Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease.
Trang 111
NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM
UREASE TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORI
Đỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung*
Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông*
TÓM TẮT
Ức chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mới
trong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết,
đạt tỷ lệ thành công 94,5% Ba chủng H pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trong
môi trường Brucella broth Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% bão hòa Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị
có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease
* Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym
HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM
CULTURE BROTH SUPERNATANT
SUMMARY
Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium This research aims to isolate H pylori from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as material for the development of antibody to urease 17 H pylori strains were obtained from 18 biopsy samples (94.5%) Among them, three strains which showed highest urease activity were then sub-cultured in Brucella broth Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with ammonium sulfate 50% saturation The obtained product maintained urease activity and relatively pure SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express
as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately 60.3 kDa
* Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction
* Học viện Quân y
** Bệnh viện 103
Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013
Ngày bài báo được đăng: 18/12/2013
Trang 213
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặp
ở Việt Nam cũng như trên thế giới Tỷ lệ
mắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam,
còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%
Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét
DD-TT, trong đó, nguyên nhân thường nhắc
đến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacter
pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10] Việc điều
trị viêm loét DD-TT do nhiễm H pylori rất
phức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợp
các thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan,
giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng
quy cách Tuy nhiên, khả năng thất bại trong
điều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng kháng
sinh [1, 6] Xuất phát từ thực tế lâm sàng,
nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụng
ức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H pylori
mà không lo ngại tình trạng kháng thuốc,
trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệu
thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp
H pylori hoặc kháng enzym urease của
H pylori, thành phần quan trọng trong quá
trình sinh bệnh của H pylori, giúp chúng né
tránh, tồn tại và phát triển được trong môi
trường axít của dịch dạ dày, là một việc làm
triển vọng [8] Từ đó, nghiên cứu này được
tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK và
tách chiết urease từ H pylori làm nguyên liệu
chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
DD-TT đến khám tại phòng khám nội soi
tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011
và tháng 3 - 2012
Các hóa chất sinh phẩm: BHI
broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanh
bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum)
(Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp)
và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp)
2 Phương pháp nghiên cứu
* Phân lập và định danh H pylori từ bệnh phẩm:
Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi được bảo quản trong ống nghiệm chứa BHI broth
vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm
tại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103 Tại đây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụ
vô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọc trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar đặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear
cấy và định danh bằng nhuộm Gram, các phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase
và urease [3, 5]
* Nuôi cấy tăng sinh H pylori và tách chiết urease từ dịch nuôi cấy:
Nuôi cấy các chủng H pylori có hoạt tính
urease mạnh nhất tăng sinh trong môi trường Brucella broth trong tủ ấm 37oC có
chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ bão hòa Sản phẩm kết tủa được thẩm tích loại muối, xác định hoạt tính urease, xác định độ tinh sạch và kích thước Xác định hoạt tính urease trong dịch nuôi cấy và sản phẩm sau mỗi bước tách chiết nhờ test urease theo nguyên lý urease thủy phân ure thành ammonia, tạo môi trường kiềm và chuyển chỉ thị màu đỏ phenol trong môi trường phản ứng thành màu hồng cánh sen
có độ hấp phụ quang mạnh nhất ở bước
sóng 340 nm Xác định nồng độ protein
enzym thu được bằng kỹ thuật Bradford Xác định độ tinh sạch và kích thước của
Trang 314
sản phẩm bằng phương pháp điện di
SDS-PAGE 10% trong điều kiện biến tính
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Phân lập VK
Sau 5 ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân
lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với
hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám
trong, đường kính 0,5 - 1 mm
Hình 1: Khuẩn lạc thu được khi nuôi cấy
trong môi trường vi hiếu khí
Kết quả nhuộm Gram và các phản ứng
sinh hóa cho thấy cả 17 chủng phân lập đều
cho kết quả nhuộm Gram (-) và hình thể đa
số là hình cong, mức độ xoắn nhẹ, không
để định danh H pylori gồm urease, oxydase
và catalase đều cho kết quả dương tính
Bảng 1: Kết quả nuôi cấy phân lập và định
danh VK
MÃ SỐ
NGHIÊN
CỨU
NUÔI
CẤY
NHUỘM GRAM
PHẢN ỨNG SINH HÓA Urease Oxydase Catalase
H pylori là một trong những VK rất khó
phân lập và chỉ mọc ở những môi trường chuyên biệt với điều kiện thích hợp Pylori agar và túi ủ GENbag microear (5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37oC được xác định là thích hợp cho chúng tăng sinh theo khuyến cáo của nhiều tác giả [5]
Đó có thể là lý do giải thích tại sao tỷ lệ
phân lập H pylori của chúng tôi đạt được
94,5%, cao hơn các tác giả khác trong nước (47 - 56,4%) [1]
2 Tách chiết urease
Hình 2: Kết quả phản ứng urease của các
chủng H.pylori thu được
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Trang 415
Kết quả phân tích hoạt tính urease trong
dịch nổi của 17 chủng VK nghiên cứu nhận
thấy 3 chủng H pylori (HP13, HP16 và
HP18) có hoạt tính cao hơn và hoạt tính
này còn cao hơn nữa sau khi cho tăng sinh
lần 1 (sau 24 giờ), lần 2 (qua đêm) và lần 3
(sau 48 giờ) của cả 3 chủng H pylori này
[4, 8] Ba chủng HP13, HP16 và HP18
được lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh và
phân lập urease
Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10% M: protein
chuẩn; HP13, PH16, HP18 là sản phẩm kết
tủa của các chủng tương ứng
Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn
dịch nuôi cấy các chủng HP13, HP16 và
HP18 với ammonium sulfate 50% thu được
lượng protein có hoạt tính urease lần lượt
là 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml và 1,71 mg/ml
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm thu
được sau kết tủa và thẩm tích tương đối
thuần nhất, trong đó, băng đậm nhất có
kích thước khoảng 60,3 kDa
Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu
về enzym urease của H pylori và các đặc
tính của chúng về phân tử lượng của chuỗi
tiểu đơn vị Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ gần giống nhau chứ không trùng khớp với nhau hoàn toàn, mặc dù cùng chung một phương pháp xác định Điều này chứng
tỏ urease từ các chủng khác nhau của
H pylori có một số khác biệt về phân tử lượng từng chuỗi tiểu đơn vị Trong nghiên cứu này, trên băng điện di của ba chủng VK
H pylori cũng chỉ có một vạch sáng nhất, tương đương nhau và tương ứng về lý thuyết với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân
tử urease Tại Việt Nam, mới chỉ có nghiên cứu tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật
và hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu về urease của VK H pylori [2]
KẾT LUẬN
Đã phân lập được 17 chủng H pylori từ
18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT Đã tách chiết được enzym urease từ dịch nuôi cấy của 3 chủng sinh urease với hoạt tính cao nhất; sản phẩm thu được còn giữ được hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh khiết, có thể sử dụng làm nguyên liệu gây miễn dịch tạo kháng thể kháng urease
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai Tính
đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori
trong bệnh viêm loét DD-TT Y học Thành phố
Hồ Chí Minh 2006, 10 (1), tr.73-75
2 Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi Xác
định phân tử lượng và các thông số động học của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam Tạp chí Phát triển KH & CN 2007, 10 (5), tr.41-50
Trang 516
3 Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn
Helicobacter pylori và bệnh viêm, loét DD-TT
Nhà xuất bản Y học Hà Nội 2003, tr.7-104
4 Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C,
Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al Affinity
purification of Helicobacter pylori urease J Biol
Chem 1998, 273 (29), pp.18130-18138
5 Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ
Pathogenesis of Helicobacter pylori infection
Clin Microbiol Rev 2006, 19 (3), pp.449-490
6 Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA,
Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al Management
of Helicobacter pylori infection the Maastricht
IV/Florence Consensus Report Gut 2012, 61 (5),
pp.646-664
7 Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP
Molecular biology of microbial ureases Microbiol Rev 1995, 59 (3), pp.451-480
8 Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H, Kamata N, Kodama Y, et al Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin
Y on Helicobacter pylori infection Aliment Pharmacol
Ther 2004, 20 (1), pp.185-192
9 Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ
Purification and characterization of the urease
enzymes of Helicobacter species from humans
and animals Infect Immun 1992, 60 (12), pp.5259-5266
10 Versalovic J Helicobacter pylori: pathology
and diagnostic strategies Am J Clin Pathol
2003, 119, pp.403-412
Trang 617