Báo cáo nghiên cứu phân lập vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides từ cà phê nhân tươi

_Trình bày cụ thể quy trình phân lập, phương pháp phân lập, các tuyển chọn dòng vi khuẩn phù hợp, các phản ứng sinh hóa để định danh vi sinh vật._Trong báo cáo còn nêu rõ quy trình để lên men cà phê nhân tươi.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KTMT

BÁO CÁO THỰC TẬP PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN

Leuconostoc mensenteroides CÓ KHẢ

NĂNG LÊN MEN CÀ PHÊ

Trong quá trình thực tập tại

Với lòng biết ơn sâu sắc, chúng em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quýThầy, Cô giáo khoa Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Môi trường Trường Đại họcCông nghiệp Thực phẩm TP HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức, những kỹ năngthiết yếu cho chúng em sau này

Chúng em xin chân thành cảm ơn Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ Việt đã

hỗ trợ kinh phí và máy móc trang thiết bị để chúng em có thể hoàn thành đề tài nghiêncứu này

Chúng em chân thành cảm ơn thầy , thầy đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạtkiến thức, kinh nghiệm và giúp đỡ chúng em trong suốt thời gian thực tập

Vì thời gian có hạn, cũng như còn hạn chế về mặt kiến thức, chắc chắn rằng bàibáo cáo còn nhiều thiếu sót Chúng em kính mong nhận được sự góp ý, nhận xét,cũng như đánh giá từ Quý Thầy Cô

Nhóm em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, tháng 04/ 2015

Sinh viên thực hiện

Nhóm em xin cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do nhóm thực hiện Các

số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từbất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào

Ngày 29 tháng 04 năm 2016

Sinh viên thực hiện

DANH MỤC BẢNG i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP 3

1.1 Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ Việt 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Cơ cấu tổ chức 3

1.1.3 Tầm nhìn – sứ mạng 3

1.1.4 Lĩnh vực hoạt động, đối tượng khách hàng 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về cây cà phê 5

2.1.1 Nguồn gốc 5

2.1.2 Các giống cà phê 5

2.1.3 Tổng quan về quả cà phê Robusta 9

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides 13

2.3 Quá trình lên men lactic dị hình 15

2.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái 16

2.4.2 Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý 17

2.4.3 Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa 17

2.4.4 Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân tử 17 2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài 18

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 20

3.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ 20

3.2.1 Nguyên vật liệu 20

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 20

3.3 Quy trình thí nghiệm 22

3.3.1 Chuẩn bị môi trường, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Thu thập mẫu 27

3.4.2 Tăng sinh 27

3.4.3 Phân lập 27

3.4.4 Cách gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn 27

3.4.5 Nhuộm Gram 27

3.4.6 Quan sát vi thể 28

3.4.7 Thử nghiệm catalase 29

3.4.8 Thử nghiệm khả năng sinh indol 29

3.4.9 Thử nghiệm khả năng di động 29

3.4.10 Thử nghiệm khả năng sinh acid 30

3.4.11 Thử nghiệm khả năng sinh hơi 30

3.4.12 Thử nghiệm xác định khả năng sinh enzyme cellulase 30

3.4.13 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme pectinase 31

3.4.14 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease 32

3.4.15 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme amylase 32

3.4.16 Xác định khả năng tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường có bổ sung dịch chiết cà phê 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 34

4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 34

4.2 Kết quả sàng lọc vi khuẩn L.mesenteroides có khả năng lên men cao 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Tỷ lệ giữa các thành phần cấu tạo của quả cà phê 9

Bảng 2.2: Cấu tạo các loại đường trong vỏ cà phê 13

Bảng 4.1: Kết quả quan sát đại thể, nhuộm Gram 34

Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa 36

Bảng 4.3: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme cellulase 36

Bảng 4.4: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme pectinase 37

Bảng 4.5: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme amylase 37

Bảng 4.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây cà phê chè 5

Hình 2.2: Hoa, trái, cây cà phê vối 6

Hình 2.3: Cây, trái, lá cây cà phê mít 7

Hình 2.4: Hạt cà phê Culi 8

Hình 2.5: Hạt cà phê Moka 9

Hình 2.6: Cấu tạo giải phẫu quả cà phê 15

Hình 2.7: Vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides 15

Hình 2.8: Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình 17

Hình 3.1: Sơ đồ phân lập và định danh vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides 28

Hình 4.1: Khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides trong môi trường có bổ sung dịch chiết cà phê 38

Hình 4.1: Kết quả thử nghiệm catalase 39

Hình 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng di động 39

Hình 4.3: Kết quả thử nghiệm sinh acid 40

Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm sinh hơi 40

Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm indol 41

Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme cellulase .41 Hình 4.6: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme pectinase 41

Hình 4.7: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme amylase 42

Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme protease 42

LỜI MỞ ĐẦU

Việt nam là một trong những quốc gia có sản lượng xuất khẩu cà phê lớn Đượcxuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới, trong đó 14 thị trường đứng đầu đã chiếm đến80% tổng kim ngạch xuất khẩu cà phê của cả nước Xuất khẩu cà phê chế biến, cà phêrang, cà phê hòa tan ngày càng tăng trong vài năm trở lại đây, một số thị trường chínhnhư là: Trung Quốc, Nga, Hồng Kông, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ

Cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8-3% cafeine,một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăng cường khả nănglàm việc, khả năng tư duy, thúc đẩy hoạt động của hệ tuần hoàn, tăng cường phản ứngcủa cơ bắp Nhu cầu hưởng thụ cuộc sống ngày càng cao của con người đòi hỏi muốnthưởng thức cà phê thơm ngon hảo hạng hơn thì sự ra cạnh tranh của nhiều loại cà phê

là điều khó tránh khỏi Hiện nay trên thế giới có hai loại cà phê đắt nhất là “cà phêphân chồn”, “cà phê phân voi” Tuy nhiên thì những loại này lại khá hiếm Bên cạnh

đó, nhiều nghiên cứu cho rằng vi khuẩn lactic, nấm men có khả năng lên men cà phê,đóng vai trò quyết định đến chất lượng hương vị cà phê sau lên men

Xuất phát từ nhu cầu muốn cải thiện chất lượng hương vị cà phê nhờ vào visinh vật thay vì sử dụng phương pháp truyền thống Nhóm chúng em chọn vi khuẩn

Leuconostoc mesenteroides, một loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic Với hy

vọng tìm ra chủng có hoạt tính lên men tốt, tạo ra bước đột phá trong công nghệ chếbiến cà phê Vì mục đích đó, chúng em chọn đề tài: “Phân lập và sàng lọc vi khuẩn

Leuconostoc mesenteroides có khả năng lên men cà phê nhân tươi”

1 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides có khả năng lên men cà phê

nhân tươi

2 Nội dung nghiên cứu

─ Thu thập và chuẩn bị mẫu cà phê và mẫu kim chi

─ Tăng sinh vi sinh vật trong môi trường MRS lỏng

─ Cấy trải phân lập dịch tăng sinh và thực hiện làm thuần mẫu trên các đĩa petri

─ Tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa tiêu biểu theo khóa phân loại Bergey đểxác định loài.

─ Sàng lọc đốitượng có khả năng sinh enzyme cellulose, amylase, protease vàpeptinase

3 Tóm tắt kết quả thực tập

Nhóm đã tiến hành thu thập được 4 loại mẫu gồm một mẫu cà phê chín, cónguồn gốc từ huyện Ngọc Hồi, Gia Lai và ba mẫu kim chi hiện được bán trên thịtrường

Thực hiện tăng sinh và cấy phân lập từ bốn mẫu thu nhận được 11 dòng khuẩnlạc khác nhau

Thử nghiệm sinh hóa và khẳng định được 6 chủng gồm KB2, KC1, KC2, CP5, CP7,CP8 có khả năng là đối tượng cần tìm

Những chủng nghi ngờ là Leuconostoc mesenteroides sẽ tiếp tục được sàng lọc khả

năng sinh enzyme, sinh acid và chọn ra được KB2 và KC2 có khả năng sinh enzymecellulose cao nhất Chủng CP7 và KB2 có khả năng sinh enzyme pectinase cao nhất.Khả năng sinh enzyme amylase và protease cao nhất lần lượt là KC1 và CP7

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP

1.1 Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ Việt

1.1.1 Giới thiệu chung

Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ (Vintell) được thành lập vào ngày24/12/2017 Địa chỉ 49/53 Phạm Văn Bạch, phường 15, quận Tân Bình, thành phố HồChí Minh Xưởng thực nghiệm: 137A Đường số 13, phường Bình Hưng Hòa, quậnBình Tân, thành phố Hồ Chí Minh

1.1.2 Cơ cấu tổ chức

Công ty có 3 phòng ban: Phòng kỹ thuật, phòng nghiên cứu và phòng hànhchính

 Phòng kỹ thuật: 4 nhân viên

 Phòng nghiên cứu: 12 nhân viên

- Phát triển công nghệ thực phẩm và công nghệ lên men

- Nâng cao đời sống nhân viên

- Hoạt động bác ái xã hội

1.1.4 Lĩnh vực hoạt động, đối tượng khách hàng

 Lĩnh vực hoạt động:

- Sản xuất trang thiết bị chế biến thực phẩm

- Nghiên cứu và chuyển giao công nghệ thực phẩm, công nghệ vi sinh vật

- Sản xuất chế phẩm vi sinh vật.và thiết bị ozone công nghiệp

- Khách hàng tiềm năng: các công ty chế biến thực phẩm khởi nghiệp.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây cà phê

2.1.1 Nguồn gốc

Trên thế giới cây cà phê chè đầu tiên mọc hoang dại ở cao nguyên Etiôpia ( châuPhi) Sau đó đưa sang A-Rập từ thế kỷ 13 – 14 Thế kỷ 17 được đưa sang Ấn Độ, năm

1658 sang Xrilanca, và từ đó sang đảo Java ( Indonexia) Sau đó người ta phát hiện ra

cà phê chè (C Aribia) khó trồng ở xứ nóng và ẩm, do đó đã bắt đầu nghiên cứu và phát hiện ra những loài cà phê khác thay thế cho cà phê như C.canephora, C.liderica

mọc hoang dại ở miền rừng núi ẩm của Châu Phi

Ở Việt Nam, cây cà phê chè (Aribica) xuất hiện ở Quảng Trị năm 1857 Đến

1870 đã thấy một số cây cà phê chè ở nhà tu thiên giáo (Hà Nam Ninh) Năm 1910,

xuất hiện những đồn cà phê vối (C robusta) và cà phê mít (C exselea) (Hoàng Minh

Trang, 1983)

Các loại cà phê đều thuộc giống coffea, gồm 70 loại khác nhau, chỉ có khoảng 10 loạiđáng chú ý về giá trị trồng trọt Trên thế giới hiện nay có 3 loại chính:

• Cà phê chè (Coffea arabica L).

• Cà phê vối (Coffea robusta).

• Cà phê mít (Coffea exselea chev).

Ngoài ra còn có các loài cà phê như cà phê Moka, cà phê Culi… Nhưng trong đó càphê vối (cà phê robusta) được trồng với số lượng lớn ở Việt Nam, mang lại giá trị cao(Hoàng Minh Trang, 1983)

2.1.2 Các giống cà phê

Trên thế giới, hiện nay có hai loài cà phê có giá trị kinh tế nhất là:

- Coffea Arabica ( cà phê chè)

- Coffea canephora hay Coffea robusta ( cà phê vối)

Ngoài ra, Coffea excels ( cà phê mít) cũng được trồng, tuy nhiên có năng suất và chất

2.1.2.1 Cà phê chè ( Coffea Arabica L)

Loài: Coffea Arabica

Cà phê arabica có nguồn gốc từ Cao Nguyên nhiệt đới Ethiopia đông Phi Châu.Arabica cao từ 3 – 7 m tùy điều kiện đất đai, khí hậu, độc thân hoặc nhiều thân, lá nhỏhình oval hoặc lưỡi mác, cành nhỏ mảnh khảnh ít phân nhánh, tán nhỏ, quả hình bầudục đôi khi hình tròn, quả chín có giống màu đỏ tươi, đường kính 10 – 15 mm, thường

có hai nhân, hiếm khi có ba nhân, cuống quả khi chín rất mềm dễ rụng, nứt khi trờimưa Thời gian nuôi quả 6 – 7 tháng, khí hậu lạnh ở miền Bắc, Arabica chín rộ vàotháng 12 -1 năm sau và muộn hơn 2 -3 tháng so với Tây Nguyên Khoảng 800 – 1200quả/kg, cứ 2,5 – 3 kg hạt cho ra 1 kg nhân, nhân có màu xám xanh, xanh lục,xanhnhạt, … Tùy theo phương thức chế biến lượng caffeine trong nhân khoảng 1 -3%.Các chủng cà phê arabica: Typica, Bourbon, Caturra, Mundo Novo, Maragogype,Pacas, Catimor (Nguyễn Thị Hiền, 2010)

2.1.2.2 Cà phê vối ( Coffea robusta)

http://giacaphe.com/17657/du-an-ca-phe-che-o-thanh-hoa-do-be-loay-Hình 2.2 : http://giacaphe.com/17657/du-an-ca-phe-che-o-thanh-hoa-do-be-loay-Hình ảnh hoa, trái cây cà phê vối

(Nguồn:

http://blogcaycanh.vn/cay_canh/d/ca-phe)

Họ: Rubiaceae

Chi: Coffea

Loài: Coffea canephora

Có nguồn gốc từ khu vực sông Conggô và miền

núi thấp xích đạo và nhiệt đới Tây Phi Châu

Robusta cao 5 – 7 m, độc thân hoặc nhiều thân,

cành khá lớn phân nhiều nhánh, tán rộng, lá

trung bình mặt lá gồ ghề Đặc biệt, hoa robusta

không bao giờ ra lại vào mùa sau tại vị trí cũ,

quả chín màu đỏ sẫm, đường kính 10 – 13 mm,

hình bầu dục hoặc tròn có hai nhân đôi khi một

nhân, vỏ quả cứng và cuống dai hơn arabica

Cứ khoảng 3 kg quả cho ra 1 kg nhân, nhân

hình bầu dụchơi tròn có màu xám xanh, xanh

bạc, vàng mỡ gà,…Tuỳ thuộc vào cách chế

biến lượng caffein có khoảng 1,5 – 3%

Giống như cà phê chè (cà phê arabica),

cây cà phê vối 3-4 tuổi có thể bắt đầu

thu hoạch Cây cho hạt trong khoảng từ 20 đến 30 năm Cà phê vối ưa sống ở vùngnhiệt đới, độ cao thích hợp để trồng cây là dưới 1000 m Nhiệt độ ưa thích của câykhoảng 24-29°C, lượng mưa khoảng trên 1000 mm Cây cà phê vối cần nhiều ánh sángmặt trời hơn so với cây cà phê chè

Hình 2.3 : Cây, quả, lá cây cà phê mít

Loài: Coffea excels

Có nguồn gốc ở xứ Ubangui Chari thuộc

Biển Hồ gần xa mạc Xahara, du nhập vào

Việt Nam năm 1905, cây lớn cao 6 – 15 m

lá to hình trứng hoặc hình lưỡi mác, gân lá

nổi lên ở mặt dưới, cành lớn tán rộng Quả

hình bầu dục, núm to và lồi, tùy điều kiện

khí hậu vùng đất quả sẽ chín sớm hơn hoặc

cùng lúc với thời điểm cây ra hoa, cà phê

mít có đặc điểm ra hoa tại vị trí cũ vào vụ

kế tiếp nên vào vụ thu hoạch (tháng 5 –

tháng 7) trên tại một đốt cành có thể có

cùng lúc quả xanh, quả chín, nụ, hoa

Đây là yếu tố bất lợi cho thu hoạch và giảm năng suất (Nguyễn Thị Hiền, 2010)

Ngoài ra còn có các loại cà phê như:

2.1.2.4 Cà phê Culi

Cà phê Culi trong tiếng Anh là peaberry và tiếng Tây Ban Nha là Caracol, là mộtdạng đột biến Trong hầu hết các trường hợp, một trái cà phê chín sẽ chứa hai hạt càphê Tuy nhiên, khi một trong những noãn của nhân không phát triển, noãn còn lạikhông bị áp lực, sẽ phát triển tạo thành một hình dạng tròn không có mặt phẳng và nóđược gọi là hạt cà phê Culi Nhân cà phê Culi tròn, sau khi qua chế biến, nhân cà phê

sẽ được chọn, tách ra khỏi các hạt cà phê dẹp bình thường và được bán như một dòng

cà phê riêng biệt

Vị đắng gắt, hàm lượng cafein cao

Cà phê Moka có mùi thơm quyến rũ, ngào ngạt, vị nhẹ, sản lượng rất thấp nên giá

thành rất cao, gấp 2 -3 lần cà phê robusta

2.1.3 Tổng quan về quả cà phê Robusta

2.1.3.1 Cấu tạo

Quả cà phê bao gồm các phần như sau: Lớp vỏ quả, lớp nhớt, lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa,nhân

Bảng 2.1: Tỉ lệ giữa các thành phần cấu tạo của quả cà phê: (tính theo % quả tươi)

Thành phần Cà phê chè (arabica) Cà phê vối (canephora)

2.1.3.2 Thành phần hóa học của quả cà phê

Phần nhiều là các chất đường (bột) chất béo, nước, acid béo thực vật, alkaloidnhư caffeine và các chất khoáng cũng như chất hương liệu

Vỏ quả: Vỏ quả khi chín có màu đỏ, là chất antoxian, trong đó có vết của alcaloid,

tanin, cafein, và các loại enzim Trong vỏ quả có từ 21,5 – 30% chất khô

Vỏ thịt: Phía dưới vỏ quả là lớp nhớt, nó gồm những tế bào mềm không có cafein,

tanin, có nhiều đường và pectin Độ pH của lớp thịt phụ thuộc vào độ chín của quả,hường từ 5,6 – 5,7, đôi khi lên đến 6,4 Trong lớp nhớt có enzim pectinase phân giảipectin trong quá trình lên men

Vỏ trấu: Vỏ trấu chứa cellulose là chủ yếu Trong vỏ trấu có một ít cafein, khoảng

0,4% do từ nhân khuếch tán ra lúc lên men hoặc lúc phơi khô Vỏ trấu dùng làm chấtđốt, dễ cháy

Nhân cà phê: Trong nhân cà phê nước chiếm 10 – 12%, protein chiếm 9 – 11%, lipit

chiếm 10 – 13%, các loại đường chiếm 5 – 10%, tinh bột chiếm 3 – 5% Ngoài ra trongnhân còn chứa các chất thơm, các alkaloid Thành phần hoá học trong nhân cà phêbiến đổi phụ thuộc vào chủng loại, độ chín, điều kiện canh tác, phương pháp chế biến

và bảo quản

Nước: Trong nhân cà phê đã sấy khô, nước còn lại 10 – 12% ở dạng liên kết Khi hàm

lượng nước cao hơn, các loại nấm mốc phát triển mạnh làm hỏng hạt Mặt khác, hàmlượng nước cao sẽ làm tăng thể tích bảo quản kho, khó khăn trong quá trình rang, tốn

Hình 2.6 : Cấu tạo giải phẩu quả cà phê

(Nguồn:http://archive.cnx.org/contents/4d35d9cb-1268-4a2b-bc6c-c654af89de5e@1.html)

nhiều nhiên liệu và nhất là làm tổn thất hương cà phê Hàm lượng nước trong cà phêsau khi rang còn 2,7%.

Chất khoáng: Hàm lượng chất khoáng trong cà phê khoảng 3 – 5%, chủ yếu là Kali,

Nitơ, Magie, Photpho, Clo Ngoài ra còn thấy nhôm, sắt, đồng, iod, lưu huỳnh…những chất này ảnh hưởng không tốt đến mùi cà phê Chất lượng cà phê cao khi hàmlượng chất khoáng càng thấp và ngược lại

Glucid: Chiếm khoảng ½ tổng số chất khô, đại bộ phận không tham gia vào thành

phần nước uống mà chỉ cho màu và vị caramen Đường có trong cà phê do trong quátrình thuỷ phân dưới tác dụng của axit hữu cơ và enzim thuỷ phân Hàm lượngsaccharose có trong cà phê phụ thuộc vào mức độ chín: Quả càng chín thì hàm lượngsaccharose càng cao Saccharose bị caramen hoá trong quá trình rang nên sẽ tạo hương

vị cho nước cà phê Hạt cà phê còn chứa nhiều polysaccarit nhưng phần lớn bị loại rangoài bã cà phê sau quá trình trích ly

Protein: Hàm lượng protein trong cà phê không cao nhưng nó đóng vai trò quan trọng

trong việc hình thành hương vị của sản phẩm Bằng phương pháp thuỷ phân, người tathấy trong thành phần protein của cà phê có những axit amin sau: cysteine, alanie,phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine… Các axit amin này ít thấy ở trạngthái tự do, chúng thường ở dạng liên kết Khi gia nhiệt, các mạch polypeptit bị phâncắt, các axít amin được giải phóng ra tác dụng với nhau hoặc tác dụng với những chấttạo mùi và vị cho cà phê rang Trong số các axit amin kể trên đáng chú ý nhất là nhữngaxít amin có chứa lưu huỳnh như cystein, methionine và proline, chúng góp phần tạonên hương đặc trưng của cà phê sau khi rang Đặc biệt, methionine và proline có tácdụng làm giảm tốc độ oxi hoá các chất thơm, làm cho cà phê rang giữ được mùi vị khibảo quản Trong quá trình chế biến chỉ có một phần protein bị phân giải thành axitamin, còn phần lớn bị biến thành hợp chất không tan

Lipid: Lipid trong cà phê gồm chủ yếu dầu và sáp Trong đó sáp chiếm 7 – 8% tổng

lượng lipid, còn dầu chiếm 90% Trong quá trình chế biến, lipid bị biến đổi, song mộtphần axit béo tham gia phản ứng dưới tác dụng của nhiệt độ cao tạo nên hương thơmcho sản phẩm, lượng lipid không bị biến đổi là dung môi tốt hoà tan các chất thơm.Khi pha cà phê thì chỉ một lượng nhỏ lipid đi vào nước còn phần lớn lưu lại trên bã

Các alcaloid: Trong cà phê có các alcaloid như cafein, trigonulin, colin Trong đó quantrọng và được nghiên cứu nhiều hơn cả là cafein và trigonellin

Cafein: Chiếm từ 1 – 3% phụ thuộc vào chủng loại, điều kiện khí hậu, điều kiện canh

tác Hàm lượng cafein thấp hơn trong chè nhưng nó kích thích hệ thần kinh với thờigian dài hơn vì khi uống cà phê tốc độ lưu thông của máu không tăng lên nên cafeinthải ra ngoài chậm, mặt khác khi pha cà phê trong nước, cafein được giải phóng hoàntoàn ở trạng thái tự do, không hình thành những chất có khả năng kết tủa hoặc nhữngchất không có hoạt tính của ancaloit

Trigonellin (acid metyl betanicotic:C 7 H 7 NO 2 ): Là ancaloid không có hoạt tính sinh lý,

ít tan trong rượu etylic, không tan trong clorofoc và ete, tan nhiều trong nước nóng,nhiệt độ nóng chảy là 218oC Tính chất đáng quý của trigonellin là dưới tác dụng củanhiệt độ cao nó bị thủy phân tạo thành acid nicotic (tiền vitamin PP) Nhiều kết quảnghiên cứu cho thấy trong cà phê nhân không có acid nicotic nhưng nó được hìnhthành trong quá trình gia nhiệt trong đó sự nhiệt phân trigonellin giữ vị trí quan trọng

Chất thơm: Trong cà phê hàm lượng chất thơm nhỏ, nó được hình thành và tích lũy

trong hạt Sự tích lũy chịu nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu và nhất là chủng loại càphê Mặt khác nó được hình thành trong quá trình chế biến, đặc biệt trong quá trìnhrang Chất thơm bao gồm nhiều cấu tử khác nhau: acid, aldehid, ceton, rượu, phnol,este Trong quá trình rang, các chất thơm thoát ra ban đầu có mùi hắc sau chuyểnthành mùi thơm Các chất thơm của cà phê dễ bị bay hơi, biến đổi và dẫn đến hiệntượng cà phê bị mất mùi thơm nên cần đựng trong bao bì kín và tiêu thụ nhanh

Với thành phần khoảng 0,1% chất hương liệu dễ bay hơi, cà phê là một loại

“lương thực” có hương liệu cao nhất Các loại hương liệu này được thành hình trongquá trình rang và không tìm thấy trong hột cà phê sống (chưa rang) Các chất mùi, vịhỗn hợp lại sẽ tạo ra mùi thơm và làm cà phê trở thành một loại có một không hai Cáchương vị của cà phê đều có trong nhiều loại thực vật khác, nếu không tính đến caffeine(Hoàng Minh Trang, 1983)

2.1.3.3 Các loại đường có trong vỏ cà phê

Bảng 2.2: Các loại đường có trong vỏ cà phê

(Pushpa S Murthy and M Madhava Naidu, 2011).

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides

Vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides thuộc vi khuẩn lactic Gram dương, không

di động, không sinh bào tử Hầu hết sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ tối ưu từ

25-30oC, pH= 4,1 Khi phân chia chúng tạo thành cặp hoặc chuỗi Những cầu khuẩn lênmen lactic dị hình ở đây được chia thành 4 nhóm theo phương pháp lai DNA-DNA

Những loài thường thấy trong lên men lactic dị hình và lên men malo lactic là: L mensenteroides subsp, L mensenteroides subsp dextranicum, L lactics, L paramesenteroides, L oenos…

 Một số đặc tính sinh hóa tiêu biểu (Theo khóa phân loại Bergey)

Khả năng sinh hơi: (+)

Catalase: (-)

Oxidase: (-)

Khử xanh methylene: (+)

Khử nitrate: (-)

Khả năng sinh indol: (-)

Voges- Proskauer (Barrett’s method): (-)

Không có khả năng sử dụng acetate, lactate, tartrate, succinate và citrate làm nguồncacbon

Chú thích: (+): dương tính (-): âm tính (Paul De Vos, George M Garrity, 2009)

 Đặc điểm hình thái:

Có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5-0,8µm và chiều dàikhoảng 1,6µm trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng1-3 µm Thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến dạng khuẩnlạc Nuôi cấy ở 20-25oC trong môi trường có sucrose hoặc đường thô có agar thì hìnhdáng hầu như không có gì thay đổi trong những nhóm khác nhau Nhưng ở 37oC các

kiểu khuẩn lạc nhỏ hơn so với bình thường Leuconostoc mesenteroides phát triển trên

môi trường rắn có hình que, trong môi trường lỏng thì lại có hình cầu Những cầukhuẩn có thể xuất hiện từng cặp, hoặc liên kết với nhau thành những chuỗi dài

Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua.

 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa:

Khả năng sinh tổng hợp của vi khuẩn L mesenteroides thuộc loại yếu phần lớn

lên men lactic dị hình theo con đường hexoso- monophosphate, chúng có nhu cầu cao

về mặt dinh dưỡng Không thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiếtchứa glucose và các muối amoni NH+4 Đa số cần hàng loạt các vitamin như axit

Hình 2.7 : vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides

high-res-stock-photography/128542138)

(Nguồn:http://www.gettyimages.com/detail/photo/leuconostoc-mesenteroides-pantothenic, biotin Để sinh trưởng bình thường, ngoài một nguồn cacbon, ni tơ,mộtphầndưới dạng các axit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chấtkhoáng…

2.3 Quá trình lên men lactic dị hình

Là quá trình lên men mà ngoài axit lactic tạo thành còn có hàng loạt các sảnphẩm khác nhau chiếm tỷ lệ khá giá cao như: axit acetic, glycerin, ethanol, CO2, Sở

dĩ như vậy vì vi khuẩn lactic dị hình không có hai enzyme cơ bản của sơ đồ EMP làaldolase và triosaphosphate isomerase

 Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+COOHCH2CH2COOH+CH3COOH+CO2+

H2

Trong đó, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit xucxinic khoảng 20%, rượu etylic

và axit acetic 10% các loại khí 20% Đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sựtích lũy một lượng ít axit formic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạothành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn

so với lên men lactic đồng hình

Trong vi khuẩn lên men lactic dị hình không có các enzyme cơ bản của sơ đồEmbden-marehoff là aldolase triozophotphatizomerase bước đầu phân giải đườngglucose ở những vi khuẩn này theo con đường pentozophotphat, tức là thông quaglucose-6photphat, 6-photphatgluconat và ribulose-5-photphat chuyển thành xilulose-5-photphat, hợp chất này tiếp tục biến đổi thành photphoglyceraldehyde vàacetylphotphat dưới tác dụng của enzim pentozophotpho xelolase Những vi khuẩn dịhình thành axit acetic kèm theo sự tổng hợp ATP Acetylphotphat được khử thànhetanol thông qua acetyldehytphotphoglyceraldehyde thông qua axit pynivic mà tạothành axit lactic (Lương Đức Phẩm, 2010)

2.4 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật

 Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hìnhthái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động,nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thànhv.v và dựa theo khoá phân loại của Bergey để xác định chủng vi khuẩn vừa phân lập

có phải thuộc họ mình cần tìm hay không

2.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

─ Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)

─ Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môitrường thạch mềm

─ Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) NhuộmCarbolic Fuchsin

─ Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp ĐỏCongo, phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)

─ Nhuộm thành tế bào

─ Nhuộm hạt dị nhiễm

─ Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)

─ Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)

─ Nhuộm vi khuẩn kháng acid

Hình 2.8 : Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình

2.4.2 Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý

─ Hình thái khuẩn lạc

─ Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt

─ Nhu cầu oxygen

2.4.3 Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa

Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa địnhdanh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa cácnguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất khángkhuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịumuối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza,xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza,fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứngM.R (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza

2.4.4 Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân

tử

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữuhiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu như các phương pháptruyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh họcphân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật

Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là:

─ Phân tích acid nucleic

─ Phân tích protein

─ Phân tích polysaccharid

─ Hóa phân loại học

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài

 Nghiên cứu trong nước

Nhằm mục đích để sản phẩm có chất lượng tốt, sản phẩm có vị thơm đậm, saukhi uống vào có vị ngọt hậu, càng để lâu càng ngon, các thành phần có trong hạt càphê được hòa tan gần như hoàn toàn khi pha chế Chính vì những lý do đó, ngày naycàng có nhiều công trình nghiên cứu về lên men cà phê Tuy có giá trị kinh tế caonhưng công nghệ này đòi hỏi thiết bị phức tạp, làm việc thiếu ổn định, đặc biệt dễ gây

ô nhiễm môi trường nên chỉ mới được áp dụng ở một số cơ sở sản xuất, chế biến quy

mô vừa có mức độ khiêm tốn, chiếm khoảng 5% tổng lượng cà phê sản xuất ở nước ta.Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê lạctươi của Hoàng Thị Hồng Ánh, ĐH Đà Nẵng

Nghiên cứu của Bộ môn công nghệ sinh học, trường ĐH Bách khoa TP.HCM, doPGS TS Nguyễn Đức Lượng làm chủ nhiệm đề tài Nhóm nghiên cứu đã chế tạo rađược một loại chế phẩm sinh học từ nấm mốc Aspergillus niger, tên thương phẩm làBiona-9 Sản phẩm này được sản xuất bằng men sinh học càng để lâu càng ngon, vệsinh an toàn thực phẩm hoàn toàn được bảo đảm Hiện nay, loại cà phê này đã đượcbán trên thị trường

 Nghiên cứu nước ngoài

Ngoài ra còn có rất nhiều nghiên cứu khác về lên men cà phê được ác nhà khoahọc ở các nước trên thế giới nghiên cứu như:

Đề tài nghiên cứu của Pushpa S Murthy và M Madhava Naidu về cải thiện chấtlượng của cà phê robusta lên men bằng enzyme từ vi sinh vật

Nghiên cứu vi sinh vật và sinh hóa trong quá trình lên men cà phê của các tác giảAvallone S, Guyot B, Brillouet JM, Olguin E, Guiraud JP

Nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm và vi khuẩn trong quá trình lên men tự nhiên

cà phê arabica của Silva CF, Batista LR, Abreu LM, Dias ES, Schwan RF.

Nghiên cứu sự hiện diện của các vi sinh vật trong cà phê của tiến sĩ giáo dụcChristine L Case

Công trình nghiên cứu vi khuẩn lactic trong cà phê và cacao lên men của R O.Arunga.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và trung tâmthí nghiệm thực hành thuộc trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm thành phố HồChí Minh

 Thời gian thực hiện

3.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ

3.2.1 Nguyên vật liệu

 Nguyên liệu:

─ Qủa cà phê thu mua từ Gia Lai, sau đó làm dập và ủ từ 36 – 48 giờ

─ 3 mẫu kim chi

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị

• Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave):

Nồi hấp tiệt trùng là một thiết bị bắt buộc phải có của một phòng thí nghiệm visinh cho phép tiêu diệt tất cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật Nồi hấptiệt trùng có cấu tạo 2 vỏ và có khả năng giữ áp suất cao Phía trong của nồi làbuồng khử trùng, nơi đặt các vật liệu cần khử trùng Buồng khử trùng có lắp vanthoát không khí, áp kế để xác định áp suất và van bảo hiểm để xì hơi khi áp suấtvượt quá mức yêu cầu và đảm bảo an toàn Khoảng trống giữa hai lớp vỏ là nơichứa hơi nước Nước cần được bổ sung đến mức quy định Tùy vào từng mục đíchhấp khử trùng mà ta điều chỉnh nhiệt độ và thời gian thích hợp

• Tủ sấy dụng cụ: