuẩn so với đối chứng theo thời gian
