Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây diếp cá (houttuynia cordata thunb ) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn staphylococcus aureus từ mụn nhọt (furuncle) ở người TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.) CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI Cần Thơ, 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp sở Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc: 14 giờ, ngày 04 tháng 07 năm 2020 Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Thị Thúy Duy 2017 Phân lập định danh vi khuẩn nội sinh Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas hydrophila Staphylococcus aureus tỉnh An Giang Tạp chí Y học Việt Nam, 458(9):399- 409 Truong Huynh Van and Hiep Nguyen Huu, 2017 Isolation of antibacterial endophytes from (Houttuynia cordata Thunb.) grown in cantho city Proceedings of FerVAAP2017, the 7th International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products the 12th Asian Biohydrogen Biorefinery Symposium, July 25th – 28th, Khon Kaen, ThaiLan, Page: 86 - 89 Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp 2018 Phân lập định danh vi khuẩn nội sinh Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người Tạp chí Y học Việt Nam, 471(10):252- 261 Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp, Lý Tú Hương 2019 Phân lập định danh vi khuẩn nội sinh Diếp cá “Houttuynia cordata Thunb.” tỉnh Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55(2):166-173 Huynh Van Truong, Nguyen Huu Hiep, Nguyen Trung Kien, Nguyen Minh Phuong, Tran Huynh Trung, Ly Tu Huong, Huynh Gia Bao, Le Thi Cam Tu, Nguyen Thang, Tran Duc Tuong, Quach Van Cao Thi, 2020 Research on endophytic bacteria in Houttuynia cordata Thunb with antibacterial activity against Staphylococcus aureus from human furuncles, International Journal of Scientific Engineering and Applied Science, Volume-6, Issue-11, page: 81-92 Chương GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu Từ Alexander Flemming phát kháng sinh Penicillin kháng sinh ứng dụng rộng rãi điều trị bệnh nhiễm khuẩn cho người động vật Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh cách tùy tiện gây tác hại không nhỏ quen thuốc kháng thuốc ngày phổ biến Đó ngun nhân cần phải tìm kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh có vi khuẩn Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) vi khuẩn thường gặp da niêm mạc mũi chiếm 30% người khỏe mạnh Khi da bị tổn thương, trầy xước, tụ cầu khuẩn xâm nhập thể gây loạt vấn đề từ mụn nhẹ đến nhiễm khuẩn nặng, đặc biệt trẻ em, người già, người có hệ miễn dịch yếu Hầu hết tụ cầu ban đầu nhạy cảm với kháng sinh nhóm beta-lactam penicillin, methicillin Vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (gọi tắt MRSA), vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin báo cáo bùng phát MRSA xảy châu Âu vào đầu năm 1960 (Dien et al., 2014) Trong thiên nhiên có nhiều có hoạt chất kháng khuẩn y học sử dụng để điều trị bệnh từ lâu Diếp cá, có hoạt chất kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa để dùng làm thuốc chữa bệnh ngồi da, mụn nhọt, chóc lở, viêm phế quản Chính gần giới y học có xu hướng, hướng đến loại hợp chất kháng sinh, kháng viêm, kháng oxy hóa từ dược liệu thực vật Hiện có nhiều nghiên cứu vi khuẩn nội sinh dược liệu thực vật, vi khuẩn nội sinh có khả giúp tăng trưởng tốt mà cịn có khả sản xuất hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) kích thích chủ sản xuất hợp chất chuyển hóa trung gian (Hardoim et al., 2008) Trong việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm kháng oxy hóa chưa quan tâm nhiều Vì vậy, luận án với tựa đề “Phân lập vi khuẩn nội sinh Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) người” việc làm có tính cấp thiết nên nghiên cứu 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Phân lập định danh số dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá vùng sinh thái có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm kháng oxy hóa từ cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập khảo sát khả kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus số dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá trồng Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ tương ứng với bốn vùng sinh thái nước mặn, nước lợ, đồi núi nước Định danh số dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có khả kháng khuẩn mạnh với vi khuẩn Staphylococcus aureus Nghiên cứu mức độ in vitro hoạt tính kháng oxy hóa kháng viêm liên quan đến khả kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá tuyển chọn 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung Phân lập tuyển chọn dịng vi khuẩn nội sinh có khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, bao gồm nội dung sau: Phân lập khảo sát đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá trồng tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Thành phố Cần Thơ Tuyển chọn dòng vi khuẩn nội sinh có khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus phương pháp khuếch tán giếng thạch Nội dung Định danh số dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA xây dựng mối quan hệ di truyền dòng vi khuẩn nội sinh Nội dung Khảo sát khả kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus cao chiết ethyl acetate dịch nuôi vi khuẩn, gồm nội dung sau: Điều chế cao ethyl acetate dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus cao ethyl acetate cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Minimum Bactericidal Concentration) Nội dung Xác định hoạt tính kháng oxy hóa in vitro cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Diếp cá tuyển chọn Nội dung Xác định hoạt tính kháng viêm in vitro cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Diếp cá tuyển chọn 1.4 Những đóng góp khoa học Nghiên cứu phân lập 231 dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá Trong có 65/231 dịng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người Từ 13/65 dịng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh 13 địa điểm nghiên cứu có hoạt tính kháng khuẩn cao giải trình tự thuộc chi Bacillus Cao chiết ethyl acetate từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh (RGT2) Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 80 đến 160 µg/mL Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết dao động từ 640 đến 1280 µg/mL Cao chiết ethyl acetate từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh (RGT2) Diếp cá, khảo sát in vitro cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết xác định thông qua phương pháp trung hòa gốc tự DPPH, ABTS+, RP, TAC FRAP với giá trị EC50 lần lược 57,38 µg/mL, 57,01µg/mL, 32,00 µg/mL, 94,80 µg/mL 41,41 µg/mL Ngồi ra, hoạt tính kháng viêm cao chiết cho thấy hoạt động ức chế biến tính albumin huyết bị Cao chiết có khả ức chế 50% biến tính nồng độ 73,74 µg/mL 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Phân lập, tuyển chọn nhận diện dịng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa kháng viêm từ cao chiết ethyl acetate dòng vi khuẩn nội sinh RGT2 Diếp cá, Kết luận án sử dụng cho nghiên cứu bổ sung giáo trình giảng dạy 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu dịng vi khuẩn nội sinh RGT2, có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus cho nghiên cứu Kết luận án mở triển vọng, từ cao chiết ethyl acetate dòng vi khuẩn nội sinh RGT2 Diếp cá, có tiềm cho việc điều trị nhiễm trùng từ mụn nhọt da người vi khuẩn Staphylococcus aureus Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật Diếp cá Cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) tên khác Giấp cá, Ngư tinh thảo (Đỗ Tất Lợi, 1999), rau Giấp cá, Tập thái, cỏ Vảy mèo (Thái), rau Ven, Phắc hoảy (Tày), Cù mua mía (Dao) Tên nước Dokudame (Nhật Bản); E-Sung-Cho (Hàn Quốc); Khao-tong Plu-khao (Thái Lan); Houttuynia (Pháp) theo (Đỗ Huy Bích, 2004) Tên khoa học Houttuynia cordata Thunb (Đỗ Tất Lợi, 1999) Thành phần hóa học Tinh dầu, Flavonoid, Alkaloid, Acid hữu acid béo thành phần khác Công dụng Diếp cá Tác dụng kháng khuẩn, tác dụng kháng virus, tác dụng kháng ung thư, tác dụng kháng viêm, tác dụng kháng oxy hóa tác dụng khác 2.2 Sơ lược vi khuẩn nội sinh thực vật 2.2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật Vi khuẩn nội sinh tìm thấy hầu hết nghiên cứu, vi khuẩn nội sinh bên mô chủ tạo thành nhiều mối quan hệ khác bao gồm cộng sinh, hội sinh (Ryan et al., 2008) Vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho chủ, mà trái lại thúc đẩy phát triển trồng cách sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật Hơn nữa, số vi khuẩn nội sinh giúp chủ kháng lại mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) kích thích trồng chống chịu với nhân tố vô sinh hữu sinh (Hallmann et al., 1997) 2.2.2 Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp Dòng vi khuẩn nội sinh thực vật dòng vi khuẩn thường gặp Pseudomonas sp., Burkholderia sp Bacillus sp (Lodewyckx et al., 2002) 2.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus Giới: Prokaryote, phân loại: Firmicute, lớp: Firmibacteria, họ: Micrococceae, giống: Staphylococcus Vi khuẩn Staphylococcus aureus vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, khơng hình thành dạng bào tử, có dạng tế bào trịn, Gram dương, khơng di chuyển, catalase coagulase dương tính Vi khuẩn Staphylococcus aureus phát triển tối ưu 30°C–37°C, phát triển nhiệt độ từ 7°C–49°C Khoảng pH cho tăng sinh tụ cầu khuẩn 4,5–9,3 đạt mức tăng trưởng tối ưu khoảng pH 7,0-7,5 2.4 Tổng quan da người Da quan lớn thể Một số chức quan trọng da bảo vệ thể tránh tổn thương từ bên ngồi, kiểm sốt cân dịch điện giải, kiểm soát nhiệt độ, trạm quan trọng hệ thần kinh hệ miễn dịch, hấp thụ phản ứng với tia cực tím cách tổng hợp vitamin D tổng hợp lipid Ngồi ra, da cịn có chức thẩm mỹ quan trọng Biểu lâm sàng theo vùng da bị viêm Vùng mặt, thường viêm nang lông tụ cầu (Staphylococcus aureus) Vùng râu, viêm nang lông sâu tụ cầu vàng gây viêm lơng, đơi cịn nhiễm đồng thời vi khuẩn Gram âm Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn dịng vi khuẩn Staphylococcus aureus Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người, phân lập tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang thành phố Cần Thơ Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2015 đến tháng 12/2019 Địa điểm nghiên cứu Thu mẫu Diếp cá từ đám Diếp cá với quy mô nhỏ trồng để cung cấp rau ăn sống cho gia đình Phú Quốc, Hà Tiên Rạch Giá tỉnh Kiên Giang Tịnh Biên, Phú Tân, Long Xuyên thuộc tỉnh An Giang Mỹ Xuyên, Châu Thành, Vĩnh Châu thành phố Sóc Trăng thuộc Tỉnh Sóc Trăng Bình Thủy, Phong Điền Ninh Kiều thuộc thành phố Cần Thơ 3.1.2 Vật liệu Cây Diếp cá nhận dạng theo Dược điển Việt Nam tài liệu liên quan thực vật Bộ môn Dược liệu – Thực vật Khoa Dược trường Đại học Y Dược Cần Thơ, định danh trước tiến hành thí nghiệm nghiên cứu Sử dụng dịng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ mụn nhọt người lưu trữ phịng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Dược Cần Thơ cung cấp 3.1.3 Dụng cụ thiết bị Tủ an toàn sinh học – CHClab (Hàn Quốc) Tủ ủ vi khuẩn Memmert - IN110, (Đức) Máy lắc ngang Daihan - SHR-1D, (Hàn Quốc) Máy ly tâm 6.000 vòng/phút Hermle - Z206A, (Đức) Máy cô quay chân không Heidolph (Đức) Máy đo pH Metier Toledo (Đức) Máy đo quang phổ Thermo Scientific Multiskan GO, (Phần Lan) Nồi hấp tuyệt trùng, (Nhật), Đĩa 96 giếng đáy tròn (Italia) số dụng cụ khác 3.1.4 Hóa chất Hóa chất dùng để xử lý mẫu, hóa chất ly trích DNA phản ứng PCR, thuốc thử Resazurin sodium (Sigma) số hóa chất khác Môi trường PDA đặc bán đặc dùng để phân lập vi khuẩn kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu nghiên cứu Vi khuẩn Staphylococcus aureus Vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ mụn nhọt phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh trường Đại học Y Dược Cần Thơ cung cấp Thu thập mẫu Diếp cá Cây Diếp cá thu địa điểm thu mẫu, sau trữ mẫu thùng lạnh Mẫu xử lý phân lập phòng thí nghiệm 3.2.2 Phân lập dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá Phân lập vi khuẩn nội sinh Diếp cá Sơ đồ quy trình phân lập dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá 10 Minitab 16 (Anova-Fisher’s) Các biểu đồ vẽ phần mềm Microsoft Excel 2016 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát đặc điểm khuẩn lạc đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá phân lập nghiên cứu 4.1.1 Kết khảo sát đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá Kết khảo sát 231 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập thể Bảng 4.1 04 tỉnh thành Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ nghiên cứu cho thấy đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có màu trắng đục chiếm đa số, bên cạnh cịn có khuẩn lạc màu vàng, màu trắng ngà, màu trắng, màu đỏ nâu màu nâu nhạt thể có đa dạng màu sắc khuẩn lạc địa điểm nghiên cứu Ngồi ra, hình dạng khuẩn lạc có dạng trịn chiếm đa số độ khuẩn lạc có dạng mơ chiếm tỷ lệ cao Tiếp đó, dạng bìa nguyên khuẩn lạc chiếm số lượng nhiều dạng bìa cưa thể Bảng 4.1 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập Diếp cá Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ Kiên Sóc An Cần Tổng Đặc điểm khuẩn lạc cộng Giang Trăng Giang Thơ 5 20 Màu trắng Màu trắng đục 33 34 28 35 130 Màu trắng ngà 9 33 Màu Màu vàng 2 sắc Màu vàng nhạt 8 31 Màu đỏ nâu 1 1 Màu nâu nhạt 1 1 40 41 33 41 155 Hình Dạng hình trịn dạng Dạng hình khơng 20 19 17 20 76 Độ mô 36 36 30 37 139 Độ Độ lài 24 24 20 24 70 44 44 36 45 169 Dạng Bìa nguyên bìa Bìa cưa 16 16 14 16 62 18 Từ Bảng 4.1 khuẩn lạc 231 dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá 04 tỉnh thành nghiên cứu khuẩn lạc có màu trắng đục chiếm 133/231 khuẩn lạc Về hình dạng khuẩn lạc có dạng hình trịn chiếm 168/231 khuẩn lạc Về độ khuẩn lạc có 139/231 khuẩn lạc Ngồi ra, dạng bìa khuẩn lạc dạng bìa nguyên chiếm 169/231 khuẩn lạc nghiên cứu 4.1.2 Kết khảo sát đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá Từ Bảng 4.1 Các dịng vi khuẩn nội sinh có dạng hình que dài que dài chiếm 124/231 dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá Nhuộm Gram dòng vi khuẩn nội sinh với tỷ lệ vi khuẩn Gram âm vi khuẩn Gram dương gần tương đương với Ngoài ra, khảo sát di dộng cho thấy có 144/231 dịng vi khuẩn di dộng Nhiều nghiên cứu giới vi khuẩn nội sinh cho thấy có xuất lá, thân rễ thực vật Nhận định thể thông qua nghiên cứu nghiên cứu Handayani et al., (2017) lấy mẫu từ rễ, thân ngập mặn từ rừng ngập mặn Pichavaram, Chidambaram, Tamilnadu Ấn Độ, phân lập dòng vi khuẩn nội sinh Bảng Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập Diếp cá Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ Kiên Sóc An Cần Tổng Đặc điểm Giang Trăng Giang Thơ cộng Hình que 19 16 15 18 68 ngắn Hình Hình que 34 25 33 124 32 dài dạng Dịng vi khuẩn Hình chuỗi Nhuộm Gram Sự di động Gram dương Gram âm Di động Không di động 10 10 10 39 31 31 23 28 147 29 37 29 39 27 30 33 38 118 144 24 21 20 23 88 19 Theo nghiên cứu El Deeb et al., (2013) mô tả vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân P tenuiflorus số 28 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ phận khác P tenuiflorus 4.2 Kết khảo sát đặc điểm pH đất trồng Diếp cá nghiên cứu Khảo sát đặc điểm pH đất trồng Diếp cá nơi thu mẫu nghiên cứu vùng sinh thái khác Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ Cho thấy đặc điểm pH đất trồng Diếp cá khoảng pH từ 6,0–6,5 khu vực lấy mẫu nghiên cứu, cho dù nơi có vùng sinh thái khác nước mặn, nước lợ nước Từ nói để Diếp cá sống phát triển tươi tốt pH đất nơi trồng Diếp cá yếu tố quan trọng cho phát triển vi khuẩn nội sinh Diếp cá 4.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn nội sinh Diếp cá vi khuẩn Staphylococcus aureus Qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá vi khuẩn Staphylococcus aureus nghiên cứu có đường kính vịng vơ khuẩn khoảng từ 10–33 mm Có 65/231 dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus Qua kết thống kê 65 dòng vi khuẩn nghiên cứu khảo sát vòng vô khuẩn mốc thời gian 24 giờ, 48 72 chia thành nhóm Nhóm 1: Có 20 dịng vi khuẩn nội sinh với đặc điểm sau Đường kính vịng vơ khuẩn cao ổn định qua thời điểm, giá trị đường kính vịng vơ khuẩn thấp 20 mm cao 33 mm Đây dòng cho hiệu cao ổn định qua thời điểm Có thể chọn dịng để làm bước nghiên cứu Nhóm 2: Có 23 dịng vi khuẩn nội sinh với đặc điểm sau Đường kính vịng vơ khuẩn dao động từ 15 mm đến 19 mm, dịng hiệu trung bình có biến động theo thời gian Nhóm 3: Có 22 dòng vi khuẩn nội sinh với đặc điểm sau 20 Đường kính vịng vơ khuẩn theo thời gian thấp biến thiên từ 10 mm đến 14 mm, dịng cho hiệu thấp Từ chọn dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá nhóm thuộc tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Staphylococcus aureus cho nghiên cứu giải trình tự nhận diện Blast N sở liệu NCBI 4.4 Kết nhận diện 13 dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Staphylococcus aureus phương pháp giải trình tự vùng 16S rRNA 13 địa điểm nghiên cứu Mười ba dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Staphylococcus aureus thuộc chi Bacillus thể Bảng 4.3 Bảng Kết giải trình tự dịng vi khuẩn nội sinh Diếp cá tuyển chọn Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang Cần Thơ Dịng Độ VKNS Kết nhận diện dòng vi khuẩn từ tương STT phân lập Blast sở liệu NCBI đồng từ (%) Diếp cá HTT2 Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901 97 PQT4 Bacillus megaterium strain 22 97 RGT2 Bacillus subtilis strain B237 96 MXT9 Bacillus amyloliquefaciens strain JNL 96 STL3 Bacillus subtilis strain HB9 96 CTL3 Bacillus pumilus HB29 97 VCT3 Bacillus velezensis strain JC-K3 97 TBT2 Bacillus subtilis JCM 1465 97 PTL5 Bacillus amyloliquefaciens MPA 1034 96 10 LXT2 Bacillus megaterium ATCC 14581 97 11 PDT2 Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901 98 12 NKT3 Bacillus subtilis strain LPB4 98 13 BTT4 Bacillus megaterium strain 22 96 4.5 Cây phả hệ dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus 21 Cây phả hệ dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá qua phân tích kết 65 dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus so sánh trình tự tương đồng dịng vi khuẩn xác định thuộc chi Bacillus Pseudomonas Trong chi Pseudomonas có lồi Pseudomonas weihenstephanensis xác định, chi Bacillus có lồi xác định gồm Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus Bacillus tequylensis; có dòng thuộc Bacillus pumilus dòng CTL3 dòng thuộc lồi Bacillus stequylensis PDR1 Qua Hình 4.1 phả hệ có mối quan hệ di truyền dịng vi khuẩn dựa vào phần trình tự 16S rRNA vẽ phần mềm MEGA-X theo (Kumar et al., 2018) qua phương pháp phân tích Maximum Likelihood với bootstrap 1000 lần, phân tích thực đoạn 817 nucleotide theo thang tỷ lệ thể thay đổi nucleotide tương ứng 0.05 22 Hình Cây phả hệ dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus nghiên cứu Xét vị trí địa lý, nhiều dịng Bacillus sp An Giang Sóc Trăng nghiên cứu có độ tương đồng cao Cụ thể, chủng LXT5-AG - B velezensis xuất nhánh với nhóm B velezensis thu Sóc Trăng gồm MXR2-ST, VCT3-ST MXT2-ST (với số bootstrap 68%) Nhóm thuộc B amyloliquefaciens gồm MXT9-ST, STT2-ST, CTR5-ST có độ tương đồng cao Đối với nhóm B megaterium, tương đồng dịng thu Sóc Trăng 23 An Giang cao với số bootstrap 99%, bao gồm dòng TBT1-AG, PTL6-AG, LXT1-AG, LXT2-AG, CTT3-ST VCT5ST Bên cạnh đó, giản đồ có nhóm Bacillus subtilis, nằm nhánh thu tỉnh khác PTL5-AG, RGT2-KG, STL3-ST Tuy nhiên, số bootstrap nhánh 53% nên khả dịng tương đồng khơng chắn Từ kết nghiên cứu cho thấy tỉnh Kiên giang, Sóc Trăng, An Giang thành phố Cần Thơ dù có khác mặt sinh thái, vùng nước mặn hay lợ đến vùng núi cao Tịnh Biên An Giang dòng vi khuẩn nội sinh Diếp cá khơng có khác biệt nhiều 4.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus dòng vi khuẩn RGT2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch ngoại bào, dịch nội bào dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2 trình bày Bảng 4.4 Kết cho thấy dịch ni tăng sinh cho đường kính vịng vơ khuẩn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus đạt 32,00a±1,00 mm, lớn khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với dịch ngoại bào Bảng 4 Kết khảo sát đường kính (mm) vịng vơ khuẩn dịch nội bào, dịch ngoại bào dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh Đường kính vịng vơ khuẩn Dịch vi khuẩn (mm) b Dịch ngoại bào 7,67 ±0,58 0,00c±0,00 Dịch nội bào Dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn 32,00a±1,00 Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự theo sau cột giống khác biệt ý nghĩa mức 5% Dựa kết khảo sát phân tích trên, dịch ni tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 chọn để ly trích cao chiết với dung mơi ethyl acetate 24 4.7 Kết điều chế, định tính định lượng thành phần hóa học cao chiết từ dịch ni tăng sinh dòng RGT2 vi khuẩn nội sinh Diếp cá 4.7.1 Điều chế cao chiết ethyl acetate từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 Từ 4000 mL dung dịch ni tăng sinh dịng RGT2 chiết lỏng lỏng với 12 lít dung mơi ethyl acetate qua q trình cô đuổi dung môi thu 0,641 gam cao chiết ethyl acetate Cao chiết thu trạng thái đặc sệt, có màu vàng đồng mùi thơm đặc trưng 4.7.2 Định tính nhóm hóa học từ cao chiết dịch ni dịng vi khuẩn RGT2 Bảng Kết khảo sát nhóm chức có hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết cao chiết Rosenthaler Xuất kết tủa màu vàng đậm đến cam, màu đỏ xanh dương đỏ, từ màu cam đến đỏ Xuất màu vàng đến camđỏ Dung dịch xanh đen Kết tủa đỏ nâu Dung dịch tách lớp, lớp có màu đỏ đậm Xuất màu xanh lục nhạt Saponin Lắc mạnh phút Tạo bọt - Tannin Gelatin mặn Kết tủa trắng + Fehling Xuất kết tủa màu đỏ gạch + Keller - killiani Xuất tím đỏ hay nâu mặt phân cách lớp chất lỏng + H2SO4 đđ Flavonoid Polyphenol Alkaloid Steroid Glycoside 1% NaOH / ethanol FeCl3 5% Dragendorff Salkowski + + + + + Ghi chú: dấu (+) có diện Bảng 4.5 nghiên cứu này, cao chiết ly trích từ dịng vi khuẩn RGT2 có chứa hợp chất thuộc nhóm 25 polyphenol, flavonoid, alkaloid, tannin, glycoside steroid nên có tiềm hoạt tính sinh học cao Trong nhóm hợp chất trên, polyphenol flavonoid xem có vai trị quan trọng việc quy định hoạt tính kháng khuẩn Nhiều nghiên cứu cho thấy polyphenol flavonoid đóng vai trị quan trọng hoạt động kháng khuẩn có mối quan hệ mật thiết với hoạt tính sinh học khác (Shah et al., 2018) Do đó, Từ nghiên cứu tiến hành định lượng polyphenol flavonoid 4.7.3 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng flavonoid toàn phần từ cao chiết dịch ni dịng vi khuẩn RGT2 Trên sở đường chuẩn này, kết hàm lượng polyphenol tổng (TPC) flavonoid toàn phần (TFC) cao chiết xác định có giá trị 39,54 mg GAE/g cao chiết 330,03 mg QE/g cao chiết trình bày theo Bảng 4.6 Như dựa nghiên cứu trước giải thích khả kháng khuẩn cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2 khơng phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol flavonoid mà phụ thuộc vào thành phần polyphenol, flavonoid mà cao chiết sở hữu Bảng Kết hàm lượng polyphenol flavonoid cao chiết Thành phần định lượng Phương trình tuyến tính Hàm lượng TPC (mg GAE/g cao chiết) y = 0,0918x + 0,0487 (R² = 0,9862) 39,54±2,50 TFC (mg QE/g cao chiết) y = 0,0052x – 0,0087 (R² = 0,989) 330,03±11,55 Nói chung, vai trị thiết yếu flavonoid liên quan đến bệnh bệnh nhiễm khuẩn Các flavonoid tác động đến vị trí bị viêm cách tác động đến tế bào viêm, giải phóng ROS, RNS cytokine tiền viêm để loại bỏ mầm bệnh ngoại lai có vi khuẩn sửa chữa mô bị thương (Sulistiyani et al., 2019) 26 4.8 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2 Thí nghiệm tiến hành thăm dò khả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2 nồng độ 80, 160, 320, 640 1280 µg/mL Hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus cao chiết kháng sinh minh họa Hình 4.2 Hình Khả kháng khuẩn cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 vancomycin Đường kính vịng vơ khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus thử nghiệm vancomycin có vịng vơ khuẩn lớn cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 Nhưng từ cho thấy cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 có hoạt tính kháng khuẩn tốt vi khuẩn Staphylococcus aureus không vancomycin 4.9 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 Xác định dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) (Mak et al., 2013) Chất thị màu resazurin có màu xanh dung dịch, giếng có đổi màu dung dịch resazurin từ màu xanh chuyển sang màu hồng cho thấy có tăng trưởng vi khuẩn giếng Kết thể Bảng 4.8 27 Bảng Nồng độ ức chế nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao chiết vancomycin Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (µg/mL) Cao chiết 80