Trong nghiên cứu này việc phân lập, tuyển chọn và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) ở tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn cao được thực hiện.
TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH CĨ TÍNH KHÁNG KHUẨN TRONG CÂY CỎ HƠI (Ageratum conyzoides L.) Ở TỈNH SÓC TRĂNG Nguyễn Phúc Huy1 TÓM TẮT Title: Isolation of antimicrobial endophytic bacteria in billygoat weed (Ageratum conyzoides L.) collected in Soc Trang province Từ khóa: Ageratum conyzoides, Bacillus amyloliquefaciens, kháng khuẩn, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans, vi khuẩn nội sinh Keywords: Ageratum conyzoides, antimicrobial, Bacillus amyloliquefaciens, endophytic bacteria, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans Lịch sử báo: Ngày nhận bài: 10/11/2019; Ngày nhận kết bình duyệt: 03/12/2019; Ngày chấp nhận đăng bài: 15/12/2019 Tác giả: 1Trường đại học Kỹ thuật – Công nghệ Cần Thơ Email: nphuy@ctuet.edu.vn Cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) biết đến loại dược liệu q có tính kháng khuẩn mạnh, nghiên cứu trước sử dụng dịch trích mà chưa quan tâm nhiều đến tập đồn vi khuẩn nội sinh Việc tìm nguồn kháng sinh tự nhiên thay kháng sinh tổng hợp trở nên cấp bách hết, nhiều loại kháng sinh tổng hợp tạo vi khuẩn kháng sinh Chính vậy, việc phân lập dịng vi khuẩn nội sinh có tính kháng khuẩn cỏ hôi thực Từ năm mẫu cỏ hôi thu tỉnh Sóc Trăng phân lập 45 dịng vi khuẩn mơi trường PDA đặc Phần lớn dịng vi khuẩn có dạng hình que, Gram âm có khả di động Khảo sát khả kháng với loài vi khuẩn gây bệnh phương pháp khuếch tán qua giấy lọc Kết có 31 dòng kháng E coli, 29 dòng kháng Aeromonas hydrophila 30 dòng kháng Staphylococcus aureus Điều đáng ngạc nhiên là, có đến 20 dịng kháng ba lồi vi khuẩn gây bệnh 12 dòng kháng hai số ba loài gây bệnh khảo sát Qua nghiên cứu xác định mật số kháng khuẩn hiệu số loài triển vọng Tuyển chọn ba dịng HR10, HT18 HL1 có hiệu kháng khuẩn tốt nhất, kết hợp với đặc tính sinh hóa tiến hành định danh kỹ thuật sinh học phân tử Ba dòng HR10, HT18 HL1 nhận diện Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535, Pseudomonas oryzihabitans strain NBRC 102199 Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 với độ tương đồng tương ứng 95,19%, 98,39% 98,56% ABSTRACT Billygoat weed (Ageratum conyzoides L.), which belongs to Asteraceae species, is known as a rare medicinal plant having high antibacterial activity; however, most of the researchers only concerned oil extraction instead of promising endophytic bacteria inside this weed Finding new natural antibiotic is becoming more and more urgent as synthetic antibiotics can cause antibiotic resistant bacteria As a result, the study isolation of antimicrobial endophytic bacteria from billygoat was done From samples of billy goat in Soc Trang Province, 45 bacterial strains were isolated on solid PDA media Most of the bacteria were in rod shape, negative gram, and motile The experiment of testing antimicrobial ability was done with the disk diffusion test method In brief, 31 bacterial strains were resistant to E coli, 29 bacterial strains were resistant to Aeromonas hydrophila and 30 bacterial strains were resistant to Staphylococcus aureus Surprisingly, there were 20 bacterial strains which were resistant to all harmful bacteria and 12 bacterial strains which were resistant to harmful bacteria Moreover, bacterial strains, including HR10, HT18, and HL1, had the highest resistance to harmful bacteria By the combination of chemical, biological properties and identification by molecular biology technique, bacterial strains including HR10, HT18, and HL1 were identified as Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535, Pseudomonas oryzihabitans strain NBRC 102199, Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 with the identity of 95,19%, 98,39%, and 98,56% respectively Tập (8/2020) 30 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Mở đầu Cỏ hôi (Ageratum conyzoides) dân gian thường gọi cỏ cứt lợn Đây loại thân thảo, mọc hoang nhiều nơi nước ta đặc biệt vùng đồng sơng Cửu Long Cỏ có tác dụng nhiệt, giải độc, sát trùng, tiêu thủng,… Dùng chữa cảm mạo phát sốt, chứng bệnh yết hầu sưng đau, ung thủng, mụn nhọt, Gần đây, Tây y phát nhiều tác dụng quý khả kháng khuẩn, tiêu diệt ký sinh trùng, chống ung thư Nhiều nghiên cứu cho thấy, hợp chất có khả trực tiếp ức chế số bệnh cho trồng kích thích trồng sản xuất hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp chống lại tác nhân gây bệnh cho Tập đoàn vi sinh vật nội sinh sống vùng rễ có dược liệu có khả giúp tăng trưởng đồng hóa tốt Ngồi ra, chúng cịn có khả sản xuất trực tiếp hợp chất kháng khuẩn tự nhiên Bên cạnh đó, vi khuẩn nội sinh có khả kích thích chủ sản xuất hợp chất biến dưỡng trung gian nhóm dược liệu, chúng sản xuất hợp chất có tính kháng khuẩn tốt (Hardoim et al., 2008) Chính vậy, nghiên cứu việc phân lập, tuyển chọn định danh số dòng vi khuẩn nội sinh cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.) tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn cao thực Nguyên liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Tồn rễ, thân cỏ thu địa điểm thuộc tỉnh Sóc Trăng gồm Thành phố Sóc Trăng, huyện Kế Sách, huyện Cù Lao Dung, huyện Thạnh Trị thị xã Vĩnh Châu Mẫu thu vào buổi sáng sớm chiều mát, thu phần đất xung quanh gốc với độ sâu khoảng 4-5 cm, bảo quản mẫu thu túi nylon sau mang để tiến hành xử lý mẫu phân lập Phịng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn E coli, S aureus cung cấp từ phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn A hydrophila cung cấp từ môn Bệnh cá, Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh khảo sát khả kháng vi khuẩn gây bệnh môi trường PDA 2.2 Phương pháp Phân lập vi khuẩn nội sinh: Mẫu rửa vòi nước để loại bỏ phần đất bám vào tách rời phận rễ, thân Phần đất thu xung quanh vùng rễ đưa phịng thí nghiệm để đo pH Sau đó, mẫu rửa nước cất vô trùng cắt thành đoạn ngắn dài khoảng 2-3 cm làm khô mẫu giấy hút ẩm, khử trùng bề mặt mẫu (rễ, thân, lá) Ethanol 70% thời gian phút, tiếp tục khử trùng H2O2 3% thời gian phút Cuối cùng, rửa mẫu nước cất vô trùng lần làm khô mẫu giấy thấm vô trùng Kiểm tra vi sinh vật cịn sót lại bề mặt mẫu: Dùng micropipette hút 50 µL nước rửa mẫu lần cuối trải lên đĩa môi trường PDA đặc (Atlas, 2010): (g/L): khoai tây, 200; dextrose, 20; agar,18; pH=6,5, ủ 30oC thời gian 24 nhằm kiểm tra có vi sinh vật xuất hay không Nếu vi sinh vật phát triển chứng tỏ mẫu xử lý đạt yêu cầu Vi khuẩn phân lập sau vi khuẩn nội sinh Các mẫu sau khử trùng bề mặt cắt thành miếng nhỏ cho vào cối khử trùng, giã Sau đó, cho vào thêm mL nước cất vơ trùng, Tập (8/2020) 31 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ trộn để yên 15 phút cho lắng phần cặn dùng micropipette hút lấy phần dịch trích bên cho vào tube eppendorf Hút lấy 100 µL phần dịch trích cho vào ống nghiệm chứa mL môi trường PDA bán đặc chuẩn bị sẵn, đem ủ nhiệt độ 30oC thời gian 24 Nếu quan sát thấy xuất lớp màng mỏng trắng đục (vòng pellicle) bên dưới, cách bề mặt môi trường PDA bán đặc ống nghiệm khoảng 2-5 mm, dấu hiệu chứng tỏ có diện vi khuẩn nội sinh Hút lấy 50 µL phần dịch từ vòng pellicle, trải lên đĩa Petri có chứa mơi trường PDA đặc để phân lập ròng Tiến hành quan sát ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc (hình dạng, màu sắc, dạng bìa, độ nổi, kích thước) Kiểm tra độ rịng (độ thuần) vi khuẩn phương pháp giọt ép kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần Khi vi khuẩn ròng, tiến hành nhuộm Gram cấy chuyển dòng vi khuẩn sang ống nghiệm chứa môi trường PDA đặc tương ứng để trữ 4oC Khảo sát khả kháng khuẩn dòng vi khuẩn phân lập được: Vi khuẩn tăng sinh mơi trường dinh dưỡng PDA lỏng có bổ sung yeast (đạt mật số 109 CFU/mL), dùng giấy thấm có đường kính mm khử trùng nhúng vào phần dịch vi khuẩn Sau đó, đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường dinh dưỡng PDA đặc trải vi khuẩn gây bệnh dòng riêng biệt (E coli , A hydrophila, S aureus), đem ủ 30oC Tiến hành quan sát đo đường kính vịng vơ khuẩn sau 24, 48 72 Trong đó, đường kính vịng vơ khuẩn = đường kính vịng sáng – đường kính giấy thấm (Bauer et al., 1966) Khảo sát khả kháng khuẩn mật số khác số dòng triển vọng: Vi khuẩn tăng sinh mơi trường dinh dưỡng PDA lỏng có bổ sung yeast (đạt mật số 109 CFU/mL), xác định mật số phương pháp đếm sống nhỏ giọt dựa tạo thành khuẩn lạc 1ml canh khuẩn, mẫu phải pha loãng theo thang bậc 10 (pha loãng dãy mật số 105, 106, 107, 108, 109 CFU/mL) Dùng giấy thấm có đường kính mm khử trùng nhúng vào phần dịch vi khuẩn Sau đó, đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường dinh dưỡng PDA đặc trải vi khuẩn gây bệnh dòng riêng biệt (E coli , A hydrophila, S aureus), đem ủ 30oC Tiến hành quan sát đo đường kính vịng vơ khuẩn sau 24, 48 72 Trong đó, đường kính vịng vơ khuẩn = đường kính vịng sáng – đường kính giấy thấm (Bauer et al., 1966) Nhận diện dòng vi khuẩn triển vọng kỹ thuật Sinh học phân tử: Tiến hành chiết tách DNA, sau tiến hành phản ứng PCR vùng gene 16S-rRNA cặp mồi 27F 1492R (Lane, 1991) với trình tự sau: 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’); 1492R (5’- TACGGTTACCTTGTTACGACT3’) Sản phẩm PCR tinh giải trình tự hệ thống máy giải trình tự tự động Cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Sử dụng công cụ BLAST N để so sánh trình tự DNA dịng vi khuẩn triển vọng với trình tự DNA gene loài vi khuẩn ngân hàng liệu NCB (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để nhận diện vi khuẩn đến cấp lồi, có kết hợp với đặc điểm mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa xác định Số liệu nghiên cứu xử lý chương trình Microsoft Excel 2010, phân tích Anova kiểm định Fisher phần mềm thống kê Minitab 17 Tập (8/2020) 32 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Kết quả thảo luận 3.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập môi trường PDA đặc Các dòng vi khuẩn phân bố rễ, thân cỏ Trong 45 dịng vi khuẩn phân lập, 10 dịng từ rễ, 18 dòng từ thân 17 dòng từ Các dòng ký hiệu HRx, HTx, HLx với HR, HT, HL dòng vi khuẩn phân lập từ rễ, thân, x số thứ tự dịng vi khuẩn Chúng có chung đặc tính sinh trưởng phát triển điều kiện vi hiếu khí Khi cấy mơi trường PDA bán đặc, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (vịng sáng màu trắng đục) cách bề mặt mơi trường từ 2-5 mm Các dòng vi khuẩn phát triển nhanh, thời gian quan sát khuẩn lạc 12 giờ, chậm 24 giờ; phần lớn vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc dạng trịn, bìa ngun, độ mơ, màu trắng đục, số khuẩn lạc có dạng khơng đều, bìa cưa, độ lài, độ phẳng, màu trắng trong, nâu đỏ vàng Đường kính khuẩn lạc dịng vi khuẩn phân lập có kích thước dao động từ 0,5 - mm sau cấy môi trường PDA đặc ủ 30oC khoảng từ 12 – 24 Dòng HL1 Dòng HR10 Dòng HR10 Dịng HT4 Dịng HT18 Hình Một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn hội sinh phân lập Phần lớn dịng vi khuẩn phân lập có dạng hình que có khả chuyển động, Một số dịng có dạng hình cầu Chiều dài vi khuẩn dao động khoảng 1,403,70 µm, chiều rộng khoảng 0,50-1,61 µm Kết nhuộm gram có 34/45 dịng vi khuẩn Gram âm chiếm 75,56%, 11/45 dòng vi khuẩn Gram dương, chiếm 24,44% A Hình Kết nhuộm Gram chụp vật kính X100 A: Dịng HR10 Gram dương B: Dịng HL1 Gram âm 3.3 Khả kháng khuẩn Từ 45 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được, qua kết khảo sát khả kháng khuẩn cho thấy có 31/45 dòng vi khuẩn kháng vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy người động vật, dòng HT18 có đường kính vịng vơ khuẩn kháng E coli lớn (18,67 mm) Có 30/45 dịng vi khuẩn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh viêm da, dịng HR10 có đường kính vịng vơ khuẩn lớn Dịng 9,00 mm 29/45 Dòng HT4 với vi khuẩn dòng vi khuẩn kháng HT18 Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ cá, dịng HL2 dịng HL1 có đường kính vịng vơ khuẩn lớn đạt 22,67 mm 16,67 mm (Bảng 1, 3) Tập (8/2020) 33 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Bảng So sánh khả kháng A hydrophila dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng Thời gian ủ STT Dòng vi khuẩn 24 48 72 Vòng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) HR7 11,67b 16,00a 11,00b HT18 12,33b 13,33ab 11,67b HL1 11,00b 12,67ab 16,67a HL2 22,67a 6,00c 4,00d HL5 14,33b 10,67b 7,33c HL11 10,67b 13,67ab 10,33b HL13 11,67b 14,67a 10,00b 9,15 13,07 12,53 CV(%) Ghi chú: Các giá trị trung bình cột có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% Bảng So sánh khả kháng E coli dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng Thời gian ủ STT Dòng vi khuẩn 24 48 72 Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) HR7 10,33b 7,33c 0,00e HR10 10,00bc 10,67b 10,33b HT18 13,67a 18,67a 14,00a HL1 14,67a 10,67b 10,67b HL5 11,00b 8,00c 5,00d HL11 11,00b 11,67b 9,00bc HL14 8,67c 11,67b 7,33c 8,34 13,43 CV(%) 12,42 Ghi chú: giá trị trung bình cột có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% Tập (8/2020) 34 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Bảng So sánh khả kháng S aureus dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng Dòng STT vi khuẩn Thời gian ủ 48 24 72 Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) HR2 6,33ef 6,67c 5,67c HR10 9,00a 8,00abc 7,33ab bcd bc HT5 7,67 7,33 6,67abc ab ab HT18 8,67 8,33 7,67a HL1 7,33cde 6,67c 6,00c abc a HL5 8,00 8,67 7,67a ab d HL6 8,67 4,67 3,67d CV(%) 8,78 11,31 9,61 Ghi chú: Các giá trị trung bình cột có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% HL1 kháng A hydrophila HT18 kháng E coli HR10 kháng S aureus Hình Vịng vơ khuẩn ba dịng HL1, HT18 HR10 Qua kết nghiên cứu cho thấy dòng HT18 có hiệu kháng E coli tốt đạt 18,67 mm, dòng HR10 kháng S aureus cao đạt 9,00 mm Dịng LH2 có hiệu kháng A hydrophila cao đạt 22,00 mm, nhiên dòng khả trì vịng kháng yếu giảm mạnh theo thời gian Trong dịng HL1 hiệu kháng A hydrophila tăng liên tục theo thời gian đạt 16,67 mm Nghiên cứu Lê Minh Học Nguyễn Hữu Hiệp (2017) phát vịng vơ khuẩn cao dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cỏ hôi tỉnh Bạc Liêu vi khuẩn A hydrophila, E coli S aureus theo thứ tự 15,7 mm, 15 mm 25,3 mm Ngoài ra, nghiên cứu khác Fitriani et al (2015) vi khuẩn nội sinh cỏ hôi chứng minh có khả kháng E.coli với vịng vơ khuẩn cao 11,92 mm 3.4 Khảo sát khả kháng khuẩn mật số khác số dòng triển vọng Qua ngày ủ với A hydrophila, E coli S aureus (mật số 107 CFU/mL) đường kính vịng kháng khuẩn biến thiên phụ thuộc vào mật số vi khuẩn nội sinh Mật số cao đường kính vịng vơ khuẩn lớn đường kính vịng vơ khuẩn giảm dần mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ mật số 109, 108, 107, 106, 105 CFU/mL Điều làm cho đường kính vịng kháng khuẩn có chênh lệch gần tỷ lệ thuận với mật số vi khuẩn Khi khảo sát khả kháng mật số khác với A hydrophila cho thấy tất dòng triển vọng kháng tốt mật số 107 trở lên Có 5/7 dịng (HR7, HT18, HL2, HL5 HL11) kháng tốt mật số 105, dịng HL2 có vịng kháng cực đại 10,33 mm sau 24 mật số 105 (Bảng Hình 4) Tập (8/2020) 35 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Bảng So sánh khả kháng khuẩn mật số khác với A hydrophila STT Dòng vi khuẩn HR7-9 HR7-8 HR7-7 HR7-6 HR7-5 HT18-9 HT18-8 HT18-7 HT18-6 HT18-5 HL1-9 HL1-8 HL1-7 HL1-6 HL1-5 HL2-9 HL2-8 HL2-7 HL2-6 HL2-5 HL5-9 HL5-8 HL5-7 HL5-6 HL5-5 HL11-9 HL11-8 HL11-7 HL11-6 HL11-5 HL13-9 HL13-8 HL13-7 HL13-6 HL13-5 CV(%) Thời gian ủ 24 48 72 Vòng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) 11,33de 9,67fghi 9,33ghij 7,33lmno 4,33qr 12,33cd 11,00def 10,33efgh 7,00mno 6,33nop 10,67efg 9,33ghij 8,00jklm 3,67r 0,00s 22,33a 17,33b 16,00b 12,33cd 10,33efgh 13,67c 11,00def 10,33efgh 9,67fghi 8,67ijkl 11,67de 9,00hijk 7,67klmn 6,00op 5,33pq 11,33de 9,33ghij 7,33lmno 0,00s 0,00s 9,84 15,67a 10,67de 10,00ef 8,00gh 5,00jkl 13,33b 11,67cd 10,67de 8,67fg 7,00hi 12,33bc 10,00ef 8,33gh 4,00kl 0,00m 6,00ij 5,33jk 5,00jkl 4,33kl 3,67l 11,33cde 10,33de 6,33ij 7,00hi 7,33ghi 13,67b 10,00ef 8,33gh 7,00hi 6,33ij 13,33b 10,33de 8,00gh 0,00m 0,00m 13,37 11,00bc 6,67de 4,00ghi 3,33hij 2,33j 12,00b 8,00d 6,00ef 4,67fgh 2,33j 16,33a 11,00bc 4,67fgh 0,00k 0,00k 3,67ghij 3,00ij 3,00ij 2,67ij 2,33j 7,33de 6,67de 6,00ef 5,00fg 3,33ij 10,00c 0,00k 0,00k 0,00k 0,00k 10,33c 0,00k 0,00k 0,00k 0,00k 20,61 Ghi chú: Các giá trị trung bình lần lặp lại, giá trị ngày có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% Tập (8/2020) 36 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ Hình Vịng kháng A hydrophila mật số khác Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 109 đến 105 Bảng So sánh khả kháng khuẩn mật số khác với Escherichia coli STT Dòng vi khuẩn HR7-9 HR7-8 HR7-7 HR7-6 HR7-5 HR10-9 HR10-8 HR10-7 HR10-6 HR10-5 HT18-9 HT18-8 HT18-7 HT18-6 HT18-5 HL1-9 HL1-8 HL1-7 HL1-6 HL1-5 HL5-9 HL5-8 HL5-7 HL5-6 HL5-5 HL11-9 HL11-8 HL11-7 HL11-6 HL11-5 HL14-9 HL14-8 HL14-7 HL14-6 HL14-5 CV(%) 24 Vịng vơ khuẩn (mm) 11,00cd 8,00fghi 6,33jklm 0,00o 0,00o 9,67de 6,67ijkl 5,67klmn 4,67n 0,00o 13,67a 11,33c 5,33lmn 4,67n 0,00o 13,00ab 11,67bc 8,33efgh 0,00o 0,00o 11,67bc 8,33efgh 7,67ghij 7,33ghij 5,00mn 9,33ef 7,33ghij 0,00o 0,00o 0,00o 8,67efg 7,00hijk 6,67ijkl 6,33jklm 0,00o 15,27 Thời gian ủ 48 Vịng vơ khuẩn (mm) 6,67ij 0,00m 0,00m 0,00m 0,00m 11,00b 7,33hi 6,00jk 5,00l 0,00m 9,33de 8,33fg 0,00m 0,00m 0,00m 15,33a 5,67kl 0,00m 0,00m 0,00m 8,67ef 0,00m 0,00m 0,00m 0,00m 10,00cd 7,67gh 0,00m 0,00m 0,00m 10,33bc 7,67gh 0,00m 0,00m 0,00m 16,93 72 Vịng vơ khuẩn (mm) 0,00h 0,00h 0,00h 0,00h 0,00h 9,67ab 6,00cd 4,33ef 3,33fg 0,00h 9,00b 7,00c 0,00h 0,00h 0,00h 10,67a 2,67g 0,00h 0,00h 0,00h 5,00de 0,00h 0,00h 0,00h 0,00h 6,33c 0,00h 0,00h 0,00h 0,00h 7,00c 0,00h 0,00h 0,00h 0,00h 33,30 Ghi chú: Các giá trị trung bình lần lặp lại, giá trị ngày có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% Tập (8/2020) 37 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ Hình Vịng kháng E coli mật số khác Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 109 đến 105 Khi khảo sát khả kháng mật số khác với E coli, phần lớn dòng triển vọng kháng tốt mật số 107 trở lên (trừ dòng HL11 xuất vòng kháng từ mật số 108) Duy dịng HL5 kháng tốt mật số 105 có vòng kháng cực đại 5,00 mm sau 24 khảo sát (Bảng hình 5) Bảng So sánh khả kháng khuẩn mật số khác với S aureus Thời gian ủ Dòng STT 24 48 72 vi khuẩn Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) Vịng vơ khuẩn (mm) HR2-9 6,00d 7,67b 5,33cd f HR2-8 0,00 0,00g 0,00f f g HR2-7 0,00 0,00 0,00f f g HR2-6 0,00 0,00 0,00f f g HR2-5 0,00 0,00 0,00f a b HR10-9 9,33 7,33 6,33b HR10-8 4,00e 4,33e 0,00f f g HR10-7 0,00 0,00 0,00f f g HR10-6 0,00 0,00 0,00f f g HR10-5 0,00 0,00 0,00f b b HT5-9 8,67 7,33 6,33b HT5-8 0,00f 0,00g 0,00f HT5-7 0,00f 0,00g 0,00f HT5-6 0,00f 0,00g 0,00f HT5-5 0,00f 0,00g 0,00f HT18-9 8,33b 9,33a 7,67a HT18-8 0,0f 0,00g 0,00f f h HT18-7 0,00 0,00 0,00f f g HT18-6 0,00 0,00 0,00f f g HT18-5 0,00 0,00 0,00f d b HL1-9 6,00 7,67 5,33cd HL1-8 0,00f 0,00g 0,00f f g HL1-7 0,00 0,00 0,00f f g HL1-6 0,00 0,00 0,00f f g HL1-5 0,00 0,00 0,00f c a HL5-9 7,67 8,33 6,67b HL5-8 4,33e 5,67d 2,67e HL5-7 0,00f 0,00g 0,00f f g HL5-6 0,00 0,00 0,00f HL5-5 0,00f 0,00g 0,00f HL6-9 7,67c 6,67c 5,00d HL6-8 4,33e 3,67f 2,67e HL6-7 0,00f 0,00g 0,00f HL6-6 0,00f 0,00g 0,00f HL6-5 0,00f 0,00g 0,00f CV(%) 20,72 18,11 27,86 Ghi chú: Các giá trị trung bình lần lặp lại, giá trị ngày có mẫu tự theo sau giống biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo phép thử Fisher mức ý nghĩa 5% Tập (8/2020) 38 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUN ĐỀ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ Hình Vòng kháng S aureus mật số khác (Mật số vi khuẩn nội sinh giảm dần từ 109 đến 105) Khi khảo sát khả kháng mật số khác với S aureus cho thấy tất dòng triển vọng kháng tốt nồng độ gốc (mật số 109) Chỉ có 3/7 dịng (HR10, HL5 HL6) có tính kháng mật số 108, dịng HL5 có vịng kháng cực đại 48 đạt 5,67 mm (Bảng hình 6) Qua nghiên cứu này, cho thấy vi khuẩn S aureus mạnh nên muốn kháng tốt phải sử dụng vi khuẩn nội sinh mật số cao khoảng 109 CFU/ml 3.5 Định danh dịng vi khuẩn có tính kháng khuẩn triển vọng Từ kết nghiên cứu trên, dòng vi khuẩn kháng khuẩn triển vọng chọn để thực phản ứng PCR với cặp mồi 27F 1495R Ba dòng HR10, HT18 HL1 giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen mã hóa 16S-rRNA so sánh ngân hàng liệu gen NCBI kết hợp số test sinh hóa nhuộm Gram, khả kháng khuẩn,… quan sát mô tả đặc điểm khuẩn lạc nên cho kết định danh sau: Dịng HR10 có tổng cộng 1451 nucleotides vùng gene 16S rDNA giải trình tự 1451bp có độ đồng hình 95,19% với trình tự DNA Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535, dịng HT18 có tổng cộng 1442 nucleotides vùng gene 16SrDNA giải trình tự 1442bp có độ đồng hình 98.39% với trình tự DNA Pseudomonas oryzihabitans strain NBRC 102199 dịng HL1 có tổng cộng 1434 nucleotides vùng gene 16SrDNA giải trình tự 1434bp có độ đồng hình 98,56% với trình tự DNA Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 Kết định danh dịng HR10 phù hợp với mơ tả Trịnh Thành Trung đồng tác giả (2013) B amyloliquefaciens phân lập rễ thực vật Chúng có khả sinh chất kháng sinh kháng lại loại vi khuẩn Gram dương Gram âm gây bệnh người S aureus, E coli Shigella sp nấm gây bệnh F oxysporum Nhiều chất kháng sinh có chất peptide tổng hợp khơng qua ribosome cơng bố từ lồi B amyloliquefaciens bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin bacillomycin) polyketide (Alvarez et al., 2012) Kết định danh dòng HT18 phù hợp với mô tả Veselova et al (2008) Các dẫn xuất thường xác định sản xuất Pseudomonas spp Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas oryzihabitans,… pyocyanin, PCA số phenazine Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn khơng ức chế nấm men Theo Lee et al (2003) Tubermycin B ức chế hiệu phát triển Bacillus cereus Micrococcus luteus, A hydrophila, E coli Staphylococcus aureus Kết định danh dòng HL1 phù hợp với mô tả trước Zahir et al (2014), tìm thấy Tập (8/2020) 39 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Pseudomonas aeruginosa có tác dụng kháng khuẩn Hoạt chất Pyocianin tiết từ Pseudomonas aeruginosa biết đến chất ức chế nhiều lồi vi khuẩn Ngồi pyocianin cịn có số hợp chất như: pseudomonic acid, 1-hydroxyphenazine, PCA PCN tiết từ Pseudomonas aeruginosa có khả kháng Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium botiulinum, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis kháng nấm Kết luận Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rễ, thân cỏ tỉnh Sóc Trăng mơi trường dinh dưỡng PDA đặc (pH=6,5) Kết có 31 dịng kháng E coli, 29 dòng kháng Aeromonas hydrophila 30 dịng kháng Staphylococcus aureus Điều đáng ngạc nhiên là, có đến 20 dịng kháng ba lồi vi khuẩn gây bệnh 12 dòng kháng hai số ba loài gây bệnh khảo sát Qua nghiên cứu xác định mật số kháng khuẩn hiệu số lồi triển vọng Ba dịng HR10, HT18, HL1 có hiệu kháng khuẩn tốt nhất, kết hợp với đặc tính sinh hóa tiến hành định danh kỹ thuật sinh học phân tử Ba dòng HR10, HT18 HL1 nhận diện Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535, Pseudomonas oryzihabitans strain NBRC 102199 Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 với độ tương đồng tương ứng 95,19%, 98,39% 98,56% Các dịng vi khuẩn có tính kháng khuẩn triển vọng cần tiếp tục khảo sát thêm khả kháng khuẩn số loài vi khuẩn nấm gây bệnh khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Atlas RM (2010) Handbook of Microbiological Media 4th edition CRC Press 1953 pages New York, USA Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G, Jofre E (2012) The plantassociated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease J Appl Microbiol, 112159-174 Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M (1966) Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method Amer J Clin Pathol., 45: 493-496 Fitriani A, Ihsan F, Hamdiyati Y, Maemunah (2015) Antibacterial Activity of Shewanella and Pseudomonas as Endophytic Bacteria from the Root of Ageratum conyzoides L Asian Journal of Applied Sciences 3(3) Hardoim PR, Van Overbeek LS, Van Elsas JD (2008) Properties of bacterial Tập (8/2020) 40 TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN – CHUYÊN ĐỀ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ endophytes and their proposed role in plant growth Trends in Microbiology, 16: 463-471 1-carboxylicacid from Pseudomonas aeruginosa strain GC-B26 J Pest Manage Sci 59:872-82 Krishnan HB, Kang BR, Krishnan AM, Kim KY, Kim YC (2007) Rhizobium elti USDA9032 engineered to produce a phenazine antibiotic inhibits the growth of fungal pathogens but is impaired in symbiotic performance Appl Environ Microbiol 73(1):327-30 Trịnh Thành Trung, Phan Lạc Dũng, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương, (2013) Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1901 phân lập Rừng Quốc gia Hồng Liên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 29 (3):59-70 Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics Stackebrandt, E and Goodfellow, M., (Eds) John Wiley and Sons, New York, NY: pp.115-175 Lê Minh Học, Nguyễn Hữu Hiệp (2017) Phân lập, tuyển chọn định danh số dòng vi khuẩn sống nội sinh cỏ (Ageratum conyzoides L.) có khả kháng khuẩn tỉnh Bạc Liêu Luận văn Đại học Trường Đại học Cần Thơ Thành phố Cần Thơ Lee JY, Moon SS, Hwang BK (2003) Isolation and in vitro and in vivo activity against Phytophtora capsici and Colletotrichum orbiculare of Phenazine- Veselova A, Klein SH, Bass IA, Lipasova VA, Metlitskaya AZ, Ovadis MI, Chernin LS, Khmel IA (2008) Quorum Sensing Systems of Regulation, Synthesis of Phenazine Antibiotics, and Antifungal Activity in Rhizospheric Bacterium Pseudomonas chlororaphis 449 Rus J Genetics.44:1400-8 Zahir I, Houari A, Saad IK (2016) Antibacterial Effect of Pseudomonas aeruginosa isolated from a Moroccan hot spring discharge and partial purification of its extract British Biotechnology Journal 4(10): 1123-1140 Tập (8/2020) 41 ... chất có tính kháng khuẩn tốt (Hardoim et al., 2008) Chính vậy, nghiên cứu vi? ??c phân lập, tuyển chọn định danh số dịng vi khuẩn nội sinh cỏ (Ageratum conyzoides L.) tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng. .. bào vi khuẩn 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Bốn mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập mơi trường PDA đặc Các dịng vi khuẩn phân bố rễ, thân cỏ Trong 45 dịng vi khuẩn phân lập, 10 dịng từ rễ, 18... vi sinh vật nội sinh sống vùng rễ có dược liệu có khả giúp tăng trưởng đồng hóa tốt Ngồi ra, chúng cịn có khả sản xuất trực tiếp hợp chất kháng khuẩn tự nhiên Bên cạnh đó, vi khuẩn nội sinh có